Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

High Throughput In Vitro beoordeling van latentie omkering van agenten op HIV transcriptie, egaliseren en lamineren

5.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58753

⸱

22 januari 2019

 , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Melbourne

In dit artikel

Samenvatting

Een hoge doorvoersnelheid protocol voor functionele beoordeling van efficiënte reactivering van HIV en de ontmijning van latente proviruses is beschreven en toegepast door het testen van het effect van interventies op HIV transcriptie, egaliseren en lamineren. Representatieve resultaten van het effect van latentie omkering van agenten op LTR-gedreven transcriptie, egaliseren en lamineren zijn verstrekt.

Samenvatting

HIV blijft ongeneeslijke als gevolg van het bestaan van een reservoir van cellen die havens stabiel en latente vorm van het virus, dat blijft onzichtbaar voor het immuunsysteem en is niet gericht door de huidige antiretrovirale therapie (cART). Transcriptie, egaliseren en lamineren is aangetoond dat de versterking van de latentie van de HIV-1 bij rust CD4 + T cellen. Omkering van latentie door het gebruik van latency omkering agenten (lokale en regionale overheden) bij de aanpak van "schok en kill" uitvoerig is onderzocht in een poging om te zuiveren van dit reservoir maar heeft tot nu toe niet aangetoond met enig succes in klinische proeven als gevolg van het gebrek aan ontwikkeling van voldoende kleine moleculen die efficiënt dit reservoir kunnen erover. Het hier gepresenteerde protocol biedt een methode voor betrouwbaar en efficiënt beoordeling van latency omkering agenten (lokale en regionale overheden) op HIV transcriptie, egaliseren en lamineren. Deze aanpak is gebaseerd op het gebruik van een LTR-gedreven dual kleur verslaggever die het effect van een LRA op transcriptie, egaliseren en lamineren gelijktijdig kunt meten van stroom cytometry. Het protocol hier beschreven is geschikt voor zowel Adherente cellen als de cellen in suspensie. Het is handig voor het testen van een groot aantal drugs in een hoge doorvoer systeem. De methode is technisch eenvoudig te implementeren en rendabel. Bovendien is het gebruik van stroom cytometry zodat kan worden nagegaan van de levensvatbaarheid van de cellen en dus drug toxiciteit op hetzelfde moment.

Inleiding

Ondanks op lange termijn effectieve antiretrovirale therapie aanhoudt HIV in een latente staat als een geïntegreerde provirus in geheugen CD4 + T cellen1. De structuur van de chromatine van de HIV-1-5' lang terminal herhalen (LTR) promotor en epigenetische aanpassingen zoals Histon methylation en deacetylation door DNA methyltransferases (DNMT) en Histon deacetylases (HDAC) zijn belangrijke mechanismen die leiden tot transcriptionele repressie en dus na integratie latency2,3. Een grote verscheidenheid van latency achteruitrijlicht agenten (lokale en regionale overheden) heeft onderzocht voor hun doeltreffendheid voor het opwekken van de virus productie in vitro en in vivo van latent geïnfecteerde rust CD4 + T cellen4,5,6,7 ,8. Onder de lokale en regionale overheden getest, HDACi (HDAC-remmers) en BET bromodomain remmers (BETis) veroorzaken chromatine-decondensation en de introductie van de positieve transcriptie rek factor b (P-TEFb) respectievelijk, wat leidt tot latere verlichten van de transcriptionele onderdrukking op de 5' LTR en activering van HIV expressie9,10,11,12,13. De omvang van reactivering bereikt door deze lokale en regionale overheden werd echter beperkt omdat slechts een bescheiden toename van cel-geassocieerde unspliced HIV mRNA (ons RNA), indicatieve van virale transcriptie, ex vivo14,15werd waargenomen. Belangrijk is dat deze lokale en regionale overheden ook niet voor het opwekken van een vermindering van de frequentie van latent geïnfecteerde cellen.

HIV expressie kan verder worden beperkt door inefficiënte splicing16 , alsmede gebreken in nucleaire export van vermenigvuldigen afgesplitste HIV RNA (MS RNA)17. Aldus, identificerende nieuwe klassen van lokale en regionale overheden die krachtiger en kunnen invloed hebben op verschillende aspecten van de virus productie na integratie nodig zijn. Daarnaast is de ontwikkeling van nieuwe tests die helpen met het bepalen van de optimale verbindingen om om te keren efficiënt latency is vereist.

