Met behulp van een bacteriële ziekteverwekker sonde voor Cellulair en Organismic niveau Host Reacties

Samenvatting

We beschrijven beide tests in vitro en in vivo infectie die kunnen worden gebruikt voor het analyseren van de activiteiten van host-encoding factoren.

Samenvatting

Er zijn een verscheidenheid van strategieën bacteriële pathogenen in dienst om te overleven en eenmaal binnen de eukaryote cel vermenigvuldigen. De zogenaamde 'cytosolische' pathogenen (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensisen Rickettsia spp) toegang tot de geïnfecteerde cel cytosol door fysiek en enzymatisch verlaagt het primaire vacuolar membraan. Eenmaal in het cytosol, deze ziekteverwekkers zowel vermenigvuldigen als het genereren van voldoende mechanische krachten te doordringen van het plasma-membraan van de gastheercel om nieuwe cellen infecteren. Hier, laten we zien hoe deze terminal stap van de cellulaire infectie cyclus van L. monocytogenes (Lm) kunnen worden gekwantificeerd door zowel kolonie-vormende eenheid testen en stroom cytometry en voorbeelden geven van hoe beide factoren pathogen - en host-gecodeerde effect dit proces. We tonen ook een nauwe correspondentie van Lm infectie dynamiek van gekweekte cellen in vitro geïnfecteerd en die van de hepatische cellen afgeleid van muizen geïnfecteerd in vivo. Deze functie gebaseerde testen zijn relatief eenvoudig en kunnen gemakkelijk worden opgeschaald voor ontdekking gebaseerde high-throughput schermen voor modulatoren van eukaryotische cel functie.

Inleiding

Infectie-gebaseerde experimentele modellen zijn inherent uitdagend vanwege hun afhankelijkheid van de startende staat voorwaarden van de gastheer en ziekteverwekker, de verschillende pathogen infectie strategieën en de moeilijkheid van de toerekening van de pathogeen - en gastinstellingen gestuurde processen gebaseerd op de resultaten. De bacterie Listeria monocytogenes (Lm) is een ideale pathogen sonde host defense reacties vanwege haar genetische en microbiologische werkwillig, haar snelle en processive cellulaire infectie-strategie en de relatief duidelijk geworden relatie tussen de mobiele - en organismic-level infectie fenotypen. De cellulaire infectie van Lm verloopt via vier fasen¹: (i) cellulaire invasie die wordt afgesloten met Lm worden omsloten binnen een vacuole; (ii) Lm-gestuurde ontbinding van de vacuole membraan en introductie van Lm in het cytosol; (iii) intracytosolic replicatie; en (iv) fysieke penetratie van het plasma-membraan dat in ofwel de infectie van de direct aangrenzende cellen (zoals in een epitheliale blad) of, in de eenzame cellen resulteert, introductie van Lm in de extracellulaire milieu. Elk van deze fasen worden gepromoot door specifieke Lm-gecodeerd factoren (hierna aangeduid als 'virulentiefactoren') die, wanneer verwijderd, infectie defecten veroorzaken in zowel cellulaire en dierlijke modellen. Deze algemene infectie strategie is onafhankelijk geëvolueerd door een aantal van de zogenaamde 'cytosolische' ziekteverwekkers².

Kolonie-vormende eenheid (CFU) testen te evalueren zowel in vitro algemeen werkzaam zijn (dat wil zeggen, cellulaire) zo goed als in vivo (d.w.z. organismic) infectie resultaten. Naast hun hoge gevoeligheid, met name voor in vivo infecties, voorzien CFU assays in een duidelijke uitlezing pathogen invasie en intracellulair overleven/proliferatie. CFU testen zijn uitgebreid gebruikt voor het analyseren van zowel Lm en gastheer cel bepalende factoren die van invloed zijn infectie. Zo informatief als deze voorafgaande studies zijn geweest voor het analyseren van cellulaire invasie en intracytosolic replicatie, CFU testen hebben, tot de beste van onze kennis, niet gebruikt voor het bijhouden van de vierde fase van het proces van de infectie Lm : cellulaire ontsnappen. Hier beschrijven we relatief eenvoudig hoe cellulaire ontsnappingsvoorzieningen (hierna te noemen 'opkomst') kan worden gecontroleerd door CFU assay (en stroom cytometry) en Toon voorbeelden van hoe beide factoren pathogen - en host-gecodeerde regelen deze fase van de Lm infectie cyclus. De analyse van de terminale fase van de cellulaire Lm infectie cyclus kan maken het mogelijk om extra pathogenen en host cel infectie-specifieke factoren en activiteiten te identificeren.

