Method Article

Autoradiografie als een eenvoudige en krachtige methode voor visualisatie en karakterisering van farmacologische doelstellingen

DOI:

10.3791/58879

⸱

March 12th, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Drug Design and Pharmacology, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Neurobiology Research Unit and CIMBI, Copenhagen University Hospital, 3Department of Clinical Physiology, Nuclear Medicine & PET, Copenhagen University Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De methode van autoradiografie is routinematig gebruikt om de binding van radioligands aan weefselsecties voor bepaling van de farmacologie van kwalitatieve of kwantitatieve studie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vitro autoradiografie is gericht op het visualiseren van de anatomische distributie van een proteïne van belang in weefsel van proefdieren evenals mensen. De methode is gebaseerd op de specifieke binding van een radioligand naar haar biologische doel. Daarom, bevroren weefselsecties worden geïncubeerd met radioligand oplossing, en de binding aan de doelstelling vervolgens is gelokaliseerd door de detectie van radioactief verval, bijvoorbeeld met behulp van lichtgevoelige film of fosfor imaging platen. Resulterende digitale autoradiograms weer opmerkelijke ruimtelijke resolutie, waarmee de kwantificering en localisatie van radioligand binding in verschillende anatomische structuren. Bovendien voorziet kwantificering de farmacologische karakterisering van ligand affiniteit op door middel van dissociatieconstanten (Kd), remming-constanten zijn (Kik), alsmede de dichtheid van bandplaatsen (Bmax) in geselecteerde weefsels. De methode biedt dus informatie over zowel de doel lokalisatie en de selectiviteit van het ligand. Hier, wordt de techniek geïllustreerd met autoradiografie karakterisering van het zuur met hoge-affiniteit γ-hydroxybutyraat (GHB) bindend sites in zoogdieren hersenweefsel, met speciale nadruk op methodologische overwegingen met betrekking tot de bepaling van de bindende parameters, de keuze van de radioligand en de detectiemethode.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autoradiografie is een methode waarmee beelden van radioactief verval. De techniek is routinematig gebruikt om de studie van de verdeling van de weefsel van een proteïne van belang in vitro op basis van een specifieke farmacologische interactie tussen een radioactief gelabelde stof en haar doelstelling. Dit voorziet rechtstreekse informatie over de selectiviteit van het ligand in het doel. In vitro autoradiografie kan ook worden gebruikt voor de kwantitatieve bepaling van farmacologische bindende parameters van radioligands, zoals de dissociatieconstante (Kd) en de dichtheid van bandplaatsen (Bmax), alsmede voor het bepalen van de remming constante (Ki) van concurrerende liganden1,2. Vergeleken met traditionele homogenaat radioligand binding, heeft autoradiografie het voordeel van kunnend visualiseren ruimtelijke anatomie en beknopte vermelding van regionale expressie patronen3. De methode van autoradiografie is daarom een relevante alternatief voor immunocytochemie, met name in het ontbreken van een gevalideerde antilichaam. Autoradiografie is eenvoudig toe te passen in een standaard isotoop laboratorium gegeven van de beschikbaarheid van een geschikte radioligand met de vereiste farmacologische specificiteit, toegang tot een microtoom cryostaat voor het voorbereiden van weefselsecties, en een geschikte beeldvorming apparaat welk vermag de verdeling van de radioactiviteit in de respectieve weefselsecties analyseren. Met name is een belangrijk selectiecriterium voor de radioligand een beperkte hoeveelheid binding aan doelsoort sites. Dit kan naar andere eiwitten, membranen of materialen zoals plastic of filters, en wordt gezamenlijk aangeduid als niet-specifieke binding. Meestal kan niet-specifieke binding is niet-verzadigbare maar verzadigbare als het gaat om een specifieke uit-target proteïne. De beste manier van valideren waar specifieke binding is te vergelijken met weefsels ontbreekt het doel, bijvoorbeeldgenetisch gemanipuleerde (knock-out) weefsel4.