Hier, wordt een protocol gepresenteerd, die gebruik maakt van een benadering van de hoge gegevensdoorvoer voor functionele beoordeling van het effect van interventies op HIV LTR-gedreven transcriptie, egaliseren en lamineren. Kortom, een nieuwe LTR-gedreven dual color verslaggever systeem pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (Figuur 1) wordt gebruikt om te beoordelen van HIV reactivering stroom cytometry. In deze TL verslaggever leidt de uitdrukking van mRNA van unspliced HIV (4 kb) tot verbeterde groen fluorescent proteïne (EGFP) expressie, terwijl de expressie van afgesplitste mRNA (2 kb) tot de fluorescerende eiwituitdrukking Discosoma sp. rood (DsRed leiden zou). Kort, gebruikten we een fluorescerende Env-EGFP fusieproteïne, gp140unc. EGFP, waar de codering opeenvolging van EGFP werd geplaatst in frame met een VN-gekloofd en afgekapte vorm van de envelop (Env). Wijzigingen aangebracht aan de breukzijde voorkomen de dissociatie van Env in gp120 en gp41-EGFP lasertherapie en afkappen van het eiwit gp160 voorafgaand aan de transmembrane domein maakt een oplosbare Env analoog, dat de juiste vouwen vergemakkelijkt en expressie van EGFP. Op de expressie in een cel, Rev lokaliseert aan de kern waar het bemiddelt de nucleaire-cytoplasmatische export van de 4 kb env mRNA via de interactie met het rev responsief element (RRE). Het afkappen van Env doet geen afbreuk aan de RRE, die tussen gp120 gp41 en de A7 3' splice site ligt. In dit systeem, splicing bij HIV-1 splice donor 4 (SD4) en splice acceptor 7 (SA7) resulteert in de productie van een 2 kb mRNA codering van een niet-functionele Rev eiwit afgebroken op aminozuur 38 gesmolten aan DsRed TL proteïne, RevΔ38-DsRed. Kort, DsRed werd ingevoegd in de 2nd exon van Rev op aminozuur 38 overlapping extensie18. Om te vergemakkelijken de nucleaire export van unspliced mRNA, was mede een vector van de zoogdieren expressie codering Rev (pCMV-RevNL4.3) transfected met de fluorescerende verslaggever construct (Figuur 2). Deze unieke verslaggever constructie hier beschreven is nuttig in high-throughput beoordeling van HIV transcriptie, egaliseren en lamineren, zonder de noodzaak om het gebruik van virale vectoren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Opmerking: Procedures voor het klonen, transformatie en sequencing zijn elders besproken18,19. Hierin de protocollen beginnen van de transfectie van de zoogdieren expressievectoren (Figuur 3).

