Methodenartikel

Identificatie van functionele eiwit regio's via chimeer eiwit bouw

DOI:

10.3791/58786

⸱

8 januari 2019

 ,  ,  , 
1Department of Cardiac Development and Remodelling, Max Planck Institute for Heart and Lung Research, 2Partner site Rhein-Main, German Centre for Cardiovascular Research (DZHK)

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Structureel verwante proteïnen oefenen vaak verschillende biologische functies. De uitwisseling van gelijkwaardige gebieden van deze proteïnen te creëren chimeer eiwitten vormt een innovatieve aanpak ter identificatie van de kritische eiwit-regio's die verantwoordelijk voor hun functionele verschillen zijn.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van dit protocol omvat het ontwerp van chimeer eiwitten waarin verschillende regio's van een eiwit worden vervangen door hun overeenkomstige sequenties in een structureel vergelijkbaar eiwit, om te bepalen van het functionele belang van deze regio's. Dergelijke Chimaera worden gegenereerd door middel van een geneste PCR protocol met overlappende DNA-fragmenten en adequaat ontworpen primers, gevolgd door hun expressie binnen een zoogdieren systeem om inheemse secundaire structuur en posttranslationele modificaties.

De functionele rol van een afzonderlijke regio wordt vervolgens aangegeven door een verlies van activiteit van de Chimaera in een passende uitlezing assay. Als gevolg hiervan worden regio's herbergen een aantal essentiële aminozuren geïdentificeerd, die verder kan worden gescreend door complementaire technieken (bijvoorbeeld plaats-geleide mutagenese) te verhogen van de moleculaire resolutie. Hoewel beperkt tot gevallen waarin een structureel verwante proteïne met verschillende functies kan worden gevonden, hebben chimeer eiwitten met succes gewerkt aan het identificeren van de kritische bindende regio's in de proteïnen zoals cytokines en cytokine receptoren. Deze methode is met name geschikt in gevallen waarin de proteïne van functionele regio's niet goed gedefinieerd, en vormt een waardevolle eerste stap in gerichte evolutie benaderingen te beperken van de regio's van belang en de betrokken controle-inspanning te verminderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verschillende soorten eiwitten, met inbegrip van cytokines en groeifactoren, gegroepeerd in gezinnen waarvan de leden delen van soortgelijke driedimensionale structuren maar vaak oefenen verschillende biologische functies1,2. Deze functionele diversiteit is meestal het gevolg van kleine verschillen in aminozuursamenstelling binnen3actieve sites van het molecuul. Identificatie van dergelijke sites en functionele determinanten alleen bieden geen waardevolle evolutionaire inzichten maar ook ontwerpen van meer specifieke agonisten en remmers4. Echter compliceert het grote aantal verschillen in de samenstelling van de residuen vaak gevonden tussen structureel verwante proteïnen deze taak. Hoewel de bouw van grote bibliotheken met honderden mutanten is tegenwoordig haalbaar, beoordeling van elke één residu variatie en combinaties van hen blijft een uitdagende en tijdrovende inspanning5.

Technieken beoordelen het functionele belang van grote eiwit regio's zijn dus van waarde om het aantal mogelijke residuen tot een beheersbaar nummer6. Afgeknotte proteïnen zijn de meest gebruikte aanpak van dit probleem. Dienovereenkomstig, regio's worden beschouwd als functioneel relevant als de eiwitfunctie bestudeerde wordt beïnvloed door de verwijdering van een bepaalde regio7,8,9. Een belangrijke beperking van deze methode is echter dat de verwijderingen van het eiwit secundaire structuur, wat leidt tot misfolding, samenvoeging en het onvermogen om te bestuderen van de beoogde regio kunnen beïnvloeden. Een goed voorbeeld is een afgeknotte versie van de cytokine-oncostatin M (OSM), waarin een interne schrapping groter dan 7 residuen resulteerde in een misfolded mutant die niet verder kan worden bestudeerd10.