De methodologie is hier, geïllustreerd met de autoradiografie karakterisering van de hoge-affiniteit bindende site voor zuur van γ-hydroxybutyraat (GHB) in de hersenen van zoogdieren. Inzicht in de farmacologische interactie tussen GHB en zijn bindende plaats is van belang als GHB zowel een klinisch nuttig drug in de behandeling van narcolepsie en alcoholisme5, maar ook een natuurlijk bestanddeel van de zoogdieren hersenen en een recreatieve is drug6. Hoge-affiniteit GHB bandplaatsen waren eerst beschreven met behulp van [3H] GHB binding aan de rat hersenen homogenaat7. Door de jaren heen, verder autoradiografie studies met [3H] GHB en de analoge [3H] NCS-382 heeft een hoge dichtheid van bindende sites in reukkolf gebieden van rat8,9,10, muis9 , varken11en aap/mens hersenen12. De moleculaire identiteit en exacte functionele relevantie van deze bandplaatsen hebben bleef echter ongrijpbaar.

Met de bedoeling om te verder karakteriseren de bandplaatsen en te vergemakkelijken van studies over de fysiologische rol van GHB, meerdere radioligands integratie van verschillende isotopen begiftigd met verschillende affiniteiten zijn ontwikkeld ([3H] GHB, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA en [125ik] BnOPh-GHB)13,14,15,16(herzien in17) (figuur 1). De combinatie van selectieve hoge-affiniteit radioligands inwoners en een bevolkingsdichtheid van de zeer hoge weefsel van de binding sites hebben toegestaan voor de productie van hoge-kwaliteit beelden met behulp van de fosfor imaging techniek9,11. Samen met een overzicht van de praktische punten bij het opzetten van een autoradiografie experiment en een illustratie te illustreren details, zal de sectie discussie benadrukken i) de keuze van de radionuclide, ii) de keuze van assay voorwaarden, en iii) het gebruik van fosfor Imaging platen versus X-ray film. Het algemene doel van deze paper is te voorzien in technische, methodologische en wetenschappelijke bijzonderheden over de techniek van autoradiografie informeren over weefsel distributie en farmacologische analyse van eiwit doelen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dier behandeling werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtsnoeren van de Deense dier experimenten inspectie.

Opmerking: Het protocol hier beschreven dekt weefsel voorbereiding (d.w.z., muis hersenweefsel), de in vitro autoradiografie assay in voldoende detail voor het opzetten van de methode in een nieuw lab, de blootstelling aan fosfor imaging platen, evenals Na diverse densitometric analyses van autoradiograms (Figuur 2) met als doel lokaliseren en kwantificeren van radioligand binding in verschillende anatomische structuren. Voor histologisch vergelijking is een protocol voor cresyl violet kleuring opgenomen. Bovendien is de bepaling van niet-specifieke binding met een concurrerende ligand is opgenomen in het protocol. Zie voor een gedetailleerde beschrijving over het bepalen van Kd, Bmax of Kikvorige publicatie4.

1. de weefsels voorbereiding door Cryosectioning

  1. De muis euthanaseren door cervicale dislocatie en onmiddellijk ontleden uit de hersenen met behulp van schaar en pincet. Direct doorgaan naar de volgende stap om weefselschade te voorkomen.
  2. Module-freeze het weefsel door onderdompeling in poedervorm droogijs, gasvormige CO2 of tolueen. Rechtstreeks overbrengen in het bevroren weefsel een cryostaat met de temperatuur instellen tot-20 ° C. U kunt ook bewaren het weefsel bij-80 ° C tot verwerking.
    Opmerking: Vermijd herhaalde ontdooien/freezing ter vermindering van weefselbeschadiging.
  3. Laat het weefsel acclimatiseren tot-20 ° C in de cryostaat gedurende 20 minuten vóór verdere verwerking om te voorkomen dat weefsel verbrijzelen.
  4. Dekking van de houder van de weefsel met insluiten medium buiten de cryostaat en plaats het bevroren weefsel model snel in de gewenste richting terwijl het insluiten medium nog vloeibaar is. Plaats de muis hersenen verticaal op het cerebellum bijvoorbeeld, met het oog op de rostraal coronale secties. De houder van het weefsel terug overzetten naar de cryostaat en bloot de insluiten middellange tot temperaturen hieronder-10 ° C voor de verharding.
    Opmerking: Kwetsbare weefsel model moet worden bekleed in insluiten medium binnen de weefsel mallen vóór montage.
  5. Plaats de houder van het weefsel in de microtoom van de cryostaat. De afdrukstand van het weefsel te vermijden schuine secties aanpassen.
  6. Knip het weefsel met de begeleiding van een stereotaxic atlas18 in secties van de gewenste dikte (12 µm aanbevolen voor [3H] geëtiketteerd liganden). Zorgvuldig rechtzetten en ontvouwen van de sectie met een borstel van geringe omvang, indien nodig en dooi-mount de sectie op een microscoopglaasje. Sequentieel verzamelen de secties uit de regio van belang zijn voor de gewenste technische replicatie (bijvoorbeeld, 4 punten per dia).
  7. Toestaan de secties op de dia's gedurende 1 uur drogen voor verdere verwerking.
    Opmerking: Toevoeging van de dessicant materiaal aan dia dozen minimaliseert vocht ophoping op de weefselsecties. Procotol kan hier worden onderbroken door secties op lange termijn op te slaan in dia vakken-80 ° C.