Protocol

Muizen werden humaan behandeld overeenkomstig alle richtlijnen van de desbetreffende overheid voor de verzorging en gebruiken van proefdieren van het National Institutes of Health en het gebruik ervan werd goedgekeurd voor deze hele studie door de Universiteit van Miami institutionele dierenverzorgers en gebruik Comité (protocol 16-053).

1. voorbereiding van de cellen voor infectie

1. Muis macrofaag-achtige cellijn RAW 264.7 in DMEM weefsel voedingsbodems aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (voortaan aangeduid als DMEM/FCS) doorgeven met behulp van een kolf van 125 mL en een weefselkweek incubator gehandhaafd op 37 °C/5% CO₂.
2. De dag voordat de infectie, gebruik een cel schraper te verwijderen van cellen uit de uitbreiding kolf en verzamelen in een schroefdop van de conische tube van 15 mL. Cellen bij 800 x g gedurende 10 minuten centrifugeren, decanteren supernatant schorten de cel pellet in 1 mL DMEM/FCS (zonder antibiotica) en bepalen van de titer die met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerde cel teller.
3. Aanpassen van de titer tot 2 x 10⁶ cellen/mL en Voeg 0,10 mL (2 x 10⁵ cellen) aan putjes van een 48-well weefselkweek schotel. Zorg ervoor dat de celsuspensie heeft betrekking op het gehele oppervlak van de put.
   1. De cellen van de plaat in extra putten voor een latere bron van geconditioneerde media. Ook het plaatsen van 0,10 mL van DMEM/FCS in drie aanvullende bronnen om te dienen als een 'cel oncontroleerbaar'.
4. Na een nacht bebroeden in een incubator weefselkweek op 37 °C/5% CO₂. De volgende dag, Verwijder niet uit incubator totdat de bacterie entmateriaal is bereid en klaar voor gebruik.

2. voorbereiding Listeria monocytogenes (Lm) van de infecties

1. Hersenen-hart infusie (BHI) 2 mL beënten met een één kolonie van een vers-streaked agarplaat (< 2 dagen) van Lm en na een nacht bebroeden bij 37 ° C met schudden bij 130 rotaties/min.
2. De volgende dag, Voeg 0,10 mL overnachting cultuur tot 2 mL pre opgewarmd BHI en blijven incuberen bij 37 ° C met schudden tot de optische dichtheid (OD₆₀₀) tussen 0.4 en 0.6 is.
3. Geschatte bacteriële titer met behulp van een empirisch afkomstige conversieformule bepalen. In ons lab, een exponentieel groeiende Lm cultuur in BHI is ongeveer 1.3 x 10⁹ kolonievormende eenheden (kve) /OD₆₀₀. Minimaliseer de hoeveelheid tijd bacteriële culturen worden blootgesteld aan kamertemperatuur.
4. Pas de titer tot en met 5 x 10⁷ CFU/mL voorverwarmde DMEM/FCS als oplosmiddel gebruiken vlak voor infectie.