De generatie van chimeer eiwitten vormt een alternatieve en innovatieve aanpak waarmee de analyse van de regio's groter eiwit. Het doel van deze methode is om te wisselen van regio's van belang in een eiwit door structureel verwante sequenties in een ander eiwit, teneinde de bijdrage van de vervangen onderdelen aan specifieke biologische functies. Op grote schaal gebruikt op het gebied van signalering van receptoren te identificeren van functionele domeinen11,12, zijn chimeer eiwitten met name nuttig zijn te onderzoeken eiwit gezinnen met weinig aminozuur identiteit maar geconserveerde secundaire structuur. Passende voorbeelden kunnen worden gevonden in de klasse van Interleukine-6 (IL-6) type cytokines, zoals Interleukine-6 en Ciliaire neurotrophic factor (6% reeks identiteit)13 of leukemie remmende factor (LIF) en OSM (20% identiteit)6, waarop de volgens protocol is gebaseerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. chimeer eiwit Design

  1. Selecteer een geschikte eiwit (donor) voor het uitwisselen van regio's met de proteïne van belang (ontvanger) het eiwit donor structureel vergelijkbare, idealiter die behoren tot dezelfde familie eiwit moet, maar ontbreekt de biologische activiteit te worden gebruikt als uitlezing. Als geen structureel verwante proteïnen zijn bekend, kunnen potentiële kandidaat-lidstaten worden geïdentificeerd met behulp van een geautomatiseerd hulpmiddel zoals de Vector Alignment Search Tool (VAST)14,15
    1. Toegang tot de Protein Data Bank (PDB)16 Europese website (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/), het invoeren van de naam van de proteïne van belang in het zoekvak in de rechterbovenhoek en klik op 'Zoeken'. Mits een kristalstructuur beschikbaar, niet naar beneden van de VOB-id (VOB-ID is; bijvoorbeeld 1evs voor OSM).
      Opmerking: als Landeninformatie niet beschikbaar op het voorontwerp van begroting is, een homologie-model van het eiwit kan worden gegenereerd door een hulpprogramma zoals SWISS-MODEL17 in plaats daarvan, met behulp van beschikbare stapsgewijze protocollen18.
    2. Toegang tot de enorme website (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vast.shtml). In het geval dat een VOB-ID beschikbaar is, scrol neer aan de 'Vooraf berekende resultaten ophalen' sectie imput de VOB-ID in het vak 'Toon soortgelijke structuren voor' en klik op 'Go'. In het volgende scherm, klik op 'Oorspronkelijke enorme' en vervolgens 'Gehele keten' krijgt u een overzicht van VOB-id's voor potentiële kandidaten zijn structureel vergelijkbaar.
      1. Als een VOB-ID niet beschikbaar is, maar een homologie model werd gegenereerd, scroll naar beneden naar de sectie 'Zoeken met een nieuwe structuur' en klik op de koppeling 'Uitgebreid zoeken'. Upload het VOB-bestand van het model door te klikken op 'Bladeren' naast 'Indienen VOB bestand', selecteer het bestand en te klikken op 'Verzenden'.
      2. Na het VOB bestand is geüpload, klikt u op de knop 'Start' om te beginnen met de enorme berekening. Zodra de berekening wordt uitgevoerd, klikt u op 'Gehele keten' onder domeinen te zien van de VOB-id's van structureel vergelijkbare eiwitten.
    3. Beoordelen van de biologische functies van belang (bijvoorbeeld de activering van de receptor, enzymatische activiteit, transcriptie factor activiteit) van de top kandidaten, ofwel experimenteel in het systeem van de uitlezing van keuze, of via een literatuuronderzoek. Selecteer een donor eiwitten met uiteenlopende functie ten opzichte van de proteïne van belang.
  2. De eiwit aminozuur sequenties van de ontvanger en donor eiwitten verkrijgen bij de database referentie sequentie (RefSeq)19 .
    1. Toegang tot de sectie gen in de RefSeq webpagina (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene), typ de naam van de proteïne van belang in het zoekvak en klik op 'Zoeken'. Klik op de naam van het gen voor de gewenste soorten in de resulterende lijst.
    2. Scroll naar beneden naar de sectie van de RefSeq om te zien alle gedocumenteerde isoforms. Klik op de reeks-id voor de isovorm van belang (beginnend met NM), scroll naar beneden en klik op 'Cd's ' Markeer de eiwit-codeert regio van het gen. Op het bodemrecht van het scherm, klik op 'FASTA' en kopieer de germinale genetische identiteit.
    3. Bewaren van de opeenvolging van DNA met behulp van een geschikte DNA bewerkingssoftware. Bij het gebruik van de vrij beschikbare aap20, open het programma, plak de gekopieerde volgorde in de lege doos, selecteer de naam van de reeks en klik op 'Save'.