2. in vitro autoradiografie

Let op: radioactiviteit. Werken in een gecertificeerd laboratorium volgens plaatselijke voorschriften. Draag beschermende kleding. Vervreemden overeenkomstig radioactief verval of uitbesteden aan een gecertificeerde bedrijf.

  1. Ontdooi de secties gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur (RT). Label de dia's met experimentele omstandigheden. Gebruik een potlood omdat de dia's zullen worden gebaad in ethanol tijdens latere kleuring.
  2. Plaats de dia's horizontaal in plastic bakjes.
    Opmerking: Positionering van dia's op een verhoogd platform binnen kunststof dienbladen vergemakkelijkt hun behandeling.
  3. Vooraf incubate de secties gemonteerd op de dia's in assay buffer aangepast naar doel in kwestie (voor GHB protocol, 50 mM KHPO4 buffer pH 6.0 wordt gebruikt) door nauwkeurige toepassing van een passende omvang op de dia (700 µL voor 3-4 knaagdier coronale secties).
    Opmerking: Zorg ervoor dat elke sectie volledig met vloeistof bedekt is.
    1. Dekking van de plastic schaaltjes met deksel teneinde te vermijden van verdamping en vooraf Incubeer bij relevante temperatuur (voor GHB protocol vooraf incubate gedurende 30 minuten op RT) onder constante zacht (20 rpm) schudden in een roteerapparaat plaat.
    2. Voor de bepaling van niet-specifieke binding, aanvulling assay buffer met relevante concentratie van compound (voor GHB protocol, 1 mM GHB).
      Opmerking: Pre-incubatie kan niet noodzakelijk zijn.
  4. Giet af pre-incubatie vloeistof uit elke dia en de dia's ook terug overzetten naar de kunststof lade.
  5. Voorkom uitdroging, incubeer onmiddellijk de secties met relevante concentratie van radioligand in assay buffer gewenste voorwaarden (voor GHB protocol, 1 nM [3H] HOCPCA voor 1 h bij RT) bestrijkt de secties volledig met de radioligand oplossing (700 µL voor 3-4 knaagdier coronale secties).
    1. Incubeer onder onder constante zacht (20 rpm) schudden van kunststof bakjes met gesloten deksel.
      Opmerking: De radioligand concentratie kan worden gevalideerd door het tellen van een aliquoot deel in een vloeibare scintillatietelling teller.
  6. Verwijderen van de incubatie-oplossing door het gieten van de vloeistof en breng de dia's in een Microscoop dia rek. Onmiddellijk overgaan tot de volgende stap om te voorkomen dat de sectie uitdroging.
  7. De dia's te wassen. Voor het protocol van GHB, wassen met ijskoude assay buffer tweemaal voor 20 s en vervolgens spoel tweemaal door dompelen de rek van de dia in de schaaltjes gevuld met ijskoude gedestilleerd water te verwijderen van zouten. Plaats van de dia's verticaal in rekken voor droging gedurende ten minste 1 uur op RT of de dia's gedurende 5 minuten droog met een ventilator koude temperatuur instelt.
    Opmerking: Wassen moet worden geoptimaliseerd, bijvoorbeelduitgebreide wassen nuttig kan zijn voor verminderen van niet-specifieke binding.
  8. De dia's overbrengen in een fixatiemiddel met paraformaldehyde (PFA) poeder voor overnachting fixatie met PFA dampen op RT ter bescherming van de integriteit van het ligand-target complex.
    Let op: PFA is giftig. Positionthe fixatiemiddel in rook kap en Vermijd contact met de huid/ogen met PFA.
  9. De volgende dag, worden de dia's overbrengen in een exsiccator doos met silicagel voor 3U op RT om vocht te elimineren.