3. infectie

1. Werkt snel en precies, Voeg 20 µL (1 x 10⁶ CFU; multipliciteit van infectie, MOI = 5) van de vers bereide Lm entmateriaal (stap 2.4 hierboven) te putten door lichtjes kantelen van de schotel en zorgvuldig het plaatsen van het uiteinde van de pipet in de bovenliggende media;
   Opmerking: raak de wanden van de put met de pipet-tip.
2. Zachtjes Pipetteer de inhoud van elk putje om ervoor te zorgen volledige mengen; niet schudden of kantelen aanzienlijk de plaat, zoals dit zal Lm verspreid over de muren van de put. Cel cultuur schotel terugkomen 37 °C/5% CO₂ incubator.
3. Bereid een 10 µg/mL gentamicine oplossing met behulp van geconditioneerde media uit niet-geïnfecteerde putten als oplosmiddel.
4. Op 30 minuten na de infectie (mpi), zorgvuldig de inhoud van de evenals vóór en terugkeer cel cultuur schotel toevoegen 30 µL van de gentamicine oplossing (eindconcentratie 2,5 µg/mL) en zachtjes Pipetteer aan 37 °C/5% CO₂ incubator.
5. Oogst op 60 mpi, passende putten voor CFU assay (60 mpi tijdstip) of FCM analyse (zoals hieronder beschreven in de hoofdstukken 4 en 5, respectievelijk).
6. Voor de resterende putten, op verschillende tijdstippen daarna ofwel oogst cellen zoals vóór of, voor de bepaling van de opkomst Lm , volledig uit put media verwijderen en met 150 µL van gentamicine-vrije geconditioneerde media vervangen.

4. bemonstering van de verwerking en analyse van intracellulaire en opkomende Lm door CFU Assay

1. Oogsten, iets tilt de schotel en verwijder voorzichtig de hele media uit de put. Voeg 0,50 mL gedestilleerd steriel water (dsH₂van O) naar de waterput. Na 30 s, dragen de resulterende water lysate (10⁰) voor een tube van 1,5 mL microcentrifuge en vortex krachtig gedurende 10 s.
2. 10^-1 en 10^-2 verdunningen voorbereiden door toe te voegen of 4.5 µL of 50 µL van het water lysate tot 450 µL van dsH₂O en kort vortex om homogenisatie van het mengsel.
3. Verspreiden van 50 µL van de 10⁰, 10^-1 en/of 10^-2 monsters op lysogenie Bouillon (LB) agar platen.
4. Assay voor opkomende Lm (stap 3.6 hierboven), verwijderen van 10 µL van de overlay-media en het in twee 5 µL aliquots verdelen: aan één aliquot toevoegen 5 µL van DMEM/FCS en het tweede monster 5 µL van DMEM/FCS met 5 µg/mL gentamicine. Het laatste besturingselement wordt onderscheid gemaakt tussen extracellulaire Lm (gentamicine gevoelig) en intracellulaire Lm (gentamicine resistente) in de daaropvolgende CFU assay.
5. Na 5 min bij kamertemperatuur, 90 µL van dsH₂O, vortex krachtig gedurende 10 s en verspreiding 50 µL toevoegen op LB agar platen.
6. Opsommen van Lm kolonies op LB agar platen na 2 dagen incubatie bij 37 ° C.

5. bemonstering van de verwerking en analyse van intracellulaire en opkomende Lm door Stroom Cytometry (FCM)

1. Opstellen RAW 264.7 cellen zoals beschreven in stap 1.1-4. Aanpassen van cellen aan 1 x 10⁶ cellen/mL en 1 mL (1 x 10⁶ cellen) toe te voegen aan putjes van een 6-well weefselkweek schotel.
2. Bacterie entmateriaal bereiden zoals beschreven in stap 2.1-2.3 en infecteren van cellen met een volume van entmateriaal overeenkomt met een MOI van 50 (5 x 10⁷ CFU).
3. 1,5 uur post infectie (hpi), media ophalen eerste set van putten en plaats in een tube microcentrifuge 1,5 mL met 500 µL van 4% paraformaldehyde (PFA) en plaats op ijs totdat alle putjes zijn verwerkt.
4. Het verzamelen van intracellulaire Lm, voeg 1 mL dsH₂O naar de waterput en na 60 s, de resulterende water lysate overbrengen in een tube microcentrifuge 1,5 mL met 500 µL van 4% PFA. Vortex krachtig gedurende 10 s en plaats op ijs totdat alle putjes zijn verwerkt. (Monster verwerking is beschreven in stap 5,8 hieronder.)
5. Voor de resterende putten, media verwijderen en vervangen door 1 mL van DMEM/FCS met 5 µg/mL gentamicine te doden extracellulaire Lm en cellen snel terug te keren naar incubator.
6. Na 30 min (2 hpi) media verwijderen en vervangen door DMEM/FCS zonder gentamicine.
7. Na 2 en 4 h (4 en 6 hpi) nemen de tweede en derde keer punten door het verzamelen van media en lysates als stap 5.3 en 5.4.
8. Centrifugeer buizen bij 10.000 x g gedurende 7 min. verwijderen bovendrijvende vloeistof zonder storende pellet.
9. Opschorten van elke pellet in kleuring cocktail van 50 µL van 4% PFA en 15 µL van phalloidin. Incubeer buizen in het donker bij 4 ° C gedurende 20 minuten.
10. Voeg na een incubatieperiode van 1 mL FACS buffer aan elke buis en Pipetteer omhoog en omlaag te mengen.
11. Spin buizen bij 10.000 x g gedurende 7 min. verwijderen bovendrijvende vloeistof zonder storende pellet.
12. Opschorten van elke pellet in 400 µL van FACS buffer voor onmiddellijk gebruik of 200 µL van FACS buffer en 200 µL van 4% PFA als slaan voor latere analyse.
13. Voorbeelden van op een stroom cytometry uitvoeren en analyseren van de verzamelde gegevens.