1. de transfectie van HEK293T cellen met Dual Color verslaggever bouwen

  1. Cultiveren van HEK293T cellen in Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM), aangevuld met 10% (v/v) foetale runderserum (FBS), penicilline (100 U/mL) en streptomycine (100 μg/mL) in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C. Na het ontdooien, passage HEK293T cellen 2 - 3 keer voordat u ze gebruikt in Transfectie experimenten. Hierdoor zou de cellen-tijd om te herstellen van de dooiende procedure.
    Let op: Mycoplasma verontreiniging van celculturen blijft een ernstig probleem. Goede laboratoriumpraktijken en routinetests van celculturen zijn essentieel voor het risico van mycoplasma verontreiniging verminderen en voorkomen van verspreiding20.
  2. 1:2 één dag vóór het zaaien van de cellen splitsen en ze vervolgens overbrengen naar verse DMEM medium. Cultiveren van de cellen gedurende 24 uur in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C.
  3. De dag voor transfectie, verwijder het medium van de kolf door aspiratie en wassen van de cellen met Dulbecco van fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) oplossing gratis calcium (Ca2 +) en magnesium (Mg2 +) om de sporen van het serum te verwijderen.
  4. Afzien van 5 mL trypsine-EDTA-oplossing (0,05% - 10 mM in PBS) in het schip van de cultuur en plaats deze bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator voor 2 tot en met 5 min.
  5. Wanneer de cellen zijn vrijstaand, voeg 5 mL van DMEM aangevuld met 10% (v/v) FBS aan de trypsine-activiteit die de cellen beschadigen kan verder te remmen.
  6. Resuspendeer zachtjes door pipetteren de celsuspensie omhoog en omlaag te breken van de bosjes.
  7. De cellen 1:10 verdunnen in trypan blauwe vlek (0,4%).
  8. Tellen de levende cellen die doen niet innemen trypan blauw met behulp van een microscoop (10 x doelstelling) en een haemocytometer.
  9. Het aantal levensvatbare cellen per milliliter te berekenen door het nemen van het gemiddelde van het aantal cellen en vermenigvuldiging met 10.000 en door de verdunningsfactor (1:10) van de trypan blauwe vlekken.
  10. Plaat met 2 x 104 cellen in 100 μl van DMEM medium aangevuld met 10% FBS zonder antibiotica in een 96-Wells flat-bodemplaat gedurende 24 uur.
  11. Voor elk putje, Verdun 400 ng van pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed, 20 ng van pCMV-RevNL4.3 en 100 ng van pCMV-Tat101AD8-vlag DNA in 50 μl van serum gratis medium. Meng voorzichtig. Voor experimenten zonder Tat, gebruikt u een overeenkomende lege Tat vector pcDNA3.1 (-).
    Opmerking: Het gebruik van endotoxinen-gratis DNA wordt sterk aanbevolen. Daarvoor, bereiden endotoxine-gratis DNA met behulp van een midi- of maxiprep nucleïnezuur zuivering kit. Bepalen de zuiverheid van DNA door het meten van de 260/280 OD ratio, die tussen de 1,7 en 1,9 moet.
  12. Meng het lipide-reagens zachtjes vóór gebruik, vervolgens verdund 0,65 μL in 50 μl van serum gratis medium. Meng voorzichtig en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  13. De verdunde DNA te combineren met de verdunde lipide-reagens.
  14. Meng voorzichtig en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. De oplossing lijkt bewolkt.
    Opmerking: Ga verder met stap 1.15. binnen 30 min.
  15. Breng 100 μl per putje van de lipide reagens-DNA complexen drop-wise boven aan de cellen.
  16. Meng voorzichtig door de plaat heen en weer schommelen.
  17. Incubeer de plaat voor 5 h in een 5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C.
    1. Elke reactie mix is voldoende voor een transfectie één goed (96-Wells). Pas het bedrag en hoeveelheid componenten volgens het aantal drug en combinatie die zou worden getest en rekeningen voor pipetting variaties. Alle voorwaarden zijn meestal getest in triplicates.
    2. Extra putjes met 100 transfect ng van CMV-gedreven EGFP en DsRed-Express DNA plasmide ter compensatie.

2. behandeling van Transfected HEK293T cellen met latentie omkering van agenten

Opmerking: Voorafgaand aan elke assay, de fysiologische toestand van elke LRA te bepalen door het meten van de levensvatbaarheid van de cellen na blootstelling aan hoge en lage dosis van het geneesmiddel met cel proliferatie test.

  1. Verdun elk LRA om de juiste concentratie van het werken met groeimedium (b.v., 1 μM voor JQ1(+)).
    Let op: Reconstrueren de gelyofiliseerd drugs met de geschikt oplosmiddel tot een concentratie van 10 mM. Winkel al het materieel lokale en regionale overheden bij-80 ° C in één aliquot (elk 5 μl) gebruiken om te vermijden herhaalde cycli bevriezen-ontdooien.
  2. Zorgvuldig gecombineerd transfectie medium met een multichannel en vervangen met 100 μl medium dat passende LRA (tabel 1). Toevoegen van middellange zeer voorzichtig langs de muur van de waterput om te voorkomen dat het loskoppelen van de transfected cellen van de HEK293T, waarvan bekend is dat het eenvoudig loskoppelen van het oppervlak van de plaat cultuur.
  3. Incubeer de plaat gedurende 48 uur in een 5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C.