      Let op: Herhaal stap 1.2.1. tot 1.2.3. voor de één of meer donor eiwitten geselecteerd.
  3. Kies de regio's van eiwitten te vervangen in de verschillende chimeer constructies.
    1. Verdeel de opeenvolging van de proteïne van belang duidelijke structurele regio. In het ideale geval zal verschillende domeinen voor het eiwit in kwestie zijn beschreven in de literatuur. Als dit niet het geval is, moet het bestaan van verschillende geconserveerde structurele kenmerken (helices, loops) worden geëvalueerd in stappen 1.3.1.1. te 1.3.1.4.
      1. Downloaden van de landeninformatie van het eiwit van belang van de VOB-website (zie stap 1.1.1.). Toegang tot de pagina van het VOB voor het eiwit en download het VOB-bestand door te klikken op 'download' aan de rechterkant van het scherm.
      2. Het VOB-bestand openen in een moleculaire visualisatie systeem zoals PyMOL (https://pymol.org/). Weergeven in PyMOL, de nucleotide sequentie (door te klikken op Weergave > reeks op), de standaard structurele gegevens verbergen (door te klikken op de H naast de VOB-ID en "alles" te kiezen) en selecteer de weergave 'cartoon' duidelijk visualiseren de structuur van het eiwit functies (Klik op de S naast de VOB-ID, en selecteer 'cartoon').
      3. Klik op de nucleotide-volgorde aan de bovenkant van het scherm om te wijzen op verschillende delen van het molecuul, wijzend naar beneden van de aminozuren die overeenkomt met elke structurele kenmerkend.
    2. Aantekeningen van de verschillende structurele regio's over de opeenvolging van DNA in ApE. Om dit te doen, open de opeenvolging van DNA van stap 1.2.3., selecteert u de codering voor de aminozuren in een regio nucleotiden, klik met de rechtermuisknop op de selectie en selecteert u 'Nieuwe eigenschap' het een naam en een kleur geven. Herhaal dit proces voor elke structurele regio in de vorige stap hebt opgezocht.
      Opmerking: De selectie van de nucleotide kan worden dubbel gecontroleerd door te klikken op ORFs > vertalen en vervolgens te klikken op OK, om ervoor te zorgen dat ze de code voor de juiste aminozuur-reeks.
    3. Hiermee lijnt u de sequenties van de residuen van de twee eiwitten een eiwit uitlijning tool (bijvoorbeeld Clustal Omega21) in dienst.
      Opmerking: Aangezien de Chimaera worden geproduceerd in een systeem van zoogdieren expressie, moeten deze sequenties bevatten de eiwitten signaal peptiden.
      1. Verkrijgen van de volledige aminozuur sequenties van donor en receptor eiwitten in ApE, door het openen van de opeenvolgingen van DNA uit stap 1.2.3., deze te selecteren en te klikken op ORFs > vertalen.
      2. Toegang tot de webpagina Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) en imput de aminozuur sequenties van de twee eiwitten, dan scroll naar beneden en klik op 'Verzenden'. Elke sequentie moet worden proceded door een tekstregel met ' > ProteinName' naar behoren worden geïdentificeerd...
      3. De uitlijning-bestand ophalen door te klikken op het tabblad 'Bestand Download uitlijning' en opslaan als. Dit bestand kan worden geopend door ieder tekstverwerkingsprogramma.
      4. Met behulp van de uitlijning bestand als referentie, aantekeningen toevoegen aan de bijbehorende structurele regio's van de proteïne van de donor in hun DNA-sequentie (zie stap 1.3.2.).
    4. Beslissen welke regio van de eiwitten om te wisselen in de chimeer eiwitten en ontwerpen van de juiste nucleotidesequenties voor de Chimaera.
      Opmerking: Bij gebrek aan gedetailleerde informatie betreffende functionele belang van de verschillende regio's, wordt voorgesteld om een grote vervangingen zoals hele loops selecteren of helices om te evalueren welke van hen een impact hebben op eiwitfunctie. Deze eerste verkennende experiment kan dan worden gevolgd door een tweede ronde van chimeer eiwit design, gericht op kleinere vervangingen binnen de betrokken regio's.
      1. Maak een kopie van de geannoteerde opeenvolging van DNA van de receptor eiwitten uit stap 1.3.2. en hernoem het als een chimeer eiwit. Open de hernoemde DNA-sequentie in ApE, selecteer en verwijder de nucleotide sequentie codering voor de regio worden uitgewisseld, en vervangen door de overeenkomstige regio in het donor-eiwit (overgenomen van de geannoteerde volgorde gemaakt in stap 1.3.3.), vervolgens uitgezonderd naar de veranderingen.
        Opmerking: Maak een nieuw exemplaar en herhaal deze stap voor elke verschillende chimera ontworpen.

