Methodenartikel

Visualiseren van hechting vorming in cellen door middel van geavanceerde draaiende schijf-totale interne reflectie fluorescentie microscopie

DOI:

10.3791/58756

⸱

21 januari 2019

 , 
1UKE Microscopy Imaging Facility, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een geavanceerde Microscoop waarmee snel en met hoge resolutie zal imaging van zowel de geïsoleerde plasmamembraan en de omliggende intracellulaire volume, worden gepresenteerd. De integratie van de draaiende schijf en de totale interne reflectie fluorescentie microscopie in één installatie kunt levende imaging experimenten bij hoge acquisitie tarieven tot 3.5 s per afbeeldingsstapel.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In levende cellen betrokken processen zoals hechting vorming uitgebreide structurele veranderingen in het plasma-membraan en het interieur van de cel. Om te visualiseren deze hoogdynamische gebeurtenissen, twee complementaire lichte microscopie technieken waarmee snelle beeldvorming van live monsters werden gecombineerd: draaiende schijf microscopie (SD) voor snelle en hoge resolutie opname en totale interne reflectie de microscopie van de fluorescentie (TIRF) voor precieze lokalisatie en visualisatie van het plasma-membraan. Een uitgebreide en volledige imaging protocol wordt getoond voor begeleiden door bereiding van de monsters, Microscoop kalibratie, beeldvorming en overname, wat resulteert in meerdere kleuren SD-TIRF levende imaging serie met hoge spatio-temporele resolutie. Alle nodige afbeelding nabewerking stappen voor het genereren van de multi-dimensionale levende imaging datasets, d.w.z. de registratie en de combinatie van de afzonderlijke kanalen, vindt u in een zelfgeschreven macro voor de open sourcesoftware ImageJ. De beeldvorming van fluorescente proteïnen tijdens initiatie en rijping van hechting complexen, alsmede de vorming van het cytoskeletal netwerk van actine, werd gebruikt als een bewijs van beginsel voor deze nieuwe aanpak. De combinatie van hoge resolutie 3D microscopie en TIRF verstrekt een gedetailleerde beschrijving van deze complexe processen binnen de cellulaire omgeving en, tegelijkertijd, precieze lokalisatie van de membraan-geassocieerde moleculen met een hoog ontdekt verhouding signaal-naar-achtergrond.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onze dagen, de lichte microscopie technieken bieden hoge/super resolutie beeldvorming in vaste en levende specimen evolueren snel. Super resolutie technieken zoals gestimuleerd emissie uitputting (STED), gestructureerd verlichting microscopie (SIM) en foto-activering lokalisatie microscopie (PALM) of directe stochastische optische wederopbouw microscopie (STORM), respectievelijk, zijn verkrijgbare en inschakelen van de beeldvorming van subcellular structuren details weergeven bijna op de moleculaire schaal1,2,3,4,5,6. Deze benaderingen nog steeds hebben echter slechts beperkt toepasbaarheid voor levende imaging experimenten waarbij grote hoeveelheden moeten worden gevisualiseerd met meerdere beelden per tweede overname snelheid. Soorten hoogdynamische processen geregeld via het plasma-membraan, bijvoorbeeld endo- / exocytose, hechting, migratie of signalering, optreden met hoge snelheid binnen grote cellulaire volumes. Onlangs, was een geïntegreerde microscopie techniek om te vullen deze kloof, voorgestelde genaamd draaiende schijf-TIRF (SD-TIRF)7. In detail vliegvergunningen TIRF microscopie specifiek isoleren en lokaliseren van het plasmamembraan8,9, terwijl SD microscopie een van de meest gevoelige en snel is leven beeldvormingstechnieken voor de visualisatie en tracking van subcellular organellen in het cytoplasma10,11. De combinatie van beide beeldvormingstechnieken in een enkele setup is al gerealiseerd in de afgelopen12,13, echter de Microscoop gepresenteerd hier (figuur 1) tot slot voldoet aan de criteria voor het uitvoeren van levende imaging SD-TIRF-experimenten van de bovengenoemde processen ter 3 raamwindow via tweede snelheid. Aangezien deze Microscoop commercieel beschikbaar is, wordt het doel van dit manuscript te beschrijven in detail en open source tools en protocollen voorzien in Beeldacquisitie, registratie en visualisatie SD-TIRF microscopie gekoppeld is.