3. kleuring van Transfected cellen met corrigeerbare levensvatbaarheid kleurstof Stroom Cytometry p.a.

Let op: Het verwijderen van dode cellen en puin is essentieel om valse positieven te elimineren en te verkrijgen van de resultaten van de hoogste kwaliteit.

  1. Loskoppelen van de cellen in de media met behulp van 100 μl-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) per putje en door zachtjes pipetteren en neergaande (~ 5 keer) met een meerkanaals, terwijl het vermijden van schuimen van de media. Indien nodig, loskoppelen van de cellen van de plaat met behulp van 35 µL per putje trypsine-EDTA-oplossing (0,05% - 10 mM in PBS) en 5 minuten bij 37 ° C, het broeden voordat neutraliseren met medium dat serum.
  2. De cellen overbrengen in een 96-Wells-V-bodemplaat.
  3. Draai de cellen gedurende 5 minuten bij 500 x g bij 4 ° C, dan zorgvuldig de middellange/PBS gecombineerd zonder het aanraken van de cellen.
  4. Wassen van de cellen ten minste 1 keer met 200 μL van eiwit/serum gratis PBS.
  5. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C, dan Verwijder het supernatant door het kantelen van de plaat en het verwijderen van de was-buffer zonder het aanraken van de cellen.
  6. Een werkoplossing van corrigeerbare levensvatbaarheid kleurstof bereid door verdunning van de levensvatbaarheid kleurstof 1:1000 in eiwit/serum gratis PBS. De verdunde vlek per putje 50 µL voor te bereiden.
    Opmerking: Levensvatbaarheid kleurstoffen zijn verkrijgbaar in een waaier van kleuren geschikt voor gebruik met blauw, rood en violet lasers. Bereid een stamoplossing van corrigeerbare levensvatbaarheid kleurstof door de resuspending van één ampul van het gelyofiliseerd kleurstof (component A) met 50 μl watervrij DMSO (onderdeel B). Opslag bij-20 ° C in een éénpersoons gebruik aliquoot (1 μL elk), beschermd tegen het licht.
  7. Voeg 50 μl van de verdunde levensvatbaarheid kleurstof aan elk putje en meng de cellen door pipetteren op en neer met een multichannel.
  8. Vlek voor 10-15 min bij 4 ° C, beschermd tegen het licht.
  9. 1 - 2 keer wassen met 150 μl van was buffer (PBS met 1% boviene serum albumine en 2 mM EDTA).
  10. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
  11. Het herstellen van de cellen met de 100 μl van vers bereide 1% formaldehyde in was buffer voor 10-15 min bij 4 ° C in het donker.
    Let op: Formaldehyde is zeer giftig. Bereiden 1% formaldehyde-oplossing in een zuurkast te voorkomen van inademing terwijl het dragen van handschoenen en veiligheidsbril voor bescherming.
  12. Wassen van de cellen 1 - 2 keer met 100 μl van was buffer.
  13. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
  14. Resuspendeer de pellet cel in 70 μL van was buffer.
    Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Vaste cellen, kon de volgende dag op de stroom cytometer bij 4 ° C in het donker voor analyse worden opgeslagen.

4. EGFP en DsRed metingen door Stroom Cytometry en Data-analyse

Opmerking: Analyseren HIV transcriptie (% EGFP) en DsRed splicing (%) op een cytometer van de stroom. Filteren van het monster vóór de vlucht met een 70 μm cel-zeef of 100 μm nylon gaas om te voorkomen dat verstopt raakt het mondstuk.