6. bemonstering van de verwerking en analyse van Lm kolonisatie en Host Reacties in de lever

1. Voorbereiden op Lm infectie zoals beschreven in stap 2.1-2.3.
2. Bereken de benodigde hoeveelheid subcultuur voor gewenste titer van 3 x 10⁶ CFU/mL.
3. Verdun de hoeveelheid berekende bacteriën met voorverwarmde Henks evenwichtig zout oplossing (HBSS) in een eindvolume van 1 mL enkel voorafgaand aan de infectie. Dit is de input entmateriaal die is geïnjecteerd in de muis.
4. Behulp van een 28 G½ 100U insuline spuit, trekken 100 µL (3 x 10⁵ van CFU) input entmateriaal en zichtbare luchtbellen te verwijderen.
5. Plaatst u de muisaanwijzer (stam C57BL/6; mannen tussen 6 en 12 weken oud) in het bedrijf terughoudendheid en gebruik warm water (niet meer dan 45 ° C) de staart ader te verwijden, dan de invoer entmateriaal injecteren in de ader.
6. Plaat 10^-2 en 10^-3 verdunningen van het input entmateriaal op LB agar 10bcm platen en na een nacht bebroeden bij 37 ° C te bepalen van de werkelijke invoer dosering.
7. Op 18 hpi, humaan euthanaseren muis (CO₂ verstikking gevolgd door cervicale dislocatie) en het gebruik van steriele schaar geslepen open muis buikvlies voor het verzamelen van de frontale kwab van de lever met behulp van afzonderlijke paren schaar of pincet voor de buitenkant en binnenkant van de muis. Plaats de lever in een 6 cm petrischaal op ijs.
8. Snijd de lever in kleine blokjes en leg in een glazen ampul met een magnetische roer bar. Voeg toe 2 mL 2 mg/mL collagenase D gereconstitueerd in DMEM zonder FCS. Incubeer flesjes bij 37 ° C op een magneetroerder voor 30−45 min. Zodra het weefsel is gehomogeniseerd, voeg 3 mL DMEM/FCS voor inactivering van de collagenase.
9. Filtreer de cellen door een 70 µm cel zeef in een conische buis, meer DMEM/FCS toe te voegen indien nodig.
10. Centrifugeer cellen bij 800 x g pellet bij 4 ° C gedurende 10 min, verwijderen van supernatant en Suspendeer cel pellet in 500 µL van ACK buffer lyse van rode bloedcellen.
11. Incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 5 min. in ACK buffer. Cellen in 1 mL DMEM/FCS opschorten.
12. Centrifugeer cellen bij 800 x g pellet bij 4 ° C gedurende 10 min, verwijderen van supernatant en Suspendeer in 1 mL van DMEM/FCS. Vervolgens met behulp van een hemocytometer of een teller geautomatiseerde cel cellen te tellen.
13. 1 x 10⁶ cellen naar 1,5 mL microcentrifuge buis en spin te pellet overbrengen. Dan opschorten in 1 mL dsH₂O en vortex Lyse de cellen. Typeplaatje 50 µL op LB platen op onverdunde en 10^-2 verdunningen en Incubeer bij 37 ° C bij het inventariseren van Lm CFU p.a..
14. 1 x 10⁶ cellen overboeken naar FACS buizen voor elk weefsel monster volgens de graven van de cel en wassen met 1 mL FACS buffer.
15. Centrifugeer cellen bij 800 x g pellet bij 4 ° C gedurende 10 minuten en verwijder de bovendrijvende vloeistof.
16. Voorbereiden van een antilichaam cocktail met de antilichamen van belang op basis van de aanbevolen concentratie voor elke antilichaam en FACS buffer. Zie Tabel van materialen voor aanbevolen hoeveelheden gebruikt bij de analyse.
17. Schorten pellet in 100 µL van antilichaam cocktail en buizen in het donker bij 4 ° C gedurende 30 minuten uit te broeden.
18. Na incubatie, voeg toe 2 mL FACS buffer aan elke buis en schorten cellen.
19. Centrifugeer cellen bij 800 x g pellet bij 4 ° C en de vloeistof wordt weggeworpen. Vervolgens Suspendeer de pellet in 400 µL van FACS buffer voor onmiddellijk gebruik of 200 µL van FACS buffer en 200 µL van 4% PFA als opslaan voor later.
20. Analyseren van cellen door stroom cytometry (zie stap 5.13).