2. voorbereiding voor het moleculaire klonen

  1. Selecteer een plasmide vector geschikt voor het systeem van de expressie van keuze. Voor zoogdieren expressie, worden een hoge-expressie vector als pCAGGS22 - of de pcDNA vector serie aanbevolen.
    1. Zorgen voor het beperkingsenzym gebaseerde klonen aangetoond in dit protocol, dat de unieke beperkingsplaatsen die aanwezig zijn in de site voor meerdere klonen (MCS) van de vector verenigbaar met de proteïne van belang zijn. Om dit te doen, open de opeenvolging van DNA van het chimeer constructies met ApE, klikt u op ' enzymen > enzym selector' en controleer of ten minste twee van de beperkingsplaatsen in de MCS zijn afwezig in de reeks (een nul naast hun naam weer te geven).
  2. De terminal inleidingen met een DNA-editor zoals ApE ontwerpen.
    1. Maak een nieuw DNA-bestand (bestand > nieuw) en initiëren van de primer van de N-terminal met een opeenvolging van de leider (3-9 extra basenparen, bijvoorbeeld AAAGGGAAA), gevolgd door de eerste beperkingsplaats geselecteerd in van de vector MCS (6-8 basenparen, bijvoorbeeld TTAATTAA voor PacI), een optionele spacer (bv . GCTAGCGCATCGCCACC in de pCAGGS-vector gebruikt in het voorbeeld) en de baseparen van de eerste 18-27 van het gen van belang (b.v. ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACG voor OSM).
    2. In een nieuw bestand van DNA, de C-terminal primer reeks begint met de finale 18-27 basenparen van het gen van belang (bijvoorbeeld CTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA voor een gen met een tag 6xHistidine C-terminal), gevolgd door een optionele spacer (bijvoorbeeld TAGCGGCCGC in de vector pCAGGS), de tweede beperking site gekozen (bijvoorbeeld GGCGCGCC voor AscI) en een leider reeks (bijvoorbeeld AAAGGGAAA). De gehele opeenvolging te benadrukken, klik met de rechtermuisknop en selecteer 'Reverse-aanvulling' op het verkrijgen van de omgekeerde primer.
  3. Inleidingen voor elk van de grensregio's in het chimeer constructies ontwerpen.
    1. De opeenvolging van DNA van de Chimaera (gemaakt in stap 1.3.4.1.) openen en Markeer een 30 basenpaar regio in de zone waar de oorspronkelijke en ingevoegde sequenties in contact, bestaande uit 15 basenparen van elke sequentie zijn. Kopieer de regio (Klik met de rechtermuisknop en selecteer 'Copy') en plak deze in een nieuw DNA-bestand; deze reeks zullen de voorwaartse primer.
    2. Maak een kopie van de voorwaartse primer gegenereerd in de vorige stap en hernoem het als omgekeerde primer. De primer opeenvolging te benadrukken, klik met de rechtermuisknop en selecteer 'Reverse-aanvulling"voor het genereren van de primer van de omgekeerde volgorde.
    3. Herhaal stap 2.3.1. en 2.3.2. voor elke contactpersoon zone in de chimeer opeenvolging van DNA. In het algemeen zijn twee reeksen vooruit-/ achteruitspoelen inleidingen vereist voor het genereren van een hersenschim, tenzij de vervanging vindt plaats op de N-terminal of C-terminal regio's.
  4. Bestel de terminal en interne inleidingen van een provider van oligonucleotide synthese.
    Notities: Met behulp van sterk gezuiverd terminal inleidingen (b.v. HPLC-gezuiverd) een positief effect kunnen hebben in het slagingspercentage van het protocol. Interne inleidingen ontzout opleveren meestal goede resultaten.
  5. Sjabloon sequenties van de donor en de receptor genen te verkrijgen.
    Opmerking: Gebruik van plasmiden met de open lezing-frames (ORFs) van deze sequenties als een sjabloon sterk vergemakkelijkt de procedure en wordt aanbevolen. Anderzijds kan cDNA (cDNA) gegenereerd op basis van een cellijn bekend bij de express van deze genen worden gebruikt als een sjabloon voor opeenvolgende stappen.

3. polymerase Chain Reaction (PCR) versterking van de individuele DNA-fragmenten vormen de Chimaera