  1. Opstarten van de cytometer en de computer ten minste 10 minuten vóór gebruik om lasers opwarmen.
  2. Voorafgaand aan de voorbeelden uitvoeren en data-acquisitie te beginnen, de schede tank vullen met zoutoplossing 0,9% en ervoor zorgen dat een tablet natriumhypochloriet is toegevoegd aan de afval tank.
  3. Controleer de stroom cel voor luchtbellen.
  4. Controleer of de detectoren en filters geschikt voor het experiment zijn.
    Opmerking: Voor EGFP, gebruik van de blauwe laser (488 nm) en 530/30 bandpass, terwijl DsRed Express optimaal wordt gedetecteerd met behulp van de gele laser (561 nm) en 610/20 bandpass. Een blauwe laser (488 nm) en 610/20 bandpass kan ook worden gebruikt om op te sporen van DsRed expressie.
  5. De prestaties van de cytometer en de gevoeligheid in detectoren controleren door kalibratie kralen uit te voeren.
  6. Aanpassen van de forward (FSC-A) en zijde (WS-A) scatter spanningen met onbevlekt monster zodat de grootste bevolking op het scherm is en duidelijk waarneembaar.
    Opmerking: FSC (Forward-strooilicht) is een meting van licht diffractie in een platte hoek, die afhangt van het volume van de cel (cel-oppervlakte of grootte), terwijl de wetenschappelijke stuurgroep (kant-verstrooid licht) is een meting van lichte diffractie in een rechte hoek, die evenredig is met granulariteit van de cel en interne complexiteit.
  7. Uitvoeren van handmatige of automatische compensatie met behulp van de single gebeitste monsters zorgen voor minimale spill-over van EGFP + bevolking in de DsRed detector en vice-versa.
    Let op: Gebruik een steekproef van de cellen, uiting geven aan elk van de enkele kleur TL proteïne evenals cellen afzonderlijk gekleurd met de kleurstof corrigeerbare levensvatbaarheid ter compensatie. Gebruik geen FITC en PE compensatie kralen voor EGFP en DsRed fluorescerende eiwitten compensaties door verschillende spectrale eigenschappen. Compensatie besturingselementen moet helder genoeg om op te lossen van positieve en negatieve bevolking.
  8. Maakt van de percelen en stelt de poorten met behulp van fluorescentie minus één (FMO) controles.
  9. Verwerven en minimaal 10.000 levensvatbare cellen evenementen per monster opnemen. Voorbeelden uitvoeren op medium of lage snelheid om te voorkomen dat paren passeren door het snijpunt van de laser. Gebruik pulse geometrie gating zoals WS-A versus SSC-H te elimineren paren. Controleer de stabiliteit van de run door het uitzetten van tijd versus SSC-A om te zien hoe zelfs de stroom is tijdens de run.
  10. Aan het einde van de termijn, de stroom cytometry fluidics met geconcentreerde reinigingsmiddelen schoon dan water voor elke 5 min.
  11. Afsluiten van het systeem, verwijderen de afvalstoffen en opnieuw vullen de tank van de schede na de overname.
  12. Het analyseren van de gegevens met behulp van een stroom cytometry data-analysesoftware. Cel puin en klomp (paren) op basis van de voorwaartse en zijdelingse scatter uitsluiten en elimineren van de dode cellen met behulp van de levensvatbaarheid kleurstof vlek (negatieve bevolking = levende cellen). Identificeren van de cellen, uiting van EGFP en DsRed (Figuur 4), alsmede het percentage van afgesplitste product DsRed /(DsRed + EGFP) (Figuur 5).
  13. Vaststellen van het effect van de LRA op HIV transcriptie, egaliseren en lamineren door het vergelijken van onbehandelde cellen en de cellen die blootgesteld aan individu of een combinatie van lokale en regionale overheden (Figuur 5).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Representatieve resultaten worden weergegeven in Figuur 5 voor de expressie van HIV-1 unspliced (EGFP) en verbinding aan de randen (DsRed) producten na behandeling met bromodomain-remmer JQ1. Zowel JQ1(+) als Tat aanzienlijk verhoogd het percentage cellen uiten van EGFP (2.18 en 4.13 FC over DMSO respectievelijk; n = 3) indicatieve van unspliced afschriften. Bovendien JQ1(+) aanzienlijk verhoogd het percentage cellen uiten van DsRed (46.6 FC over DMSO) evenal...