Methodenartikel

Twee-foton beeldvorming van Microglial processen attractie naar ATP of serotonine in Acute hersenen plakjes

DOI:

10.3791/58788

⸱

31 januari 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), UMR-S 1270 Paris, France, 2Sorbonne Université, Paris, France, 3Institut du Fer à Moulin, Paris, France

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microglia, de resident immuuncellen van de hersenen, reageren snel met de morfologische veranderingen voor wijzigingen van hun omgeving. Dit protocol wordt beschreven hoe u twee-foton microscopie te bestuderen van de aantrekkingskracht van microglial processen naar serotonine of ATP in acute hersenen plakjes van muizen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microglial cellen zijn ingezetene aangeboren immuun cellen van de hersenen die voortdurend scannen hun omgeving met hun lange processen, en bij verstoring van de homeostase, snelle morfologische veranderingen ondergaan. Bijvoorbeeld, induceert een laser-laesie in een paar minuten een georiënteerde groei van microglial processen, ook wel genoemd "directionele motiliteit", naar de site van letsel. Een soortgelijk effect kan worden verkregen door het leveren van lokaal ATP of serotonine (5-hydroxytryptamine [5-HT]). In dit artikel beschrijven we een protocol voor het opwekken van een directionele groei van microglial processen naar een lokale toepassing van ATP of 5-HT in acute hersenen plakjes van jonge en volwassen muizen en om het imago van deze attractie na verloop van tijd door multiphoton microscopie. Een eenvoudige methode van kwantificering met gratis en open-source image analysesoftware wordt voorgesteld. Een uitdaging die nog steeds kenmerkend acute hersenen segmenten is de beperkte tijd, afneemt met de leeftijd, waarin de cellen in een fysiologische toestand blijven. Dit protocol, dus sommige technische verbeteringen (gemiddeld, lucht-liquid interface kamer, kamer met een dubbele perfusie imaging) gericht op het optimaliseren van de levensvatbaarheid van de cellen van de microglial over enkele uren, vooral in plakjes van volwassen muizen hoogtepunten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microglial cellen zijn de hersenen resident macrofagen en spelen een rol in beide fysiologische en pathologische omstandigheden1,2. Ze zijn hebben een zeer vertakte morfologie en voortdurend uit te breiden en intrekken van hun processen3,4. Deze "scannen" gedrag wordt verondersteld te zijn verband houden met en nodig zijn op de enquête van hun omgeving. De morfologische plasticiteit van microglia wordt uitgedrukt in drie modi. Eerst, sommige verbindingen snel microglial morfologie moduleren: toevoeging van ATP5,6 of NMDA5,7 in het medium Baden acute hersenen segmenten verhoogt de complexiteit van de vertakkingen van de microglial, Overwegende dat de noradrenaline verlaagt het6. Deze effecten zijn direct gemedieerd door microglial receptoren (voor ATP en noradrenaline) of het vereisen van een ATP-release van neuronen (voor NMDA). Ten tweede, de snelheid van de groei en intrekking van microglial processen, beweeglijkheid of "toezicht", genoemd kan worden beïnvloed door extracellulaire factoren8,9,10van de verstoringen van de homeostase of mutaties9, 10,11. Ten derde, naast deze isotrope wijzigingen van de morfologie en de beweeglijkheid, microglia hebben de capaciteit uit te breiden hun processen gerichte richting een pipet leveren van ATP3,5,12, 13 , 14, plakjes in cultuur, in acute hersenen plakjes of in vivo, of leveren 5-HT in acute hersenen15. Dergelijke georiënteerde groei van microglial processen, ook wel genoemd de beweeglijkheid van de directionele, werd voor het eerst beschreven als een reactie op een lokale laser laesie3,4. Aldus, fysiologisch, het kan worden aan de reactie op schade gerelateerde of vereist voor het targeten van microglial processen richting synapsen of hersengebieden vereisen snoeien tijdens ontwikkeling15,16, of in fysiologische17 19 18, ,of pathologische situaties9,18,19,20 in volwassenheid. De drie soorten morfologische veranderingen is afhankelijk van verschillende intracellulaire mechanismen11,13,20, en een bepaalde stof niet noodzakelijkerwijs moduleren allemaal (bijvoorbeeld NMDA, die niet indirect optreedt op Microglia, heeft een effect op de morfologie maar er niet toe brengt de beweeglijkheid van de directionele5,7). Daarom, wanneer gericht op het effect van een stof, een mutatie of een pathologie op microglia karakteriseren, is het belangrijk te karakteriseren van de drie onderdelen van hun morfologische plasticiteit. Hier beschrijven we een methode om te studeren van de directionele groei van microglial processen naar een lokale bron van samengestelde, oftewel, hier, ATP of 5-HT.

Er zijn verschillende modellen te bestuderen microglia processen attractie: primaire culturen in 3D-omgeving6,18,19, acute hersenen segmenten6,13,15, en in vivo Imaging3,,13. De in vivo benadering is het beste voor het behoud van de fysiologische status van microglia. Echter intravital beeldvorming van diepe regio's vereist complexe chirurgische ingrepen, en daarom is het vaak beperkt tot oppervlakkige corticale lagen. Het gebruik van microglia primaire cultuur is de eenvoudigste techniek voor het testen van een groot aantal voorwaarden met een beperkt aantal dieren. Toch is het onmogelijk om het verkrijgen van de dezelfde cel morfologie in vivo, en cellen verliezen hun fysiologische interacties met neuronen en astrocyten. Acute hersenen segmenten vormen een compromis tussen deze twee benaderingen. Dit model kunnen onderzoekers te bestuderen van de breinstructuur die anders moeilijk te bereiken en om de afbeelding met hoge resolutie in vivo, en te onderzoeken segmenten van neonatale stadia, overwegende dat transcraniale microscopie wordt meestal uitgevoerd bij volwassenheid. Tot slot, het maakt het mogelijk om te volgen in real time de gevolgen van toepassing van de lokale drug, en herhalen experimenten tijdens het gebruik van een beperkt aantal dieren. Een probleem met acute hersenen segmenten is evenwel de beperkte tijd (enkele uren), waarin de cellen leven, met name voor segmenten van muizen die ouder zijn dan twee weken, en de mogelijke verandering van microglia morfologie over tijd21,22 blijven .