  1. Voorbereiden op een individuele PCR reactiemengsel elk van de fragmenten componeren het chimeer eiwit. Een typische chimeer eiwit vergt drie afzonderlijke fragmenten: het N-terminaal gedeelte, de regio moet worden ingevoegd, en het deel van C-terminal.
    Notities: Gebruik een high-fidelity (bijvoorbeeld Phusion High Fidelity DNA Polymerase) de polymerase van DNA om te voorkomen dat de invoering van de mutaties in de reeks. De PCR-reactie kan worden ingesteld in de avond en 's nachts.
    1. Set een 1,5 mL microfuge buis op ijs en Pipetteer de verschillende reagentia van de PCR-mengsels in de volgorde zoals aangegeven in tabel 1, zorgen de juiste inleidingen en sjablonen voor elke PCR reactie worden gebruikt (Zie tabel 2).
    2. Label twee dunwandige 0,2 mL PCR buizen voor elke reactie, en breng 20 µL van het overeenkomstige PCR mengsel in elke buis. Breng de PCR-buizen in een PCR thermocycler en start het protocol gedetailleerd in tabel 3.
      Opmerking: onthardende temperatuur moet minstens 5 graden lager is dan de smelttemperatuur van de ontworpen inleidingen.
  2. Terwijl de PCR wordt uitgevoerd, bereiden 100 mL van een 1% agarose gel in Tris-acetaat-EDTA (TAE)-buffer. Voor dit doel, weeg 1 g van agarose en meng met 100 mL voor TAE-buffer in een maatkolf van glas magnetron totdat de agarose volledig is opgelost, wervelende de kolf elke 30-40 seconden. Laat afkoelen tot ongeveer 50 ° C, 2-3 µL van ethidiumbromide (of een gelijkwaardige DNA-kleurstof) toevoegen en giet in de lade van een gel met de gewenste goed kammen.
    Let op: ethidiumbromide is een bekende mutagene stof, het gebruik van de juiste beschermende uitrusting waarborgen.
  3. Nadat de PCR reactie is voltooid, Voeg 4 µL van 6 x DNA laden buffer in elke buis. Invoegen van de 1% agarose gel in een eenheid elektroforese, bedek met TAE-buffer en zorgvuldig het laden van de monsters in de gel samen met een molecuulgewicht ladder.
    Opmerking: op het moment van laden is het beter te laten lege rijstroken tussen de monsters om DNA herstel achteraf.
  4. Stel de gel op 80-120 V 20-45 minuten.
    Opmerking: banden onder 1.000 basenparen kunnen meestal worden electrophoresed in ongeveer 20 minuten op 120 V, terwijl grotere banden langer lopende keer zal vereisen.
  5. Uitschakelen van de eenheid van de elektroforese, neem de agarose gel en visualiseren van de versterkte DNA bands onder UV-licht. Met behulp van een scheermesje, knip de afzonderlijke DNA-fragmenten uit de gel, en deze overbrengen naar gelabelde 2 mL microfuge buizen.
    Opmerking: Het minimaliseren van de blootstellingstijd aan UV-licht om DNA-schade te voorkomen.
  6. Gebruik van een PCR-opschonen kit (Zie Tabel van materialen) om de verschillende DNA-fragmenten te zuiveren.
    1. Voeg 500 µL van de buffer van de NTI geboden door de kit aan elke buis met een gel-fragment. Overbrengen naar een thermomixer bij 50-55 ° C en schudden bij 1000 t/min, totdat het gel volledig is opgelost in de buffer.
    2. Breng elke oplossing over in een kolom gelabelde kit, spin in een microcentrifuge (30-jaren ' 60, 11.000 x g) en gooi de flowthrough. Voeg 700 µL van de kit NT3 was buffer, Centrifugeer nogmaals onder dezelfde instellingen en negeren de flowthrough. Centrifugeer de kolommen weer voor 1-2mins 11.000 x g te drogen het kiezelzuur membraan binnen de kolom.
    3. Breng de kolom een label 1,5 mL microfuge buis, Pipetteer 30 µL van nuclease-gratis water in de kolom, laat staan voor 1 minuut en 30-60s 11.000 x g aan het DNA Elueer centrifugeren.
  7. Kwantificeren van de hoeveelheid DNA hersteld door het meten van de extinctie van het monster bij 260 nm en 340 nm in een spectrofotometer (Zie Tabel van materialen). De DNA-concentratie als volgt berekend door aftrekken van de 340 nm-lezing uit de 260 nm figuur, vervolgens het resultaat vermenigvuldigen door DNA van uitsterven coëfficiënt (50 µg/mL)23.
    Notities: Aanvullende metingen op 230 nm en 280 nm scheppen voor evaluatie van DNA zuiverheid: 260/280 en 260/230 ratio's boven 1.8 zijn over het algemeen beschouwd als pure voor DNA. Het protocol kan worden onderbroken na deze stap, de eluted DNA bij 4 ° C (korte termijn) of -20 ° C (langere termijn) op te slaan.