De setup is gebaseerd op een omgekeerde Microscoop verbonden met twee scan eenheden via autonome havens - de linker poort is gekoppeld aan de eenheid van de SD en de achterste poort scannereenheid voor TIRF en foto-activation /-bleken experimenten. Maximaal 6 lasers (405/445/488/515/561/640 nm) kan worden gebruikt voor excitatie. Excitatie en opsporing van het signaal van de fluorescentie, ofwel een 100 x / NA1.45 olie of 60 x / NA1.49 olie TIRF doelstelling, respectievelijk, zijn tewerkgesteld. Het uitgestraalde licht is gesplitst door een dichroïde spiegel (561 nm long pass of 514 nm long pass) en gefilterd door diverse band pass filters (55 nm breed gecentreerd op 525 nm, 54 nm breed gecentreerd op 609 nm voor groene en rode fluorescentie, respectievelijk) geplaatst voor de twee EM-CCD-cam tijdperken. Houd er rekening mee dat er meer technische details over de setup staan in Zobiak et al. 7. in TIRF de configuratie, de SD-eenheid wordt verplaatst vanuit het licht pad binnen circa 0,5 s zodat het dezelfde twee camera's kunnen worden gebruikt voor de detectie, waardoor sneller schakelen tussen de twee beeldvormende modaliteiten vergeleken met circa 1 s dat werd gerapporteerd in het verleden13 < /C2 >. Deze functie mogelijk maakt dual channel gelijktijdige overname, dus 4 kanalen SD-TIRF denkbaar ter eerder ongeëvenaarde snelheid en nauwkeurigheid kan worden uitgevoerd. Bovendien is de uitlijning tussen SD en TIRF beelden overbodig. Uitlijning van afbeelding tussen de twee camera's, maar moet worden gecontroleerd voordat het experiment en eventueel worden hersteld. In het volgende protocol, werd een registratie correctie routine geïmplementeerd in een zelfgeschreven ImageJ macro. Bovendien, de macro werd voornamelijk ontworpen om een gelijktijdige visualisatie van SD- en TIRF datasets ondanks hun verschillende dimensionaliteit. De acquisitie software zelf hebben deze functies niet verstrekt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. bereiding van cellen

  1. Twee dagen voorafgaand aan het experiment, seed 3 * 105 HeLa of NIH3T3 cellen in 2 mL zuiver volledige groeimedium per putje van de plaat van een 6-well-celkweek. Ervoor dat de cellen in de kap van een laminaire flow in dit protocol worden verwerkt.
  2. Een dag voorafgaand aan het experiment, bereiden de transfectie reagentia volgens de aanbevelingen van de fabrikant of een empirisch bepaald protocol, bijvoorbeeld:
    1. Verdun RFP-Lifeact 1 µg en 1 µg voor YFP-Vinculin in een totaal van 200 µL verminderde serum medium. Vortex de transfectiereagens kort, 4 µL 200 µL DNA en vortex opnieuw toevoegen. De transfectie mix gedurende 15-20 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
    2. De gehele transfectie mix ontkleuring rechtstreeks toevoegen aan de cellen. Meng door schudden van de plaat en plaats het terug in de incubator.
  3. Op de dag van het experiment, voor levende imaging met bereiden van het monster:
    1. Bereid een 10 µg/mL oplossing van fibronectine in PBS jas van het glasoppervlak van een 35 mm glas onder schotel. Gebruik alleen hoge kwaliteit 0,17 mm glas coverslips voor optimale prestaties van de TIRF en Vermijd van kunststof bodem gerechten. Laat de oplossing op het glasoppervlak voor 30 minuten bij kamertemperatuur, vervolgens wegnemen op en laat de schotel drogen.
    2. Verdun een 0.1 µm multi fluorescerende kralen oplossing met een dichtheid van 1,8 x 109 deeltjes per mL in gedistilleerd water en voeg de oplossing voor 30-60-s aan de fibronectine-gecoate glazen oppervlak. Onmiddellijk verwijderen van de oplossing en laat de schotel drogen.
      Opmerking: Deze stap is alleen nodig als de TIRF vlak vóór het zaaien van de cellen en/of te verwerven van een 2-kleur referentiebeeld voor kraal gebaseerde beeldregistratie moet worden gevonden.
    3. Bereid een oplossing 0,1 M ascorbinezuur (AA) en Verdun het tot een uiteindelijke concentratie van 0,1 mM in groeimedium (AA-medium). Plaats de oplossing in een waterbad 37 ° C.
      Opmerking: Gebruik fluorescentie-geoptimaliseerde cel kweekmedium indien mogelijk, deze als phenolred-vrij en (ribo-) flavin verminderde medium. AA is een anti-oxiderende agent die fototoxische effecten tijdens live imaging14kan verminderen. Wij hebben het met succes getest in deze test, d.w.z. meer cellen gezonde onder de voorwaarden toegepast verscheen dan zonder toevoeging van AA. De pH van het medium werd echter verlaagd door 0,17 pH-eenheden schommelen.
    4. Wassen van de cellen met 2 mL PBS, voeg 250 µL trypsine-EDTA en wacht totdat de cellen volledig zijn vrijstaand (2-3 min in een incubator 37 ° C). Resuspendeer de cellen zorgvuldig in 1 mL pre AA-medium opgewarmd met een pipet en toevoegen aan 4 mL AA-medium in een tube van 15 mL cel cultuur. Plaats de celsuspensie met een lichtjes geopende deksel in een incubator ingesteld op 37 ° C en 5% CO2 in de nabijheid van de Microscoop.
    5. Voeg 1 mL vooraf opgewarmd AA-medium aan de glazen bodem schotel en plaats deze in de houder van de voorverwarmde Microscoop (zie volgende paragraaf).