Hier beschrijven we een protocol ter voorbereiding van acute hersenen segmenten van jonge en volwassen Cx3cr1GFP / + muizen tot twee maanden oud, met het behoud van microglia morfologie en beweeglijkheid voor enkele uren. Wij beschrijven dan het gebruik van deze segmenten te bestuderen van de aantrekkingskracht van microglial processen naar verbindingen zoals ATP of 5-HT.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimenten werden goedgekeurd door de lokale ethische Commissie (Darwin Commissie, overeenkomsten #1170 en #10921).

1. bereiding van glas micropipetten voor de lokale toediening van verbindingen

  1. Pipetten van borosilicaat haarvaten van de dunne-muur glas met een trekker van de elektrode te bereiden. Aanpassen van de parameters worden gebruikt voor het verkrijgen van pipetten met een diameter van 4-5 µm op hun extremiteit. Figuur 2D toont één pipet in helderveld bij lage vergroting.

2. oplossingen

  1. Zorgen dat enige glaswerk dat is schoongemaakt door een autoclaaf cyclus, gevolgd door spoeldouche 2 x - 3 x met ultrazuiver water, zal worden gebruikt. Nooit gebruik glaswerk dat contact paraformaldehyde heeft gehad.
  2. Bereiden van een 2 mol· L-1 CaCl2 stockoplossing door ontbinding van 14,7 mg CaCl2·2H,2O in 50 mL water van hoge zuiverheid (ultrazuiver water, weerstand 18.2 MΩ; de sporen van metaal in gedestilleerd water of water van de kraan kunnen leiden tot suboptimaal segment kwaliteit wijten aan Pro-oxidatieve effecten).
    1. Bewaar deze stamoplossing bij kamertemperatuur gedurende ten hoogste één maand.
  3. Op de dag van het experiment, bereiden 1 L van choline-aCSF (kunstmatige cerebrospinale vloeistof) oplossing, waarvan de samenstelling 110 mmol· is L-1 choline Cl, 25 mmol· L-1 glucose, 25 mmol· L-1 NaHCO3, 7 mmol· L-1 MgCl2, 11.6 mmol· L-1 ascorbinezuur, 3.1 mmol· L-1 natrium pyruvaat, 2,5 mmol· L-1 KCl, 1,25 mmol· L-1 NaH2PO4en 0,5 mmol· L-1 CaCl2, 0,5.
    1. Ter voorbereiding van deze oplossing, toevoegen, in de volgende volgorde, in een maatkolf van 1 L afgestudeerd: 0.186 g van KCl 0,195 g van NaH2PO4, 2,04 g zure van de ascorbine, 2.1 g van NaHCO3en 4.5 g van glucose.
    2. Ongeveer de helft van het uiteindelijke volume met ultrazuiver water vullen en roer tot volledige ontbinding.
    3. Voeg 0,34 g natrium pyruvaat en 15.36 g choline Cl.
      Opmerking: Het is handig om eerste los de choline Cl met 5 tot 10 mL van de oplossing bereid in stap 2.3.2 voordat u deze toevoegt aan de hele oplossing.
    4. Voeg 7 mL 1 mol· L-1 MgCl2 en 250 µL van 2 mol· L-1 CaCl2 (bereid in stap 2.2) aan de oplossing.
    5. Vul de maatkolf tot 1 L met ultrazuiver water.
    6. Controleer of de osmolariteit tussen de 300 en 310 mΩ is met een osmometer van de dampdruk. Als dat niet het geval is, passen met glucose.
    7. Controleer de pH na carbogenation (d.w.z., borrelen met "carbogen", een mix van 95% O2/5% CO2) en pas, indien nodig, voor 7,3-7.4 met 10 M NaOH.
    8. Breng de oplossing over in een glazen fles voor opslag. Houd de fles in de koelkast tot gebruik (stap 3.1).
      Opmerking: Het is aanbevolen om een nieuwe oplossing op de dag van het experiment. Echter, indien nodig, choline-aCSF kan worden opgeslagen tot twee dagen bij 4 ° C.
  4. Op de dag van het experiment, bereiden 1 L voor een oplossing van de aCSF, waarvan de samenstelling 124 mmol· is L-1 NaCl, 26.2 mmol· L-1 NaHCO3, 25 mmol· L-1 glucose, 2,5 mmol· L-1 KCl, 2 mmol· L-1 CaCl2, 1 mmol· L-1 MgCl2en 1,25 mmol· L-1 NaH2PO4.
    1. Ter voorbereiding van deze oplossing, toevoegen, in de volgende volgorde, in een maatkolf: NaH2PO40.150 g 0.186 g van KCl, 2.2 g van NaHCO3, 4.5 g van glucose en 7.3 g NaCl. Breng de oplossing aan een volume van 1 L met ultrazuiver water en roer het krachtig op een bord roer.
    2. Voeg 1 mL 1 mol· L-1 MgCl2 en 1 mL 2 mol· L-1 CaCl2 naar de oplossing en de overdracht de aCSF oplossing aan een glazen fles voor opslag.
    3. Controleer of de osmolariteit 300-310-mΩ· is L-1 en, zo niet, pas het met glucose.
    4. Controleer de pH na carbogenation (d.w.z., borrelen met "carbogen") en pas, indien nodig, aan 7.3-7.4 met 10 M NaOH.
    5. Breng de oplossing over in een glazen fles voor opslag. Houd de fles in de koelkast tot gebruik (stap 3.1).
      Opmerking: Het is aanbevolen om een nieuwe oplossing op de dag van het experiment. Echter, een alternatief is het bereiden van een 10 x stockoplossing met NaCl, NaHCO3, KCl en NaH2PO4 op 10 x de uiteindelijke concentratie, die kan worden opgeslagen voor niet meer dan een week bij 4 ° C. Maak de laatste aCSF op de dag van het experiment door verdunnen van de stockoplossing 10 x met ultrazuiver water en de glucose, CaCl2en MgCl2toevoegen.
  5. De drug-oplossingen voor te bereiden op de dag van het experiment. Gebruik de aCSF oplossing te brengen ze naar de eindconcentraties die, hier, 500 µmol· L-1 voor ATP en 5 µmol· L-1 voor 5-HT.
    Opmerking: Voor ATP, kan een stamoplossing bereid worden (b.v., 50 mM ATP in water), opgeslagen in aliquoted vorm bij-20 ° C en verdund met aCSF aan de uiteindelijke concentratie op de dag van het experiment. In tegenstelling, moet de 5-HT (serotonine-HCl) oplossing worden bereid uit poeder op de dag van het experiment, op 1 mg·mL-1 in water, bewaard bij 4 ° C tot het voorkomen van oxidatie van 5-HT en verdund in aCSF ten tijde van het experiment.