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Gezien de moeilijkheid in het meten van virus reactivering ex vivo, een breed scala van in vitro modellen werden ontwikkeld in de tijd om te bestuderen van HIV latentie met inbegrip van latent geïnfecteerd T-cellijnen (J-Lats, ACH2, U1), primaire modellen van latente infectie van de rust) O'Doherty, Lewin, Greene en Spina modellen) of pre-geactiveerde CD4 + T cellen (Sahu, Marini, Planelles, Siliciano, Karn modellen) met één ronde of replicatie bevoegde verslaggever virussen22. Om het model van de...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door projectsubsidie APP1129320 en program grant, APP1052979 van de NHMRC van Australië. Wij danken Dr. Adam Wheatley, Dr. Marina Alexander, Dr. Jenny L. Anderson en Michelle Y. Lee voor het verstrekken van essentiële constructies en advies voor de succesvolle voltooiing van dit werk. Wij danken het personeel van de DMI Flow faciliteit voor hun advies en genereuze bijstand bij het handhaven van de cytometer van de stroom gebruikt in deze studie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Celcultuur
HEK293T cellen (Human Embryonic Kidney cellen)ATCCCRL-3216Repliceert vectoren die het SV40 replicatiegebied dragen.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I)Gibco10569-010+ 4,5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Natrium Pyruvaat
Foetaal runderserumGibco10099-141Herkomst Australië
Penicilline-StreptomycineSigmaP4458
Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS), zonder calcium, zonder magnesiumGibco14190-136
Trypanblauw Kleurmiddel, 0,4%Gibco15250
Trypsine-EDTA (0,05%), fenol roodGibco25300054
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019Lipide transfectiereagens
Opti-MEM I (1x) medium met verminderd serumGibco31985-070Serumvrij medium
NucleoBond Xtra MaxiMarcherey-Nagel740414.50
pEGFP-N1 plasmidClontech (TaKaRa)6085-1Expressie van EGFP in zoogdiercellen, CMVIE promotor.
pDsRed-Express-N1Clontech (TaKaRa)632429Expressie van DsRed-Express in zoogdiercellen, CMVIE promotor.
pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRedAddgene115775
pCMV-RevNL4.3Addgene115776
pCMV-Tat101AD8-FlagAddgene115777
Dimethylsulfoxide (DMSO)Millipore67-68-5
JQ1(+)Cayman Chemical11187Voorraad bij 10 mM in DMSO; werkconcentratie 1 μM
JQ1(-)Cayman Chemical11232Voorraad bij 10 mM in DMSO; werkconcentratie 1 μM
Phorbol Myristaat Acetaat (PMA)Sigma-Aldrich16561-29-8Voorraad bij 100 μg/mL in DMSO; werkconcentratie 10 nM
Phytohemagglutinine (PHA)RemelHA15/R30852701Voorraad bij 1 μg/ μL in PBS; werkconcentratie 10 μg/mL
Vorinostat (VOR)Cayman Chemical10009929Voorraad bij 10 mM in DMSO; werkconcentratie 0,5 μM
Panobinostat (PAN)TRCP180500Voorraad bij 10 mM in DMSO; werkconcentratie 30 nM
CellTiter 96 AQueous One Solution Celproliferatie AssayPromega63581
Venor GeM ClassicMinerva Biolabs11-1100Mycoplasma Detectie Kit, PCR-gebaseerd
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagentia voor stromocytometrie
LSR FortessaBD BiosciencesFlow cytometer (4 lasers-blauw, rood, violet en geel)
LSR IIBD BiosciencesFlow cytometer (3 lasers-blauw, rood en violet)
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain KitLife TechnologiesL34976Viabiliteitskleurstof: voor 633 of 635 nm excitatie, 400 assays. Component A en B worden beide in de kit geleverd.
Bovine Serum AlbumineSigmaA2153
EDTA 0,5M pH8Gibco15575-038
Formaldehyde Oplossing 37/10 (37%)Chem-SupplyFA010
BD FACS Diva CS&T Research BeadsBD Biosciences655050Calibratiekleurballen
Sphero Rainbow Calibratie Deeltjes (8 pieken)BD Biosciences5591233,0 - 3,4 mm
OmhullingsoplossingChem-SupplySA04690 g NaCl in 10 L water
HAZ-TabsGuest MedicalH8801Chloor vrijgevende tabletten voor desinfectie
Decon 90Decon Laboratories LimitedN/AGeconcentreerde reinigingsmiddelen voor flow cytometer. Werkoplossing Decon 90 5%.
Natriumhypochloriet (12-13% Oplossing)LabcoSODHYPO-5LGeconcentreerde reinigingsmiddelen voor flow cytometer. Werkoplossing bleekmiddel 1%.
7xMPBioIM76670Geconcentreerde reinigingsmiddelen voor flow cytometer. Werkoplossing 7x 1%.
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Materialen
Weefselcultuurkolven (75 cm2, schuin hals, geventileerde dop)Corning430641U
Weefselcultuur platen (96 wel plat bodem met deksel)Costar3599
Weefselcultuur platen (96 wel V-bodem zonder deksel)Costar3896
Centrifugebuizen (10 mL)SARSTEDT62.9924.284100x16 mm
Centrifugebuizen (50 mL)CellStar22726130x115 mm
Microcentrifugebuizen (1,5 mL)Corning AxygenMCT-150-C