Resultaten

Beoordeling van de rol van pathogenen en host-gecodeerde factoren invloed van cellulaire infectie
De voorwaarden van de infectie hierboven beschreven gebruiken, wordt 0,15% van de invoer van wild-type Lm hersteld na 1,5 uur van co incubatie met gekweekte macrofagen(Figuur 1). In de daaropvolgende 1,5 h co incubatietijd (3 h post infectie, hpi), was er een toename van de terugwinning van levensvatbare Lm 4...

Discussie

Vanwege zijn snelle en processive cellulaire infectie programma is Lm een ideale pathogen sonde van cellulaire activiteiten die van invloed zijn infectie. Een aantal gastheer factoren geïdentificeerd die positief dan wel negatief Lm cellulaire infectie^{11,12,13,14 beïnvloeden}. Twee dergelijke gastheer factoren gekenmerkt in ons laboratorium, Perforine-2 en de Heem geregeld remm...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
ACK Lysing Buffer	Gibco	A1049201
ArC Amine Reactive Compensation Beads	Life Technologies	A10346
BHI (Brain Heart Infusion) bouillon	EMD Milipore	110493
Celzeven, 70 µm	VWR	10199-656
Collagenase D	Roche	11088858001
DMEM-medium	Gibco	11965-092
FACS-buisjes	BD Falcon	352054
FBS - Hitte-geïnactiveerd	Sigma-Aldrich	F4135-500ML
Hanks' Balanced Salt-oplossing	Sigma-Aldrich	H6648-6X500ML
LB-agar	Grow Cells MS	MBPE-4040
LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit	Life Technologies	L349S9
Rhodamine Phalloidin	Thermo Fischer	R415
SP6800 Spectral Analyzer	Sony
Spuit 28 G 1/2" 1cc	BD	329461
TPP Tissue Culture 48 Well Plates	MIDSCI	TP92048
TPP Tissue Culture 6 Well Plates	MIDSCI	TP92406
UltraComp eBeads	eBioscience	01-2222-42
Antigeen
CD11b	Biolegend		Flurochrome = PE Cy5, Verdunning = 1/100, Clone = M1/70
CD11c	Biolegend		Flurochrome = AF 647, Verdunning = 1/100, Clone = N418
CD45	Biolegend		Flurochrome = APC Cy7, Verdunning = 1/100, Clone = 30-F11
F4/80	Biolegend		Flurochrome = PE, Verdunning = 1/100, Clone = BM8
Live/Dead	Invitrogen		Flurochrome = AmCyN, Verdunning = 1/100
Ly6C	Biolegend		Flurochrome = PacBlue, Verdunning = 1/200, Clone = HK1.4
MHC II	Biolegend		Flurochrome = AF 700, Verdunning = 1/200, Clone = M5/114.15.2
NK 1.1	Biolegend		Flurochrome = BV 605, Verdunning = 1/100, Clone = PK136