3. bereiding van Acute hersenen segmenten

  1. Voorbereiding van de dissectie-gebied
    1. 70 mL ijskoud choline-aCSF in een bekerglas van 80 mL gebracht op het ijs, om te worden gebruikt voor cardiale perfusie, snelle afkoeling van de hersenen en snijden voor te bereiden. Bereiden van 150 mL choline-aCSF in een 200 mL kristalliseren schotel, geplaatst in een verwarmd waterbad onderhouden bij 32 ° C. Plaats een nylon mesh zeef in de crystallizing schotel te behouden van de segmenten. Dit zal worden gebruikt om te laten de plakjes herstellen voor 10 min net na het snijden.
    2. Minstens 30 min voordat de dissectie (punt 3.2), beginnen deze twee oplossingen met carbogen (70 mL choline-aCSF op ijs) en 150 mL van choline-aCSF bij 32 ° C borrelt. Constant carbogenation handhaven gedurende de gehele procedure.
    3. De kamer-interfaceapparaat (Figuur 1 c), die zal worden gebruikt om segmenten tot gebruik ervan voor te bereiden.
      1. Plaats een 200 mL kristalliseren schotel met een bar in een verzegelde voedsel box (10 x 10 cm of 10 cm diameter, 8 cm in hoogte), geïnstalleerd op een magneetroerder, magneet.
      2. Voeg 200 mL aCSF in dit crystallizing schotel en plaats van de 3D-gedrukte interface segment houder op de top van het (de interface segment houder is samengesteld uit twee perfect montage delen, met een maaswijdte van polyamide strekte zich tussen hen, figuur 1A, B).
      3. Het verwijderen van overtollige volume uit de crystallizing schotel te houden slechts een dunne film van oplossing die betrekking hebben op de maaswijdte van de interface segment houder. Dit zal later leiden tot een mooie rand van oplossing rondom de segmenten (maar zonder die betrekking hebben op hen).
      4. Zet een paar millimeter van de aCSF op de bodem van de doos van de voedsel en start het borrelen met carbogen (bij het eerste gebruik, maak een klein gaatje in de muur vak verzegelde voedsel om ervoor te zorgen dat de slang het vak kunt invoeren).
      5. Sluit de verzegelde doos met behoud van de constante carbogenation. Hierdoor ontstaat een bevochtigde 95% O2/5% CO2 rijke omgeving waarin de segmenten zullen worden overgedragen na hun herstel in choline-aCSF en onderhouden voordat ze zijn beeld. Dit apparaat is hierna te noemen de "interface kamer" (Figuur 1 c).
  2. Hersendissectie en snijden
    1. Anesthetize van de muis met een intraperitoneale injectie van 50 mg·mL-1 pentobarbital (0,15 mL/20 g muis lichaamsgewicht), immobiliseren het blootstellen van het hart en uitvoeren van een cardiale perfusie met 10 mL van ijskoud, carbogenated, choline-aCSF (zie stap 3.1.1), met een peristaltische pomp. Let op de bleekheid van de lever als een indicator van een goede perfusie. De perfusie duurt minder dan 5 min.
    2. De muis onthoofden en snijd de huid om de schedel bloot te stellen. Met een grote schaar, twee transversale sneden van toepassing vanaf de grote foramen en één lang Sagittaal knippen en, met behulp van fijne pincet, verwijderen de schedel platen.
    3. Snel en voorzichtig uitpakken van de hersenen (in minder dan 1 min) en plaats deze voor 1 min in het bekerglas van de 80 mL met de resterende (~ 60 mL) ijskoude choline-aCSF (nog onder constante carbogenation), om het afkoelen.
    4. Overdracht van de hersenen op een filtreerpapier dat voorheen nat met aCSF.
    5. Knip de hersenen volgens de regio van de hersenen van belang en voorkeur hoek van het snijden. Bijvoorbeeld naar het image van de thalamus of de hippocampus op coronale segmenten, uitgesneden met een scalpel mes het cerebellum en, vervolgens over 2 mm van de rostraal en caudal extremiteiten van de hersenen.
      Opmerking: Het is belangrijk dat het verwijderen van delen van de hersenen die ook rostraal of ook caudal omdat hoe kleiner de regio trim vóór het bereiken van het gebied van belang, hoe sneller de snijden. Een totale tijd voor snijden (stap 3.2.7) van minder dan 20 min wordt aanbevolen.
    6. Voor coronale segmenten, positie en lijm (met Cyanoacrylaat lijm) het caudal gezicht van de hersenen op een 10 cm petrischaal, gelijmd op het blok snijden voor een trillende slicer en plaats de shape in het reservoir kamer voor de trillende slicer, die is gepositioneerd in een grotere kamer gevuld met ijs. Daarna vult u de petrischaal met alle de overgebleven ijskoude choline-aCSF.
    7. Terwijl constant het 95% O2/5% CO2 borrelen van de ijskoude choline-aCSF, gesneden 300 µm dik coronale segmenten (snelheid: 0.08 mm·s-1, blade trillingen: 60 Hz, trilbreedte: 1 mm).
    8. Verzamel Pipetteer de segmenten van de hersenen met een wide-mouth (4 mm diameter) besteedbaar overdracht, één voor één na elke enkele pass van het blad, om te voorkomen dat de accumulatie van giftige componenten uitgebracht door de periferie van de segmenten. Zorg om luchtbellen te vermijden tijdens de overdracht en plaatst u elk segment in de choline-aCSF bij 32 ° C gedurende ongeveer 10 min voor herstel.
    9. Met de transfer pipette, plaats de plakjes op stukken van de lens te reinigen papier gegarneerd met een daling van choline-aCSF. De overdaad aan choline-aCSF gecombineerd en, met de spatel, plaats de segmenten, legde op het reinigen van de lens weefsel, op de maaswijdte van het cupje van de interface met carbogenated aCSF bij kamertemperatuur (zie 3.1.3.5). Laat het segment herstellen in deze omgeving voor ten minste 30 min.
      Opmerking: Na dit, de segmenten zijn klaar en kunnen worden gebruikt voor microglia imaging voor maximaal 6 uur na de extractie van de hersenen van jongeren (minder dan één maand oude) muizen en maximaal 4 h na de extractie van de hersenen van twee-maanden oude volwassenen.