2. levende imaging

  1. Start de omgevingscontrole van de Microscoop te bereiken van een stabiele 37 ° C en 5% CO2 vochtige atmosfeer.
    Opmerking: Hier, een klein podium top incubatie kamer is gebruikt dat toegestane stabiele instellingen binnen ongeveer 15 min. grotere starterscentra zal meer tijd nodig om te bereiken van stabiele omstandigheden.
  2. Alle overname-instellingen herstellen in de Microscoop voordat de celsuspensie wordt toegepast:
    1. De tijd-interval instelt op 30 s en de duur van 60-90 min. activeren de functie auto-nadruk van de hardware gebaseerde auto-focus voor elk punt van de tijd (waarde "1").
    2. Het aanpassen van de belichting van de camera en winst, evenals de kracht van de laser voor elk kanaal. Hoog krijgen niveaus, geringe blootstellingstijd en lage laser macht zijn aan te bevelen om foto-toxiciteit.
      Opmerking: De hier gepresenteerde gegevens overgenomen met 200 ms blootstelling, niveau 500 en 20% laser macht die gelijk is aan de excitatie intensiteiten van 0.5 W/cm² voor 488 nm en 1 W/cm² voor 561 nm, respectievelijk.
    3. De z-stack voor de draaiende schijf-kanalen instellen op 10 µm met 0.4 µm afstand. -Activeren z-stacks voor de TIRF-kanalen. Stel de onderkant-offset op "0", dat wil zeggen de laagste vliegtuig zal worden de positie van de focus van de hardware-autofocus.
    4. Activeer de multi-point functie "podium posities".
      Opmerking: Maximaal 3 posities kunnen worden opgenomen in een 30 s tijdsinterval.
  3. Vinden de fluorescerende kralen met epi-belichting fluorescerende verlichting op het oculair of op het computerscherm, dan activeren van één TIRF-kanaal en de lichtinvalshoek instelt op een waarde die duidt op TIRF verlichting. De autofocus activeren door het indrukken van de knop op het paneel van de Microscoop en de focus met de offset wiel aan te passen. Verwerven van een 2-kleur dataset, d.w.z. TIRF-488 en TIRF-561, voor latere kraal gebaseerde beeldregistratie (zie punt 3.1).
    1. Optioneel: Om ervoor te zorgen TIRF verlichting, voeg een paar microliters van de vrij zwevende fluorescerende multicolor kralen schorsing (zie punt 1.3.2.). Activeren van de live view van een TIRF-kanaal en het verhogen van de lichtinvalshoek. De niet-aanhanger kralen verdwijnt dan de kritische hoek, zorgen voor een juiste TIRF verlichting8.
  4. Meng de celsuspensie weer door het omkeren van de gesloten buis 2 - 3 keer en toepassen van 1 mL van de cellen op de imaging schotel.
  5. Vind snel dubbel-transfected cellen met lage niveau epi-belichting fluorescerende verlichting. Centreren van de cellen in de voorvertoning van de live camera met heldere veld verlichting en markeer de positie. Nog 1-2 punten van belang vinden en ze opslaan op de lijst van de posities.
    Opmerking: Aan het begin, de cellen gemakkelijk kunnen loskoppelen als gevolg van beweging van de fase, dus 4-5 posities ingesteld en opnieuw controleren al voordat Beeldacquisitie. Daarna Gooi 1-2 posities.
  6. Data-acquisitie starten door te klikken op de knop "Volgorde".