4. de PCR versterking voor het genereren van de chimeer DNA-sequentie

  1. 50 µL van een PCR reactie instellen om te fuseren van de afzonderlijke bestanddelen van de Chimaera. Volg dezelfde stappen beschreven in 3.1, de N-terminal en C-terminal inleidingen samen met 10 in dienst ng van elk van de DNA fragmenten verkregen in stap 3.7.
    Opmerking: De PCR reactie kan worden ingesteld in de avond en 's nachts.
  2. Herhaal stap 3.2 tot 3.7 te herstellen en kwantificeren van de gezuiverde fragment van DNA in 30 µL van nuclease-gratis water. Dit fragment bevat de chimeer opeenvolging van DNA, geflankeerd door de beperkingsplaatsen die is opgenomen in de terminal inleidingen.

5. de opneming van het chimeer DNA in een expressie Vector

  1. Label twee 1,5 mL microfuge buizen en Pipetteer de verschillende reagentia in de volgorde vermeld in tabel 4, toe te voegen 1 µg voor de geselecteerde expressie vector in een buis en 1 µg voor de herstelde fragment van DNA in de andere. Incubeer gedurende 1-4 uur bij 37 ° C voor het uitvoeren van de spijsvertering met de gekozen enzymen van de beperking.
    Notities: Zorgen dat beide enzymen van de beperking zijn compatibel met de buffer werkzaam. In het geval dat zij vereisen heel andere buffers, eerst deze stappen uitvoeren met slechts een van de enzymen en herhaal. De tijd die nodig is voor de spijsvertering afhankelijk van de enzymen van de beperking geselecteerd variëren kan: verwijzen naar de instructies van de fabrikant voor meer informatie.
  2. Herhaal stap 3.2 tot en met 3.7 herstellen de verteerd DNA fragment en expressie vector in 30 µL van nuclease-gratis water te zuiveren. De hoeveelheid DNA hersteld als voorheen te kwantificeren.
  3. De hoeveelheid invoegen DNA dat vereist is voor een verhouding 3:1 invoegen/vector molaire in de afbinding reactie, met behulp van de volgende vergelijking berekenen.

    Invoegen (ng) = molaire verhouding * Vector (ng) * Invoegen grootte (verderbp) / grootte van de Vector (bp)

    Opmerking: Verschillende invoegen/vector molaire ratio's kunnen worden getest, hoewel een verhouding van 3:1 is meestal voldoende om voldoende resultaten te verkrijgen.
  4. Instellen van 20 µL van een reactie van de afbinding in een 1,5 mL microfuge buis met 40 ng van de expressie vector van de hoeveelheid chimeer DNA berekend in stap 5.3, buffer en T4 DNA ligase de volgorde die is aangegeven in tabel 5, en na een nacht bebroeden bij 16 ° C.
    Opmerking: Afbinding efficiëntie over het algemeen is toegenomen door het uitvoeren van de reactie 's nachts bij 16 ° C, maar u kunt ook de reactie kan worden ge¨ uncubeerd 2 h bij kamertemperatuur.
  5. Transform 5-10 µL van het mengsel van de afbinding in chemisch bevoegde Escherichia coli (E. coli) opgesteld in vervolg op standaardprotocollen24 groeien in selectie platen en enkele kolonies te kiezen voor uitbreiding en plasmide DNA isolatie volgens de vastgestelde protocollen25.
    Opmerking: De stam E. coli XL1-blauw werkte voor dit protocol, maar andere varianten van E. coli kunnen ook worden gebruikt.
  6. 1 µg verteren de geïsoleerde plasmiden met de juiste enzymen van de beperking de instructies in stap 5.1 volgen en beoordelen van de aanwezigheid van een DNA-band van een omvang die overeenkomt met de chimeer volgorde door elektroforese in een agarose gel (zie stap 3.2-3.5).
    Opmerking: Het wordt aanbevolen dat de ingebrachte sequentie wordt gecontroleerd door middel van een DNA-sequencing-service.
  7. Na succesvolle reeks verificatie, kunnen de plasmiden worden geproduceerd in grotere hoeveelheden en werkzaam in een systeem van zoogdieren expressie bij volgende gevestigde protocollen26,27.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bouw en generatie van een chimeer eiwit (Figuur 1) zal worden geïllustreerd met twee leden van de familie van Interleukine-6 cytokine, OSM en LIF, die het voorwerp van een onlangs gepubliceerde studie6 waren. Figuur 2 toont de driedimensionale structuur van deze proteïnen. Beide moleculen vast de karakteristieke secundaire structuur van klasse I cytokines, met vier helices (genoemd A tot D) verpakt in een ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De generatie van chimeer eiwitten vormt een veelzijdige techniek, die in staat zijn verder te gaan dan de grenzen van afgeknotte eiwitten om vragen te stellen zoals de modulariteit van cytokine-receptor bindende domeinen13is. Het ontwerp van Chimaera is een belangrijke stap in dit soort studies, en vereist zorgvuldige afweging. Voorbereidende studies om functionele domeinen vergt over het algemeen substitutie van brede regio's in een eerste fase, terwijl kleinere vervangingen van variabele lengtes...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door het Max-Planck-Gesellschaft en de Schüchtermann-kliniek (Bad Rothenfelde, Duitsland). Onderdeel van dit onderzoek werd oorspronkelijk gepubliceerd in het dagboek van biologische chemie. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. De lus van de AB en D-helix in de bindende site III van menselijke Oncostatin M (OSM) zijn vereist voor OSM receptor activering. J. Biol. Chem. 2018; 18:7017-7029. © de auteurs.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Labcycler thermocyclerSensoquest011-103Om dit protocol uit te voeren, kan elke conventionele PCR-machine worden gebruikt
NanoDrop 2000c UV-Vis spectrofotometerThermoFisher ScientificND-2000C DNA-kwantificering
GeneRuler 100 bp DNA ladderThermoFisher ScientificSM0241
GeneRuler DNA Ladder MixThermoFisher ScientificSM0331
AscI restrictie-enzymNew England BiolabsR0558
PacI restrictie-enzymNew England BiolabsR0547
Phusion Hot Start II DNA PolymeraseThermoFisher ScientificF-549S
dNTP-set (100 mM)Invitrogen10297018
T4 DNA ligasePromegaM1804
NucleoSpin Gel and PCR clean-up kitMacherey-Nagel740609
MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stockThermoFisher ScientificMHS6278-202857165
LE agaroseBiozym840004
PrimersSigma-AldrichOp bestelling
Human Oncostatin M cDNAGift van Dr. Heike Hermanns (Afdeling Hepatologie, Universitair Ziekenhuis Würzburg, Duitsland) 
pCAGGS vector met PacI en AscI restrictieplaatsenGift van Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Duitsland)