4. twee-foton microscopie

  1. Parameters instellen
    1. Zet het multiphoton systeem (hybride detectoren, laser scanner, electro-optic modulator, Microscoop).
    2. Afstemmen van de laser op 920 nm, check dat de laser modus vergrendeld is, en stel de macht bij de 5% - 15% en de winst op 10%. Dit komt overeen met een vermogen van 3-5 mW onder de doelstelling. Zorg ervoor dat de nondescanned detectoren zijn betrokken en de juiste emissie en excitatie filters zijn geïnstalleerd.
    3. Parameters van de denkbaar software ingesteld op de volgende waarden: voor de framegrootte, 1024 x 1024 pixels overeenkomt met een oppervlakte van 295.07 x 295.07 µm; voor de zoom, 2. Als het signaal zeer luidruchtig is, een gemiddelde van de lijn van 2 van toepassing. Voor de dynamiek van de pixel, vastgesteldop de beeldbewerkingssoftware 12 bits of meer.
      Opmerking: Beelden met een hogere waarde van de bits toestaan onderzoekers te onderscheiden van kleinere verschillen in intensiteit van de fluorescentie dan afbeeldingen met een lagere waarde van de bits: een verandering van één grijswaarde in een 8-bits afbeelding met een verandering van 16 grijswaarden in een 12-bits en 256 grijze overeen komt waarden ik n een 16-bits afbeelding. Daarom kan hogere-bits afbeeldingen zijn beter geschikt voor kwantitatieve analyse, maar als hun omvang met de bitdiepte, opslagcapaciteit en computing toeneemt power beperken.
    4. Selecteer de scanmodus XYZT met een bereik van Z-interval bij 2 µm en een T-interval van 2 min.
      Opmerking: De x, y en z resolutie worden bepaald door de Bemonsteringstheorema van Nyquist. Een Z-stap-grootte rond 0,8 zou optimaal op te lossen microglia processen (met een diameter van < 1 µm), maar is het beperken van de optische resolutie van multiphoton microscopie (op 920 nm met een 0.95 nb doelstelling, de axiale resolutie is ongeveer 1 µm). Op de top van dat fysieke barrière, in een live-imaging experiment, de gevoeligheid of signal-to-noise verhouding, de resolutie, de snelheid en de totale observatie tijd kwestie. Rekening houdend met al deze parameters, een z-stap 2 µm (zoals in talrijke studies3,11,14), een beeldformaat van 1024 x 1024 pixels en een snelle overname een resonante scanner gekoppeld aan HyD-detectoren (het gebruikt neemt ongeveer 15 s te verwerven 50 z-plannen) hier werden geselecteerd. De frequentie van de overnames is een XYZT serie elke 2 min en de totale duur is 30 min. Als de structuur niet snel of gevoelig genoeg is, is het mogelijk om de laterale resolutie (tot 512 x 512) of het aantal z-segmenten (door imaging uitsluitend in de z-diepte dat de sterkste fluorescentie vertoont [dat wil zeggen, niet de diepste z-segmenten waar fluorescentie is vaag]), of verlaag de snelheid van de scanner. De axiale resolutie kan ook worden verlaagd doordat de z-stap tot 3 µm, maar zoals dit mogelijk van invloed op de kwantificering, alle experimenten worden vergeleken met de dezelfde z-stap moeten worden uitgevoerd.
      Opmerking: Het is mogelijk om te voeren soortgelijke experimenten op segmenten van CX3CR1creER-YFP muizen18, een lijn van de muis gebruikt voor het opwekken van genetische schrapping in microglia alleen en in welke microglia constitutively express gele fluorescerende eiwit (YFP). Het niveau van de expressie van de YFP is echter zeer laag in vergelijking met de groen fluorescente proteïne (GFP) in CX3CR1GFP / + muizen; Dus, beeldvorming is mogelijk maar uitdagende en de optimalisatie van de overname-parameters vereist. Het is aanbevolen om hen als volgt aanpassen.
    5. Afstemmen van de laser op 970 nm (die beter is aangepast aan de excitatie van de YFP dan 920 nm), het vermogen bij 50%, en de winst op 50%, hetgeen overeenkomt met een laser-macht onder de doelstelling van 5-6 mW.
    6. Stel een regel gemiddelde van 4 (of meer) ter verbetering van de signal-to-noise verhouding.
  2. Positionering van het segment en het glas-micropipet, en de lokale toepassing van de stof
    1. De slangenpomp verbinden met de opname-zaal, 30 min voordat de opname. Na het schoonmaken van het systeem van de hele perfusie met 50 mL ultrazuiver water, start de perfusie van de opname-kamer met aCSF (50 mL) bevat in een bekerglas van glas onder constante carbogenation. Gedurende het gehele experiment, houden de circulerende aCSF tot 32 ° C met een inline-microheater of een Peltier kachel.
      Opmerking: Een specifieke perfusie-kamer met boven- en onderkant perfusie is ontworpen voor het optimaliseren van de oxygenatie aan beide zijden van het segment. De perfusie-kamer is samengesteld uit twee perfect montage delen, met een maaswijdte van polyamide strekte zich tussen hen (figuur 2A, B). In vergelijking met andere soorten kamers, waar het segment is direct opleggen een dekglaasje glas aan, deze zaal vermindert neuronale dood in het onderste gedeelte van het segment, verbetert de levensvatbaarheid en de bewegingen van de segment geïnduceerd door de zwelling vermindert.
    2. Met een wide-mouth wegwerp transfer pipette, transfer het segment van de hersenen naar Image worden gemaakt aan het aCSF bekerglas Verwijder het papier van de lens te laten zinken (als een bewijs dat er geen luchtbel is gekoppeld), en het overbrengen van de opname (perfusie) kamer.
    3. Plaats de houder van een segment (een haarspeld gemaakt van platina met de twee takken samen met parallelle nylon draden) op het segment naar het minimaliseren van segment verkeer als gevolg van de perfusie-stroom.