3. na beeldverwerking in ImageJ

  1. Oog op het genereren van een registratie-gratis hyperstack in FIJI15, is een macro genaamd "SD-TIRF_helper" geschreven dat kan worden toegepast op 2-4 kanaal SD-TIRF timelapse datasets. Sparen het dossier "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" in de FIJI sub-folder "macro's" en voer de macro door te klikken op de menuopdracht "Plugins > macro's > uitvoeren...".
    1. Als de kleurkanalen nodig registratie correctie, selecteert u de optie en maakt een nieuwe kraal gebaseerde registratie verwijzing (landmark-bestand) of gebruik een bestaand bestand dat is gemaakt voordat.
      Opmerking: De turboreg plugin16 zal gelden voor fluorescentie kralen referentie afbeeldingen. Installeer de plugin in FIJI software volgens de algemene richtsnoeren voor plugin installaties.
    2. De gegevens met de importeur van bio-formaten importeren en kies hyperstack als een weergaveoptie. Laden van de dataset van de afbeelding, selecteert u de SD-serie in de eerste stap, en de TIRF-serie in de tweede stap. FIJI, worden de gegevens gesorteerd op kanaal en de fase positie, dat wil zeggen normaal alle SD-kanalen en alle TIRF-kanalen worden weergegeven als een hyperstack voor elke fase positie die is geselecteerd weergegeven.
      Opmerking: Gegevens importeren is mogelijk van verschillende bestandstypen, bijvoorbeeld TIFF-serie of platformafhankelijke bestand typen zoals * .nd. Het bestandstype wordt niet herkend, alleen als het niet door de software van de overname als onafhankelijke, compressie-minder TIFF-indeling geëxporteerd.
    3. De registratie-correctie toepassen door de respectieve kanalen door het laden van het bestand vooraf bepaalde monumenten.
    4. Selecteer de gewenste kleur look-up tabel (LUT) voor elke zender die SD- en TIRF en samenvoegen tot een enkele, multi-dimensionale hyperstack.
      Opmerking: Tijdens de verwerking van de TIRF kanalen, een aantal z-vliegtuigen met nulwaarden intensiteit worden toegevoegd op de top van het bodem-vliegtuig dat met het aantal z-vliegtuigen in de SD-dataset overeenkomt. Deze stap is belangrijk voor de visualisatie van de laatste hyperstack. Deze methodologie klopt, sinds de diepte van de TIRF verlichting (minder dan 200nm7) is kleiner dan de z-stap-grootte van de SD-stack (400 nm).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om aan te tonen van het potentieel van SD-TIRF imaging, dat een test werd ontwikkeld die moet onthullen de spatio-temporele organisatie van cel-matrix hechting complexen en hun interactie met het cytoskelet tijdens cellulaire hechting. Daarom aanhanger HeLa of, subsidiair, NIH3T3 cellen werden transfected met YFP-Vinculin en RFP-Lifeact voor 18-24 h, trypsinized en ontpit op fibronectine-gecoate glazen bodem gerechten. Deze cellijnen werden gekozen voor hun uitgesproken cytoskelet en hoge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze paper werd de eerste succesvolle implementatie van SD en TIRF microscopie in een configuratie die geschikt zijn voor het uitvoeren van de levende cel imaging experimenten, dat wil zeggen hoge acquisitie tarieven zoals 2 SD-TIRF-afbeeldingsstapels per minuut 3 verschillende stadium gepresenteerd posities, overeenkomend met in totaal 168 frames (circa 3 beelden per seconde), werden verworven. De paar SD-TIRF-microscopen die waren eerder beschreven12,13