3. Gasbedwelming met behulp Phosphor Imaging platen en scannen

  1. Plaats de secties in een cassette imaging plaat straling-afgeschermd met het weefsel naar boven. Voor de daaropvolgende kwantificering van radioligand binding, deelnemen aan een microscale [3H] elke cassette. Regelen van de secties willekeurig en bloot de secties voor directe vergelijking in de dezelfde cassette.
  2. De tritium-gevoelige fosfor imaging plaat onmiddellijk vóór gebruik ter opheffing van geaccumuleerde signalen uit de opslag te wissen en te elimineren achtergrond signalen. Daarom, laden van de plaat in fosfor imaging machine en worden blootgesteld aan zichtbaar/infrarood licht volgens de instructies van de fabrikant.
  3. Verwijder de plaat uit fosfor imaging machine en plaats deze onmiddellijk naar de secties in de cassette. Zorg ervoor dat de cassette volledig is gesloten. Bloot in de secties aan de fosfor imaging plaat voor 3 dagen op RT beschermd tegen licht.
  4. Omdat licht signaal van de beeldvorming plaat wist, zorgvuldig openen van de cassette in het donker en onmiddellijk overdracht van de beeldvorming plaat in het donkere vak van een fosfor imager of plaats de fosfor imager in een donkere kamer.
    Opmerking: Zorg ervoor om te specificeren van de ruimtelijke rangschikking van de dia's tijdens de blootstelling teneinde individuele specimen op het digitale beeld na analyse. Daarom, fosfor imaging platen ook weergeven één hoek gesneden in een verschillende hoek teneinde de correcte oriëntatie van de plaat op de digitale foto.
  5. Scan de plaat met de hoogste resolutie mogelijk om een digitale beeld te krijgen.

4. Optioneel: Cresyl Violet kleuring van weefselsecties

  1. 1% cresyl violet-oplossing te bereiden door het mengen van 5 g cresyl violet acetaat in 500 mL gedeïoniseerd water (dH2van O) tot het is opgelost (ongeveer 2 h). Filtreer door een filtreerpapier met behulp van een trechter in een nieuwe fles van 500 mL. Breng de pH op 3,5-3.8.
  2. Positie de kleuring van de dia ingesteld onder zuurkast. Laden met de volgende oplossingen in wit polypropyleen laden (met uitzondering van xyleen) bereiden:
    a. 50% ethanol/50% dH2O
    b. 70% ethanol/30% dH2O
    c. 100% ethanol
    d. 100% ethanol
    e. 100% dH2O
    f. 1% cresyl violet
    g. 0,07 procent azijnzuur (Voeg 175 µL van azijnzuur aan 250 mL dH2O).
    h. 100% xyleen in groene oplosmiddel-resistente laden
    i. 100% xyleen in groene oplosmiddel-resistente laden
  3. De dia's overbrengen in de zuurkast en plaats ze in een dia-rack.
  4. Los de lipiden door toenemende gesorteerde reeks van ethanol in dH2O in 100% ethanol (lade a-d) door dompelen de dia's voor 1 min.
  5. Hydrateren de specimens dH2O t/m aflopende concentraties van ethanol (lade a-d in omgekeerde volgorde, gevolgd door lade e) door dompelen de dia's voor 1 min.
  6. Dompel de specimens in cresyl violet oplossing gedurende 10 minuten.
  7. Spoel de specimens in 0,07 procent azijnzuur door het opheffen van de dia's op en neer zachtjes voor 4-8 s. Wash de dia's door dompelen in dH2O voor 1 min.
  8. Uitdrogen van de specimens door onderdompeling van de dia's voor 30 s in oplopende concentraties van ethanol (lade a-d).
  9. Overdracht van de specimens via twee dienbladen van 100% xyleen (lade h en i) om quench de ethanol.
  10. Hydrateren de specimens dH2O t/m aflopende concentraties van ethanol (lade a-d in omgekeerde volgorde, gevolgd door lade e) door dompelen de dia's voor 1 min.
  11. Verwijder de dia's uit de zoutoplossing met een tang. Voeg een paar druppels van organisch oplosmiddel montage media per dia en voeg een dekglaasje 24 x 60 mm aan bovenop te beschermen van monsters. Het verwijderen van luchtbellen tussen het model en de dekglaasje aan door zachtjes te drukken op het dekglaasje aan.
    Opmerking: Houd de resterende dia's in xyleen tijdens montage om te voorkomen dat het drogen.
  12. Droog de dia's die 's nachts in een zuurkast op RT.
  13. Een beeld krijgen van model met een microscoop en 1.25 X doelstelling.