    4. Gebruik van de verlichting fel-veld te richten op de regio van de hersenen van belang (blootstellingstijd: 50 tot 80 ms) met behulp van een lage vergroting doelstelling (5 X of 10 X). Schakel over naar de hogere doelstelling van vergroting (25 x met een 0.35 x lens) water onderdompeling en pas de positie.
      Opmerking: Vermijd om afbeeldingsvelden dicht bij van de houder van het segment nylon draden als ze kunnen het licht blokkeren en lokaal het vervormen van het segment. Zorg ervoor dat het gebied van belang plat is. Indien nodig, verwijdert u de houder van het segment om te verplaatsen van het segment en/of de houder van het segment.
    5. De fluorescentie verlichting gebruiken om fluorescerende microglial cellen aan het image worden gemaakt in het veld te zoeken (belichtingstijd: 250-500 ms).
      Opmerking: Deze stap kan onderzoekers om te controleren op de aanwezigheid van cellen in het gebied van belang en de intensiteit van de fluorescentie, en om te bepalen voor het bedrag van cellulaire puin.
    6. Aanvulling funderingsput de pipet met 10 µL van aCSF met ATP, 5-HT, of het geneesmiddel van belang bij de uiteindelijke concentratie. Punt het uiteinde naar beneden en zachtjes schudden de drug gevulde pipet om eventuele luchtbellen gevangen in de tip.
      Opmerking: Als de oplossing worden geïnjecteerd neiging bubbels vormen, kunt u overwegen met behulp van borosilicaat pipetten met een interne gloeidraad. Lekkage van ATP uit de pipet microglial processen zelfs vóór de injectie kan aantrekken (als dit gebeurt, het zal zichtbaar zijn op de analyse-stap). Hoewel dit gematigd met de concentratie van ATP moet gebruikt (500 µmol· L-1), als het een probleem is, kunt u overwegen prefilling van de micropipet met 2 mL aCSF voorafgaand aan het ATP (of andere verbinding) toe te voegen oplossing bij stap 4.2.6.
    7. Monteer de gevulde pipet in een pipet houder, verbonden met transparante buizen op een 5 mL-spuit, met een plunjer gepositioneerd op de positie van 5 mL. De pipet houder zelf is gemonteerd op een micromanipulator van drie assen.
    8. Gebruik onder heldere-veld de verlichting, de micromanipulator naar de plaats van de pipet in het midden van het veld. Voor een reproduceerbare en optimale centreren, weergeven en gebruiken van de linialen op de afbeelding.
    9. Verlagen van de pipet zachtjes naar het segment, controle en aanpassing van de doelstelling op hetzelfde moment, tot het uiteinde van de pipet licht raakt het oppervlak van het segment. De afdaling van de pipet te stoppen zodra het is zichtbaar dat het segment heeft geraakt kunt het uiteinde van de pipet te penetreren van 80-100 µm van het oppervlak van het segment (Zie figuur 3B).
    10. Afstemmen van de laser (Zie de bovenstaande parameters) en de Microscoop overschakelen naar de multiphoton modus. Zorg ervoor dat de kamer van een lichtbron (bijvoorbeeld een computerscherm) wordt vertoond. Zet de nondescanned detectoren en instellen van de winst. Gebruik een opzoektabel (LUT) met een gekleurde bovengrens om te voorkomen dat het verzadigen van de pixels in de afbeelding.
    11. Bepalen van de dikte van het segment naar zijn beeld (dat wil zeggen, de bovenste en onderste z-posities waar fluorescentie aantoonbaar [meestal tussen 220 en 290 µm in totaal is]).
      Opmerking: Aan het oppervlak van het segment is er een verhoogde dichtheid van processen en eventueel microglia, vaak met een ongewone morfologie, in vergelijking met de binnenkant van het segment. Deze ophoping zullen meer opvallend met de tijd (dwz., meer zichtbaar in de laatste dan in het eerste segment van de hersenen naar Image worden gemaakt). Daarom, de z-vliegtuigen in de eerste ~ 30 µm mag niet worden gebruikt voor de analyse en zelfs voor de overname kunnen worden overgeslagen.
    12. Start de opname voor een totale duur van 30 minuten (of meer indien gewenst) en na een basislijn 5 min, lokaal de verbinding te testen (zonder onderbreking van de beeldvorming) van toepassing. Om dit te doen, druk langzaam op de plunjer van de injectiespuit verbonden met de micropipet, van de 5 mL naar de positie van 1 mL (in ongeveer 5 s). Weerstand bij het indrukken van de plunjer moet onmiddellijk worden gevoeld. Als dat niet het geval is, wordt de tip worden verbroken.
      Opmerking: Voor een opgeleide experimentator, de injecties met deze methode zijn reproduceerbaar, maar als alternatief voor de manuele manipulatie van een spuit, de pipet kan worden gekoppeld aan een geautomatiseerde pressure uitwerpen system dat een betere controle van het volume geleverd. De injectie maakt een fysieke verstoring van het segment op de plaats van de injectie. Deze vertekening zichtbaar is een posteriori in de eerste twee of drie beelden na de injectie, maar mag niet zichtbaar zijn op het vierde beeld, (dat wil zeggen, 8 minuten na de injectie). Als het aanhoudt, kunt u wijzigen van de parameters voor de voorbereiding van de pipet.
    13. Aan het einde van de overname (30 min), de micropipet negeren en verwijderen van het segment. Indien gewenst, bevestigen het segment voor verdere immunolabeling. Bijvoorbeeld, de SNAPSHOT-methode is geoptimaliseerd voor de fixatie en kleuring van dikke plakjes23.
    14. Vóór het opstarten het beeld van een nieuw segment te maken de 2D film (punt 5.1) om te controleren dat microglia hebben een normale morfologie en gaan en dus dat de segmenten gezond zijn.