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken sterk de wetenschappers van de University Medical Center Hamburg-Eppendorf voor het steunen van ons met monsters voor evaluatie. Namelijk, wij danken Sabine Windhorst voor NIH3T3 cellen, Andrea Mordhorst voor YFP-Vinculin en Maren Rudolph voor RFP-Lifeact.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Microscoop en accessoires
SD-TIRF microscoopVisitron Systems
Ti met perfect focus systeemNikonInverteer microscoop standaard
CSU-W1 T2YokogawaSpinning disk unit in dual-camera configuratie
iLAS2 Roper ScientificTIRF/FRAP scanner
Evolve PhotometrixEM-CCD camera's
PiezoZ stageLudl Electronic ProductsGemotoriseerde Z stage
Bioprecision2 XY stageLudl Electronic ProductsGemotoriseerde XY stage
Stage top incubatie kamerOkolabBold LineTemperatuur, CO2 en vochtigheid toevoer
Celcultuur
HeLa cervicale kankercellenDSMZACC-57
NIH3T3 fibroblastenDSMZACC-59
Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)Gibco14190144
Trypsine-EDTA 0,05%Gibco25300054
Dulbecco's aangepast adelaarsmedium + GlutaMAX-I (DMEM)Gibco31966-021
OptiMEMGibco31985070Gereduceerd serum medium
Foetaal runder serum (FCS)Gibco10500064
Penicilline/Streptomycine (PenStrep)Gibco15140148
Volledig groeimedium (DMEM aangevuld met 10% FCS en 1% PenStrep)
TurboFectThermoFisher ScientificR0531Transfectiereagens
Ascorbinezuur (AA)SigmaA544-25G
6-well celcultuurplaatSarstedt83.392
Glass bottom dishesMatTekP35G-1.5-10-C35mm, 0.17mm glas deksel
Fibronectine, bovien plasmaThermoFisher Scientific33010018
Neubauer verbeterde kamerVWR631-0696
TetraSpeck kralenThermoFisher ScientificT7279
Plasmiden
RFP-LifeactMaren Rudolph, Instituut voor Medische Microbiologie, Universitair Medisch Centrum Hamburg Eppendorf, Duitsland
YFP-VinculinAndrea Mordhorst, Instituut voor Medische Microbiologie, Universitair Medisch Centrum Hamburg Eppendorf, Duitsland
Software en plugins
VisiViewVisitron SystemsVersie 3
ImageJVersie 1.52c
Turboreg pluginhttp://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/
Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm"deze publicatiehttps://github.com/bzobiak/ImageJ
VolocityPerkinElmerVersie 6.2.2

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780(1994).
  2. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
  3. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
  4. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  5. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  6. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
  7. Zobiak, B., Failla, A. V. Advanced spinning disk-TIRF microscopy for faster imaging of the cell interior and the plasma membrane. Journal of Microscopy. 269 (3), 282-290 (2018).
  8. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (21), 3621-3628 (2010).
  9. Burchfield, J. G., Lopez, J. A., Vallotton, P., William, E. Exocytotic vesicle behaviour assessed by total internal reflection fluorescence microscopy. Traffic. 11 (4), 429-439 (2010).
  10. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy. present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  11. Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 228 (3), 390-405 (2007).
  12. Trache, A., Lim, S. -M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. Journal of Biomedical Optics. 14 (3), 034024(2009).
  13. Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
  14. Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 1-12 (2015).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  16. Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  17. Partridge, M. A. Initiation of attachment and generation of mature focal adhesions by integrin-containing filopodia in cell spreading. Molecular Biology of the Cell. 17 (10), (2006).
  18. Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. G., Sheetz, M. P. Nanometer analysis of cell spreading on matrix-coated surfaces reveals two distinct cell states and STEPs. Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).
  19. Choi, C. K., Vicente-Manzanares, M., Zareno, J., Whitmore, L. A., Mogilner, A., Horwitz, A. R. Actin and α-actinin orchestrate the assembly and maturation of nascent adhesions in a myosin II motor-independent manner. Nature Cell Biology. 10 (9), 1039-1050 (2008).
  20. Bachir, A. I., Zareno, J., Moissoglu, K., Plow, E. F., Gratton, E., Horwitz, A. R. Integrin-associated complexes form hierarchically with variable stoichiometry in nascent adhesions. Current Biology. 24 (16), 1845-1853 (2014).
  21. Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. Integrin-mediated mechanotransduction. Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).
  22. Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).
  23. Chen, B. -C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).
  24. Fu, Y., Winter, P. W., Rojas, R., Wang, V., McAuliffe, M., Patterson, G. H. Axial superresolution via multiangle TIRF microscopy with sequential imaging and photobleaching. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (16), 4368-4373 (2016).
  25. Boulanger, J., et al. Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (48), 17164-17169 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Spinning Disk MicroscopyTIRF MicroscopyLive Cell ImagingAdhesion FormationCytoskeletal NetworkFluorescent ProteinsImage RegistrationMicroscope CalibrationSample PreparationMulti Color Imaging

Gerelateerde artikelen