Referenties

  1. Siliciano, J. D., et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells. Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).
  2. Khoury, G., et al. Ch. 8. HIV vaccine and cure - The Path Towards Finding an Effective Cure and Vaccine. 1075, Springer Nature. Adv Exp Med Biol (2018).
  3. Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67(2013).
  4. Archin, N. M., et al. HIV-1 Expression Within Resting CD4+ T Cells After Multiple Doses of Vorinostat. Journal of Infectious Diseases. 210, 728-735 (2014).
  5. Elliott, J. H., et al. Activation of HIV Transcription with Short-Course Vorinostat in HIV-Infected Patients on Suppressive Antiretroviral Therapy. PLoS Pathogens. 10, (2014).
  6. Leth, S., et al. Combined effect of Vacc-4x, recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor vaccination, and romidepsin on the HIV-1 reservoir (REDUC): a single-arm, phase 1B/2A trial. The Lancet HIV. 3, e463-e472 (2016).
  7. Rasmussen, T. A., et al. Panobinostat, a histone deacetylase inhibitor, for latent-virus reactivation in HIV-infected patients on suppressive antiretroviral therapy: a phase 1/2, single group, clinical trial. The Lancet HIV. 1, e13-e21 (2014).
  8. Søgaard, O. S., et al. The Depsipeptide Romidepsin Reverses HIV-1 Latency In Vivo. PLoS Pathogens. 11, (2015).
  9. Bartholomeeusen, K., Xiang, Y., Fujinaga, K., Peterlin, B. M. Bromodomain and extra-terminal (BET) bromodomain inhibition activate transcription via transient release of Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb) from 7SK small nuclear ribonucleoprotein. Journal of Biological Chemistry. 287, 36609-36616 (2012).
  10. Boehm, D., et al. BET bromodomain-targeting compounds reactivate HIV from latency via a Tat-independent mechanism. Cell Cycle. 12, 452-462 (2013).
  11. Contreras, X., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid reactivates HIV from latently infected cells. Journal of Biological Chemistry. 284 (11), 6782-6789 (2009).
  12. Rasmussen, T. A., et al. Comparison of HDAC inhibitors in clinical development: effect on HIV production in latently infected cells and T-cell activation. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (5), 993-1001 (2013).
  13. Wei, D. G., et al. Histone deacetylase inhibitor romidepsin induces HIV expression in CD4 T cells from patients on suppressive antiretroviral therapy at concentrations achieved by clinical dosing. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004071(2014).
  14. Blazkova, J., et al. Effect of histone deacetylase inhibitors on HIV production in latently infected, resting CD4(+) T cells from infected individuals receiving effective antiretroviral therapy. Journal of Infectious Diseases. 206 (5), 765-769 (2012).
  15. Bullen, C. K., Laird, G. M., Durand, C. M., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. New ex vivo approaches distinguish effective and ineffective single agents for reversing HIV-1 latency in vivo. Nature Medicine. 20 (4), 425-429 (2014).
  16. Yukl, S. A., et al. HIV latency in isolated patient CD4+T cells may be due to blocks in HIV transcriptional elongation, completion, and splicing. Science Translational Medicine. 10, (2018).
  17. Lassen, K. G., Ramyar, K. X., Bailey, J. R., Zhou, Y., Siliciano, R. F. Nuclear retention of multiply spliced HIV-1 RNA in resting CD4+T cells. PLoS Pathogens. 2, 0650-0661 (2006).
  18. Alexander, M. R., Wheatley, A. K., Center, R. J., Purcell, D. F. J. Efficient transcription through an intron requires the binding of an Sm-type U1 snRNP with intact stem loop II to the splice donor. Nucleic Acids Research. 38, 3041-3053 (2010).