5. analyse van de aantrekkingskracht van Microglial processen

  1. 2D-projectie en drift correctie
    1. Open het bestand (. LIF) met Fiji24.
    2. Breng een substack (Beeld/stapels/Tools/Make Substack) met alleen de z-vliegtuigen van belang indien nodig. Bijvoorbeeld, de z-vliegtuigen die overeenkomt met het oppervlak van het segment als ze hebben verkregen, maar mogen niet worden gebruikt voor de analyse uit te sluiten (Zie de opmerking na stap 4.2.11) en de diepste z-vliegtuigen met geen fluorescentie. De definitieve stack bevat doorgaans 90-110 z-segmenten (180-220 µm).
    3. Lancering van de functie Z project (Beeld/stapels/Z Project") en selecteer het type Max intensiteit projectie te maken van de prognoses van de z-stack verworven op elk tijdstip.
    4. Lancering van de MultiStackReg plugin (Plugin/registratie/MultiStackReg), selecteren actie 1: uitlijnen en transformatie: vastlichaam te corrigeren lichte afwijkingen die zich mogelijk hebben voorgedaan tijdens de overname. Deze 2D film opslaan als een nieuw bestand (.tiff).
  2. Verwerking van gegevens
    1. Dit nieuwe bestand openen met ijzige25.
    2. Teken een circulaire R1 -regio van belang (ROI) van 35 µm in diameter, gecentreerd op de injectieplaats (aangeduid met name door de schaduw van de pipet en de vervorming gemaakt op het moment van injectie).
    3. Gebruik de plugin ROI intensiteit evolutie en meten van de gemiddelde intensiteit na verloop van tijd in R1.
    4. Sla de resultaten op een. XLS-bestand.
  3. Kwantificering en vertegenwoordiging van de resultaten
    1. Om te kwantificeren van de reactie van de microglial na verloop van tijd, bepalen op elk tijdstip
      figure-protocol-1
      Here,'R1(0) is het gemiddelde van de waarden van de R1(t) vóór de injectie. Vervolgens de resultaten kunnen worden weergegeven als een kinetische van het antwoord van de microglial, of op een bepaald tijdstip punt (Zie Figuur 7).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een methode om te induceren, observeren en kwantificeren van de georiënteerde groei van microglial processen naar een lokaal toegepaste compound, bijvoorbeeld ATP of 5-HT, in acute hersenen plakjes van jongeren of volwassene (tot ten minste twee-maand-oude) muizen. Is het gebruik van twee instrumenten ontworpen om te optimaliseren van overleving van de cel op twee stappen van het protocol tussen de factoren die bijdragen tot de instandhouding van hersenen segmenten...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Door te handhaven, in tegenstelling tot in losgekoppeld of organotypic slice cultuur, een structurele integriteit met beperkte netwerk aanpassingen, acute hersenen segmenten toestaan onderzoekers bestuderen microglia in hun fysiologische omgeving. Een van de belangrijkste beperkingen is echter het feit dat de segmenteringshulplijnen procedure maakt verwondingen die kunnen snel de levensvatbaarheid van neuronen, met name in het volwassen brein. Zoals microglia zijn bijzonder reactieve aan celschade, is het belangrijk om z...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken de cellen en weefsel Imaging faciliteit van het Institut du Fer à Moulin, waar alle Beeldacquisitie en analyse hebben ondergaan. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Centre National de la Recherche Scientifique, het Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, de Sorbonne Université wetenschappen, en door subsidies van de Sorbonne Universités-Pierre et Marie Curie Universiteit () Emergence-UPMC programma 2011/2014), de Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, de Fondation de France, de Fondation pour la Recherche Médicale "Equipe FRM DEQ2014039529", het Franse Ministerie van onderzoek (Agence Nationale pour la Recherche ANR-17-CE16-0008 en de Investissements d'Avenir programma "Bio-Psy Labex" ANR-11-IDEX-0004-02) en een onderzoek in samenwerkingsverband in Computational Neuroscience program, National Science Foundation/Frans Nationaal Agentschap voor onderzoek (nummer: 1515686). Alle de auteurs om te onderzoeken of verbonden zijn groepen die deel uitmaken van de Parijs School of Neuroscience (ENB) en van de Bio-Psy Labex. VB. is een Ph.D. student gelieerd aan de Sorbonne Université, doctorale Collège, F-75005 Parijs, Frankrijk, en wordt gefinancierd door de Bio-Psy Labex. V.M. is een postdoc gefinancierd door het onderzoek in samenwerkingsverband in Computational Neuroscience program, National Science Foundation/Frans Nationaal Agentschap voor onderzoek (nummer: 1515686). De auteurs bedanken Marta Kolodziejczak die hebben deelgenomen aan de opening van het project.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