5. densitometric analyse van digitaal beeld

  1. Het meten van relatieve optische dichtheid (staven) van elke ijkstandaard uit de microscale [3H] met de software van de analyse van een afbeelding.
    1. Selecteer een gebied van gelijke grootte voor elk punt van de [3H] microscale met behulp van een tool voor regio creatie van het menu-item regio bepaling. Een nummer toewijzen aan elke geselecteerde gebied door te klikken op het getal onder de menu-item- Label.
    2. OD-waarden voor elk punt van de ijkstandaard exporteren door te klikken op bestand | E xport | 2D regio verslag. ROD waarden overbrengen naar een werkblad en normaliseren door de grootte van het geselecteerde gebied. Lineaire regressie om te verkrijgen van een standaard curve voor verdere densitometric analyse uit te voeren.
      Opmerking: Zorg ervoor dat de geselecteerde gebieden worden geëtiketteerd om overeenkomende waarden van ROD en monsters te identificeren.
  2. Uitvoeren van kwantificering van autoradiograms met behulp van de merkgebonden beeldbewerkingssoftware door het selecteren van de regio van belang (ROI) met behulp van een hulpmiddel van de verwezenlijking van de regio in elke sectie en het meten van de ODs. Selecteer dezelfde regio in elke sectie door een sjabloon voor de regio van belang, dat is gekopieerd en handmatig aangepast aan kleine variaties in de anatomie van de hersenen voor elk autoradiogram te maken. Het identificeren van de anatomie van de ROI door vergelijking van autoradiograms met een hersenen atlas18. Wanneer meerdere behandelingen worden vergeleken, analyses uit te voeren de verblind en gerandomiseerde teneinde vooringenomen selectie van ROIs.
  3. ROD waarden en grootte van de geselecteerde gebieden in een spreadsheet exporteren door te klikken op bestand | E xport | 2D regio verslag.
  4. Verdeel de gemeten staaf van de geselecteerde ROI door het gebied te verkrijgen van de dichtheid per specifiek gebied.
  5. Meten van de staaf van de achtergrond van de plaat en bijbehorende ROD-waarden en oppervlakte exporteren naar een werkblad. Het signaal van de gemiddelde achtergrond van elke staaf waarde van elke ROI aftrekken.
  6. Gemiddelde de staafjes technische wordt gerepliceerd, dat wil zeggen, sectie wordt gerepliceerd met behulp van weefsel van hetzelfde dier.
  7. Gebruik de standaard curve staven omzetten in eenheden van radioligand binding, dwz., nCi/mg weefsel equivalenten (TE).
    Opmerking: De term TE wordt gebruikt omdat normen worden gegenereerd met materialen simuleren van weefsel.
  8. Express bindende door conversie van nCi/mg naar nmol/mg TE volgens de specifieke activiteit van de radioligand (vergelijking 1).
    figure-protocol-1(1)
  9. Aftrekken voor het verkrijgen van specifieke bindende waarden, niet-specifieke binding van totale bindend.
  10. Gemiddelde de binding van elke biologische repliceren met behulp van het gemiddelde van de technische repliceert van elk dier (verkregen in stap 5.6).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van het protocol beschreven, was de anatomische distributie van de hoge-affiniteit GHB bandplaatsen gevisualiseerd met de hoeveelheid radioactief gemerkte GHB analoge [3H] HOCPCA in de hersenen van de muis, die werd gesneden in coronale, Sagittaal en horizontale secties (Figuur 3 ). Hoge niveaus van bindende werden waargenomen in de hippocampus en de cortex, lagere binding in het striatum en geen bindende werd ontdekt in het cerebellum, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De kwaliteit van een autoradiografie bepaling wordt meestal bepaald door de gevoeligheid van de radioligand. Een belangrijke factor is de geselecteerde isotoop, dat wordt gegeven door de beschikbaarheid van bekende liganden of het haalbaar is specifieke etikettering technieken aan opbrengst liganden met passende specifieke activiteit (dat wil zeggen, de hoeveelheid radioactiviteit per eenheid mol van een radioligand)23en met een beperkte hoeveelheid chemische aantasting. Een groot aantal ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het werk werd gesteund door de Lundbeck Foundation (Grant R133-A12270) en de Novo Nordisk Foundation (Grant NNF0C0028664). De auteurs bedanken Dr. Aleš Marek voor de levering van [3H] radioligand.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Absolute ethanolMerck Millipore107017
Acetic acidSigma-AldrichA6283
BAS-TR2040 Imaging PlateGE Healthcare Life Science2895648120x40 cm - Gevoelig voor tritium
Cresyl violet acetateSigma-AldrichC5042-10G
DPX (niet-waterige montagevloeistof voor microscopie)Merck Millipore100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 mLSakura4583Tissue-Tek
ParaformaldehydeSigma-Aldrich16005-1KG-R
Superfrost Plus slidesVWR631-9483microscope slides
Tissue-Tek Manual Slide Staining SetSakura Finetek Denmark ApS4451
Tritium Standard op GlasAmerican Radiolabeld Chemicals, Inc.ART 0123
Xyleen-vervangerSigma-AldrichA5597