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huising, M. O., Kruiswijk, C. P., Flik, G. Phylogeny and evolution of class-I helical cytokines. The Journal of Endocrinology. 189 (1), 1-25 (2006).
  2. Brocker, C., Thompson, D., Matsumoto, A., Nebert, D. W., Vasiliou, V. Evolutionary divergence and functions of the human interleukin (IL) gene family. Human Genomics. 5 (1), 30-55 (2010).
  3. Bravo, J., Heath, J. K. Receptor recognition by gp130 cytokines. The EMBO Journal. 19 (11), 2399-2411 (2000).
  4. Schneider, G., Fechner, U. Computer-based de novo. design of drug-like molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (8), 649-663 (2005).
  5. Heydenreich, F. M., Miljuš, T., Jaussi, R., Benoit, R., Milić, D., Veprintsev, D. B. High-throughput mutagenesis using a two-fragment PCR approach. Scientific Reports. 7 (1), 6787(2017).
  6. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T., Pöling, J. The AB loop and D-helix in binding site III of human Oncostatin M (OSM) are required for OSM receptor activation. The Journal of Biological Chemistry. 293 (18), 7017-7029 (2018).
  7. Wang, Y., Pallen, C. J. Expression and characterization of wild type, truncated, and mutant forms of the intracellular region of the receptor-like protein tyrosine phosphatase HPTP beta. The Journal of Biological Chemistry. 267 (23), 16696-16702 (1992).
  8. Lim, J., Yao, S., Graf, M., Winkler, C., Yang, D. Structure-function analysis of full-length midkine reveals novel residues important for heparin binding and zebrafish embryogenesis. The Biochemical Journal. 451 (3), 407-415 (2013).
  9. Kim, K. -W., Vallon-Eberhard, A., et al. In vivo structure/function and expression analysis of the CX3C chemokine fractalkine. Blood. 118 (22), 156-167 (2011).
  10. Chollangi, S., Mather, T., Rodgers, K. K., Ash, J. D. A unique loop structure in oncostatin M determines binding affinity toward oncostatin M receptor and leukemia inhibitory factor receptor. The Journal of Biological Chemistry. 287 (39), 32848-32859 (2012).
  11. Aasland, D., Schuster, B., Grötzinger, J., Rose-John, S., Kallen, K. -J. Analysis of the leukemia inhibitory factor receptor functional domains by chimeric receptors and cytokines. Biochemistry. 42 (18), 5244-5252 (2003).
  12. Hermanns, H. M., Radtke, S., et al. Contributions of leukemia inhibitory factor receptor and oncostatin M receptor to signal transduction in heterodimeric complexes with glycoprotein 130. Journal of Immunology. 163 (12), 6651-6658 (1999).
  13. Kallen, K. J., Grötzinger, J., et al. Receptor recognition sites of cytokines are organized as exchangeable modules. Transfer of the leukemia inhibitory factor receptor-binding site from ciliary neurotrophic factor to interleukin-6. The Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11859-11867 (1999).
  14. Gibrat, J. F., Madej, T., Bryant, S. H. Surprising similarities in structure comparison. Current Opinion in Structural Biology. 6 (3), 377-385 (1996).
  15. Madej, T., Lanczycki, C. J., et al. MMDB and VAST+: tracking structural similarities between macromolecular complexes. Nucleic Acids Research. 42, Database issue 297-303 (2014).
  16. Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. Announcing the worldwide Protein Data Bank. Nature Structural Biology. 10 (12), 980(2003).
  17. Biasini, M., Bienert, S., et al. SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information. Nucleic Acids Research. 42, Web Server issue 252-258 (2014).
  18. Bordoli, L., Kiefer, F., Arnold, K., Benkert, P., Battey, J., Schwede, T. Protein structure homology modeling using SWISS-MODEL workspace. Nature Protocols. 4 (1), 1-13 (2009).