voor pipetten voorbereiding
Clark Borosilicate Thin Wall CapillariesHarvard Apparatus30-0065Borosilicate Thin Wall without Filament, 1.5 mm OD, 1.17 mm ID, 75 mm L, Pkg. of 225
DMZ Universal PullerZeitz Instrumente
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
voor oplossingen
Calcium Chloride dihydrate (CaCl2)SigmaC5080
Choline ChlorideSigmaC7527
D-(+)-GlucoseSigmaG8270
L-Ascorbic acidSigmaA5960
Magnesium Chloride solution 1 M (MgCl2)Sigma63020
Potassium chloride SigmaUltra >99.0% (KCl)SigmaP9333
Sodium bicarbonate (NaHCO3)SigmaS5761
Sodium Chloride (NaCl)SigmaS5886
Sodium phosphate monobasicSigmaS5011
Sodium pyruvateSigmaP2256
Ultrapuur waterMilliQvoor alle oplossingen
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
voor plakvoorbereiding
2x 200 mL kristallisatie schotels
80 mL Pyrex beker
Antlia-3C Digital Peristaltische pompDD Biolab178961Voor muizen perfusie en 2-foton kamer perfusie (aCSF)
Carbogen 5% CO2/95% O2Air Liquide France Industrie
DolethalVetoquinolDolethal 50 mg/mL
Filterpapieren (Whatman)SigmaWHA1001042Whatman kwalitatief filterpapier, Grade 1 (Poriëngrootte: 11µM)
Fijne schaar - scherpFine Science Tools14060-60
Voedseldoos 10 cm diameter, 8 cm Hoogte
lijm (ethyl cyanoacrylaat)Loctitesuper lijm 3 power flex
Hippocampus Tool (spatula)Fine Science Tools10099-15De grootste uiteind moet onder een hoek van 90° staan
IJs
Iris pincet (gebogen)MoriaMC31
LensreinigingsweefselTHOR LABS
Nylon gaas zeefdiameter 7 cm
SchermessenElectron Microscopy Sciences72000Voor de snijder
Mesje
Plakinterface houderzelfgemaakt, het bestand voor 3D-printen wordt geleverd in aanvullend materiaal
Chirurgische schaar - scherpFine Science Tools14002-14
Trillende snijderThermo Scientific720-2709Model: HM 650V (Trillend mes microtoom)
WaterbadIngesteld op 32 °C (eerste herstelstap)
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
voor plakbeeldvorming
× 25 0.95 NA water-immersie objectiefLeica Microsystems (Duitsland)HCX Irapo
2-foton MP5 rechtopstaande microscoop met resonante scanners (8 kHz) en twee HyD Hybrid detecteursLeica Microsystems (Duitsland)
Antlia-3C Digital Peristaltische pompDD Biolab178961Voor 2-foton kamer perfusie met aCSF
Carbogen 5% CO2/95% O2Air Liquide France IndustrieI1501L50R2A001
Chameleon Ultra2 Ti:saffier laserCoherent (Duitsland)
wegwerp overdracht pipetten, brede mondThermoFischer wetenschappelijkbijvoorbeeld: 232-115.8 mL met eindtip, maar we snijden het (ongeveer 7 cm) om een mond met een diameter van 4 mm te hebben
emissie filter SP680Leica Microsystems (Duitsland)
fluorescente kubus met een 525/50 emissiefilter en een 560 dichroisch filter (voor fluorescentie verzamel)Leica Microsystems (Duitsland)
glasbeker met 50 mL van ACSF om een constante perfusie van de plak te handhaven
VerwarmingssysteemWarner Instrument CorporationAutomatische Heater Controller TC-324Bom de perfusieoplossing op 32 °C te houden
perfusie kamerzelfgemaakt, het bestand voor 3D-printen wordt geleverd in aanvullend materiaal
plak houder ("harp")zelfgemaakt: haakje gemaakt van platina met de twee takken verbonden door parallelle nylon draden
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
voor plak stimulatie
Adenosine 5′-trifosfaat dinatriumzout hydraat (ATP)SigmaA-26209om ex-temporaneously te worden bereid: 1 mg/mL (3 mM) stockoplossing bereid op de dag van het experiment, bewaard bij 4 °C (een paar uur) en verdund net voor gebruik
Fluoresceïne (optioneel)SigmaF-6377gebruik bij 1 µM eind

