Autoradiografie als een eenvoudige en krachtige methode voor visualisatie en karakterisering van farmacologische doelstellingen

Summary

De methode van autoradiografie is routinematig gebruikt om de binding van radioligands aan weefselsecties voor bepaling van de farmacologie van kwalitatieve of kwantitatieve studie.

Abstract

In vitro autoradiografie is gericht op het visualiseren van de anatomische distributie van een proteïne van belang in weefsel van proefdieren evenals mensen. De methode is gebaseerd op de specifieke binding van een radioligand naar haar biologische doel. Daarom, bevroren weefselsecties worden geïncubeerd met radioligand oplossing, en de binding aan de doelstelling vervolgens is gelokaliseerd door de detectie van radioactief verval, bijvoorbeeld met behulp van lichtgevoelige film of fosfor imaging platen. Resulterende digitale autoradiograms weer opmerkelijke ruimtelijke resolutie, waarmee de kwantificering en localisatie van radioligand binding in verschillende anatomische structuren. Bovendien voorziet kwantificering de farmacologische karakterisering van ligand affiniteit op door middel van dissociatieconstanten (K_d), remming-constanten zijn (K_ik), alsmede de dichtheid van bandplaatsen (B_max) in geselecteerde weefsels. De methode biedt dus informatie over zowel de doel lokalisatie en de selectiviteit van het ligand. Hier, wordt de techniek geïllustreerd met autoradiografie karakterisering van het zuur met hoge-affiniteit γ-hydroxybutyraat (GHB) bindend sites in zoogdieren hersenweefsel, met speciale nadruk op methodologische overwegingen met betrekking tot de bepaling van de bindende parameters, de keuze van de radioligand en de detectiemethode.

Introduction

Autoradiografie is een methode waarmee beelden van radioactief verval. De techniek is routinematig gebruikt om de studie van de verdeling van de weefsel van een proteïne van belang in vitro op basis van een specifieke farmacologische interactie tussen een radioactief gelabelde stof en haar doelstelling. Dit voorziet rechtstreekse informatie over de selectiviteit van het ligand in het doel. In vitro autoradiografie kan ook worden gebruikt voor de kwantitatieve bepaling van farmacologische bindende parameters van radioligands, zoals de dissociatieconstante (K_d) en de dichtheid van bandplaatsen (B_max), alsmede voor het bepalen van ....

Protocol

Alle dier behandeling werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtsnoeren van de Deense dier experimenten inspectie.

Opmerking: Het protocol hier beschreven dekt weefsel voorbereiding (d.w.z., muis hersenweefsel), de in vitro autoradiografie assay in voldoende detail voor het opzetten van de methode in een nieuw lab, de blootstelling aan fosfor imaging platen, evenals Na diverse densitometric analyses van autoradiograms (Figuur 2) met als doel lokaliseren en kwantificeren van radioligand binding in verschillende anatomische structuren. Voor histologisch vergelijking is een protocol voor cre....

Results

Met behulp van het protocol beschreven, was de anatomische distributie van de hoge-affiniteit GHB bandplaatsen gevisualiseerd met de hoeveelheid radioactief gemerkte GHB analoge [³H] HOCPCA in de hersenen van de muis, die werd gesneden in coronale, Sagittaal en horizontale secties (Figuur 3 ). Hoge niveaus van bindende werden waargenomen in de hippocampus en de cortex, lagere binding in het striatum en geen bindende werd ontdekt in het cerebellum, .......

Discussion

De kwaliteit van een autoradiografie bepaling wordt meestal bepaald door de gevoeligheid van de radioligand. Een belangrijke factor is de geselecteerde isotoop, dat wordt gegeven door de beschikbaarheid van bekende liganden of het haalbaar is specifieke etikettering technieken aan opbrengst liganden met passende specifieke activiteit (dat wil zeggen, de hoeveelheid radioactiviteit per eenheid mol van een radioligand)²³en met een beperkte hoeveelheid chemische aantasting. Een groot aantal .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol	Merck Millipore	107017
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
BAS-TR2040 Imaging Plate	GE Healthcare Life Science	28956481	20x40 cm - Sensitive to tritium
Cresyl violet acetate	Sigma-Aldrich	C5042-10G
DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy)	Merck Millipore	100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 mL	Sakura	4583	Tissue-Tek
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	16005-1KG-R
Superfrost Plus slides	VWR	631-9483	microscope slides
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set	Sakura Finetek Denmark ApS	4451
Tritium Standard on Glas	American Radiolabeld Chemicals, Inc.	ART 0123
Xylene substitute	Sigma-Aldrich	A5597