  19. Maglott, D. R., Katz, K. S., Sicotte, H., Pruitt, K. D. NCBI's LocusLink and RefSeq. Nucleic Acids Research. 28 (1), 126-128 (2000).
  20. Davis, M. W. ApE, A Plasmid Editor. , Available from: http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ (2018).
  21. Sievers, F., Wilm, A., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Molecular Systems Biology. 7, 539(2011).
  22. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
  23. Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
  24. Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation and Transformation of Competent E. coli Using Calcium Chloride. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  25. Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS: Minipreparation. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  26. Green, M. R., Sambrook, J. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with Sodium Dodecyl Sulfate: Maxipreps. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), 093351(2018).
  27. Hopkins, R. F., Wall, V. E., Esposito, D. Optimizing transient recombinant protein expression in mammalian cells. Methods in Molecular Biology. 801, 251-268 (2012).
  28. Wang, X., Lupardus, P., Laporte, S. L., Garcia, K. C. Structural biology of shared cytokine receptors. Annual Review of Immunology. 27, 29-60 (2009).
  29. Deller, M. C., Hudson, K. R., Ikemizu, S., Bravo, J., Jones, E. Y., Heath, J. K. Crystal structure and functional dissection of the cytostatic cytokine oncostatin. Structure. 8, 863-874 (2000).
  30. Huyton, T., Zhang, J. -G., et al. An unusual cytokine:Ig-domain interaction revealed in the crystal structure of leukemia inhibitory factor (LIF) in complex with the LIF receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12737-12742 (2007).
  31. Oezguen, N., Kumar, S., Hindupur, A., Braun, W., Muralidhara, B. K., Halpert, J. R. Identification and analysis of conserved sequence motifs in cytochrome P450 family 2. Functional and structural role of a motif 187RFDYKD192 in CYP2B enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 283 (31), 21808-21816 (2008).
  32. Wong, A., Gehring, C., Irving, H. R. Conserved Functional Motifs and Homology Modeling to Predict Hidden Moonlighting Functional Sites. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 82(2015).
  33. McDowell, D. G., Burns, N. A., Parkes, H. C. Localised sequence regions possessing high melting temperatures prevent the amplification of a DNA mimic in competitive PCR. Nucleic Acids Research. 26 (14), 3340-3347 (1998).
  34. Mamedov, T. G., Pienaar, E., et al. A fundamental study of the PCR amplification of GC-rich DNA templates. Computational Biology and Chemistry. 32 (6), 452-457 (2008).
  35. Park, J., Throop, A. L., LaBaer, J. Site-specific recombinational cloning using gateway and in-fusion cloning schemes. Current Protocols in Molecular Biology. 110, 1-23 (2015).
  36. Bitinaite, J., Rubino, M., Varma, K. H., Schildkraut, I., Vaisvila, R., Vaiskunaite, R. USER friendly DNA engineering and cloning method by uracil excision. Nucleic Acids Research. 35 (6), 1992-2002 (2007).
  37. Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  38. Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro. to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
  39. Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. BioTechniques. 43 (3), 354-359 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Protocol voor geneste PCRuitwisseling van eiwitregio sidentificatie van structurele regio szuivering van DNA fragmentengelelektroforese analysescreening met restrictie enzymenexpressie van zoogdier eiwittenassay voor functionele activiteitsite gerichte mutagenese

Gerelateerde artikelen