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Salter, M. W., Stevens, B. Microglia emerge as central players in brain disease. Nature Publishing Group. 23 (9), 1018-1027 (2017).
  2. Tay, T. L., Savage, J., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. -È Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition. The Journal of Physiology. , (2016).
  3. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature Neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).
  4. Nimmerjahn, A. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  5. Dissing-Olesen, L., et al. Activation of neuronal NMDA receptors triggers transient ATP-mediated microglial process outgrowth. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10511-10527 (2014).
  6. Gyoneva, S., Traynelis, S. F. Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors. Journal of Biological Chemistry. 288 (21), 15291-15302 (2013).
  7. Eyo, U. B., et al. Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10528-10540 (2014).
  8. Hristovska, I., Pascual, O. Deciphering Resting Microglial Morphology and Process Motility from a Synaptic Prospect. Frontiers in Integrative Neuroscience. 9, 1231(2016).
  9. Avignone, E., Lepleux, M., Angibaud, J., Nägerl, U. V. Altered morphological dynamics of activated microglia after induction of status epilepticus. Journal of Neuroinflammation. 12, 202(2015).
  10. Abiega, O., et al. Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling. PLoS Biology. 14 (5), e1002466(2016).
  11. Madry, C., et al. Microglial Ramification, Surveillance, and Interleukin-1β Release Are Regulated by the Two-Pore Domain K+Channel THIK-1. Neuron. 97 (2), 299-312 (2018).
  12. Honda, S., et al. Extracellular ATP or ADP induce chemotaxis of cultured microglia through Gi/o-coupled P2Y receptors. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (6), 1975-1982 (2001).
  13. Haynes, S. E., et al. The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides. Nature Neuroscience. 9 (12), 1512-1519 (2006).
  14. Wu, L. -J., Vadakkan, K. I., Zhuo, M. ATP-induced chemotaxis of microglial processes requires P2Y receptor-activated initiation of outward potassium currents. Glia. 55 (8), 810-821 (2007).
  15. Kolodziejczak, M., et al. Serotonin Modulates Developmental Microglia via 5-HT 2BReceptors: Potential Implication during Synaptic Refinement of Retinogeniculate Projections. ACS Chemical Neuroscience. 6 (7), 1219-1230 (2015).
  16. Schafer, D. P., et al. Microglia Sculpt Postnatal Neural Circuits in an Activity and Complement-Dependent Manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
  17. Pfeiffer, T., Avignone, E., Nägerl, U. V. Induction of hippocampal long-term potentiation increases the morphological dynamics of microglial processes and prolongs their contacts with dendritic spines. Scientific Reports. 6, 32422(2016).
  18. Parkhurst, C. N., et al. Microglia Promote Learning-Dependent Synapse Formation through Brain-Derived Neurotrophic Factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
  19. Wu, Y., Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A., Stevens, B. Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity. Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).
  20. Ohsawa, K., et al. P2Y12 receptor-mediated integrin-beta1 activation regulates microglial process extension induced by ATP. Glia. 58 (7), 790-801 (2010).
  21. Kurpius, D., Wilson, N., Fuller, L., Hoffman, A., Dailey, M. E. Early activation, motility, and homing of neonatal microglia to injured neurons does not require protein synthesis. Glia. 54 (1), 58-70 (2006).
  22. Stence, N., Waite, M., Dailey, M. E. Dynamics of microglial activation: a confocal time-lapse analysis in hippocampal slices. Glia. 33 (3), 256-266 (2001).
  23. Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A. Fixation and Immunolabeling of Brain Slices: SNAPSHOT Method. Current Protocols in Neuroscience. 71, 1.23.1-12 (2015).
  24. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. de Chaumont, F., et al. Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research. Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).
  26. Aitken, P. G., et al. Preparative methods for brain slices: a discussion. Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 139-149 (1995).
  27. Paris, I., et al. ProMoIJ: A new tool for automatic three-dimensional analysis of microglial process motility. Glia. 66 (4), 828-845 (2018).
  28. Pagani, F., et al. Defective microglial development in the hippocampus of Cx3cr1 deficient mice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (229), 111(2015).
  29. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 221-242 (2014).
  30. Mainen, Z. F., et al. Two-photon imaging in living brain slices. Methods. 18 (2), San Diego, CA. 231-239 (1999).
  31. Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 118-125 (2008).
  32. Gyoneva, S., et al. Systemic inflammation regulates microglial responses to tissue damage in vivo. Glia. 62 (8), 1345-1360 (2014).
  33. Heindl, S., et al. Automated Morphological Analysis of Microglia After Stroke. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 106(2018).
  34. Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. Imaging microglia in brain slices and slice cultures. Cold Spring Harbor Protocols. 12 (12), 1142-1148 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

ATP attractieserotonine attractiedirectionele motiliteitmultifotonmicroscopiebeeldanalyse softwareperfusiekamercholine ACSF

Gerelateerde artikelen