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Upham, L. V., Englert, D. F. Handbook of Radioactivity Analysis. , Elsevier Inc. 1063-1127 (2003).
  2. Manuel, I., et al. Neurotransmitter receptor localization: From autoradiography to imaging mass spectrometry. ACS Chemical Neuroscience. 6, 362-373 (2015).
  3. Pavey, G. M., Copolov, D. L., Dean, B. High-resolution phosphor imaging: validation for use with human brain tissue sections to determine the affinity and density of radioligand binding. Journal of Neuroscience Methods. 116, 157-163 (2002).
  4. Davenport, A. P. Receptor Binding Techniques. 897, Humana Press. (2012).
  5. Busardò, F. P., Kyriakou, C., Napoletano, S., Marinelli, E., Zaami, S. Clinical applications of sodium oxybate (GHB): from narcolepsy to alcohol withdrawal syndrome. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 19, 4654-4663 (2015).
  6. Wong, C. G. T., Gibson, K. M., Snead, O. C. I. From the street to the brain: neurobiology of the recreational drug γ-hydroxybutyric acid. Trends in Pharmacological Sciences. 25, 29-34 (2004).
  7. Benavides, J., et al. High affinity binding site for γ-hydroxybutyric acid in rat brain. Life Sciences. 30, 953-961 (1982).
  8. Hechler, V., Gobaille, S., Maitre, M. Selective distribution pattern of y-hydroxybutyrate receptors in the rat forebrain and midbrain as revealed by quantitative autoradiography. Brain Research. 572, 345-348 (1992).
  9. Klein, A. B., et al. Autoradiographic imaging and quantification of the high-affinity GHB binding sites in rodent brain using 3H-HOCPCA. Neurochemistry International. 100, 138-145 (2016).
  10. Gould, G. G., Mehta, A. K., Frazer, A., Ticku, M. K. Quantitative autoradiographic analysis of the new radioligand [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[α][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid ([3H]NCS-382) at γ-hydroxybutyric acid (GHB) binding sites in rat brain. Brain Research. 979, 51-56 (2003).
  11. Jensen, C. H., et al. Radiosynthesis and evaluation of [11C]3-hydroxycyclopent-1- enecarboxylic acid as potential PET ligand for the high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. ACS Chemical Neuroscience. , 22-27 (2017).
  12. Castelli, M. P., Mocci, I., Langlois, X., Gommeren, W., Luyten, W. H. M. L. Quantitative autoradiographic distribution of γ-hydroxybutyric acid binding sites in human and monkey brain. Molecular Brain Research. 78, 91-99 (2000).
  13. Wellendorph, P., et al. Novel radioiodinated γ-hydroxybutyric acid analogues for radiolabeling and photolinking of high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335, 458-464 (2010).
  14. Vogensen, S. B., et al. New synthesis and tritium labeling of a selective ligand for studying high-affinity γ-hydroxybutyrate (GHB) binding sites. Journal of Medicinal Chemistry. 56, 8201-8205 (2013).
  15. Mehta, A. K., Muschaweck, N. M., Maeda, D. Y., Coop, A., Ticku, M. K. Binding characteristics of the γ-hydroxybutyric acid receptor antagonist [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[a][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid in the rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 299, 1148-1153 (2001).
  16. Kaupmann, K., et al. Specific γ-hydroxybutyrate-binding sites but loss of pharmacological effects of γ-hydroxybutyrate in GABAB(1)-deficient mice. Neuroscience. 18, 2722-2730 (2003).
  17. Bay, T., Eghorn, L. F., Klein, A. B., Wellendorph, P. GHB receptor targets in the CNS: Focus on high-affinity binding sites. Biochemical Pharmacology. 87, 220-228 (2014).
  18. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2008).
  19. Carletti, R., Tacconi, S., Mugnaini, M., Gerrard, P. Receptor distribution studies. Current Opinion in Pharmacology. 35, 94-100 (2017).