  19. Anderson, J. L., Johnson, A. T., Howard, J. L., Purcell, D. F. J. Both Linear and Discontinuous Ribosome Scanning Are Used for Translation Initiation from Bicistronic Human Immunodeficiency Virus Type 1 env mRNAs. Journal of Virology. 81, 4664-4676 (2007).
  20. Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of Mycoplasma contamination in cell culture. Cell J. 13 (4), 203-212 (2012).
  21. Khoury, G., et al. HIV latency reversing agents act through Tat post translational modifications. Retrovirology. 15 (1), 36(2018).
  22. Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
  23. Dahabieh, M. S., et al. Direct non-productive HIV-1 infection in a T-cell line is driven by cellular activation state and NFkappaB. Retrovirology. 11, 17(2014).
  24. Calvanese, V., Chavez, L., Laurent, T., Ding, S., Verdin, E. Dual-color HIV reporters trace a population of latently infected cells and enable their purification. Virology. 446 (1-2), 283-292 (2013).
  25. Chavez, L., Calvanese, V., Verdin, E. HIV Latency Is Established Directly and Early in Both Resting and Activated Primary CD4 T Cells. PLoS Pathogens. 11 (6), e1004955(2015).
  26. Hunninghake, G. W., Monick, M. M., Liu, B., Stinski, M. F. The promoter-regulatory region of the major immediate-early gene of human cytomegalovirus responds to T-lymphocyte stimulation and contains functional cyclic AMP-response elements. Journal of Virology. 63 (7), 3026-3033 (1989).
  27. Reeves, M., Sinclair, J. Aspects of human cytomegalovirus latency and reactivation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 325, 297-313 (2008).
  28. Sambucetti, L. C., Cherrington, J. M., Wilkinson, G. W., Mocarski, E. S. NF-kappa B activation of the cytomegalovirus enhancer is mediated by a viral transactivator and by T cell stimulation. EMBO Journal. 8 (13), 4251-4258 (1989).
  29. Kula, A., et al. Characterization of the HIV-1 RNA associated proteome identifies Matrin 3 as a nuclear cofactor of Rev function. Retrovirology. 8, 60(2011).
  30. Kula, A., Marcello, A. Dynamic Post-Transcriptional Regulation of HIV-1 Gene Expression. Biology (Basel). 1 (2), 116-133 (2012).
  31. Yedavalli, V. S., Jeang, K. T. Rev-ing up post-transcriptional HIV-1 RNA expression. RNA Biology. 8 (2), 195-199 (2011).
  32. Zolotukhin, A. S., et al. PSF acts through the human immunodeficiency virus type 1 mRNA instability elements to regulate virus expression. Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6618-6630 (2003).
  33. Laird, G. M., Rosenbloom, D. I., Lai, J., Siliciano, R. F., Siliciano, J. D. Measuring the Frequency of Latent HIV-1 in Resting CD4(+) T Cells Using a Limiting Dilution Coculture Assay. Methods in Molecular Biology. 1354, 239-253 (2016).
  34. Cary, D. C., Peterlin, B. M. Targeting the latent reservoir to achieve functional HIV cure. F1000Res. 5, (2016).
  35. Han, Y., et al. Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes. Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).
  36. Laird, G. M., et al. Ex vivo analysis identifies effective HIV-1 latency - reversing drug combinations. Journal of Clinical Investigation. 125, 1901-1912 (2015).
  37. Lenasi, T., Contreras, X., Peterlin, B. M. Transcriptional interference antagonizes proviral gene expression to promote HIV latency. Cell Host Microbe. 4 (2), 123-133 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

HIV splicingflowcytometrietweekleurige reporterLTR gestuurde reporterhigh throughputscreeningcelviabiliteitsassaybeoordeling van drugstoxiciteitHIV latentie
High Throughput In Vitro beoordeling van latentie omkering van agenten op HIV transcriptie, egaliseren en lamineren
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.