  20. Wellendorph, P., et al. Novel cyclic γ-hydroxybutyrate (GHB) analogs with high affinity and stereoselectivity of binding to GHB sites in rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 315, 346-351 (2005).
  21. Coenen, H. H., et al. Consensus nomenclature rules for radiopharmaceutical chemistry - Setting the record straight. Nuclear Medicine and Biologly. 55, v-xi (2017).
  22. DeBlasi, A., O'Reilly, K., Motulsky, H. J. Calculating receptor number from binding experiments using same compound as radioligand and competitor. Trends in Pharmacological Science. 10, 227-229 (1989).
  23. Hulme, E. C. Receptor-ligand interactions: a practical approach. , RL Press at Oxford University Press. (1992).
  24. Holm, P., et al. Plaque deposition dependent decrease in 5-HT2A serotonin receptor in AβPPswe/ PS1dE9 amyloid overexpressing mice. Journal of Alzheimer's Disease. 20, 1201-1213 (2010).
  25. Thomsen, C., Helboe, L. Regional pattern of binding and c-Fos induction by (R)- and (S)-citalopram in rat brain. Neurochemistry. 14, 2411-2414 (2003).
  26. López-Giménez, J. F., Mengod, G., Alacios, J. M., Vilaró, M. T. Selective visualization of rat brain 5-HT2A receptors by autoradiography with [3H]MDL 100 ,907. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. , 446-454 (1997).
  27. Alexander, G. M., Schwartzman, R. J., Bell, R. D., Yu, J., Renthal, A. Quantitative measurement of local cerebral metabolic rate for glucose utilizing tritiated 2-deoxyglucose. Brain Research. 223, 59-67 (1981).
  28. Kuhar, M. J., Unnerstall, J. R. Quantitative receptor mapping by autoradiography: some current technical problems. Trends in Neurosciences. , 49-53 (1985).
  29. Kuhar, M. J., De Souza, E. B., Unnerstall, J. R. Neurotransmitter receptor mapping by autoradiography and other methods. Annual Review of Neuroscience. , 27-59 (1986).
  30. Chen, H. -T., Clark, M., Goldman, D. Quantitative Autoradiography of 3H-Paroxetine Binding Sites in Rat Brain. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 27, 209-216 (1992).
  31. Herkenham, M., Pert, C. B. Light microscopic localization of brain opiate receptors: a general autoradiographic method which preserves tissue quality. Journal of Neuroscience. 2, 1129-1149 (1982).
  32. Heimer, L., Záborszky, L. Neuroanatomical Tract-Tracing Methods 2 - Recent progress. , Plenum Press. (1989).
  33. Vessotskie, J. M., Kung, M. P., Chumpradit, S., Kung, H. F. Quantitative autoradiographic studies of dopamine D3receptors in rat cerebellum using [125I]S(-)5-OH-PIPAT. Brain Research. 778, 89-98 (1997).
  34. Klein, A. B., et al. 5-HT2A and mGLU2receptor binding levels are related to differences in impulsive behavior in the roman low- (RLA) and high- (RHA) avoidance rat strains. Neuroscience. , 36-45 (2014).
  35. Johnston, R. F., Pickett, S. C., Barker, D. L. Autoradiography using storage phosphor technology. Electrophoresis. 11, 355-360 (1990).
  36. Ito, T., Suzuki, T., Lim, D. K., Wellman, S. E., Ho, I. K. A novel quantitative receptor autoradiography and in situ hybridization histochemistry technique using storage phosphor screen imaging. Journal of Neuroscience Methods. 59, 265-271 (1995).
  37. Amemiya, Y., Miyahara, J. Imaging plate illuminates many fields. Nature. 336, 89-90 (1988).
  38. Kanekal, S., Sahai, A., Jones, R. E., Brown, D. Storage-phosphor autoradiography: a rapid and highly sensitive method for spatial imaging and quantitation of radioisotopes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. , 171-178 (1995).
  39. Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry - issues concerning methods , utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49, 411-424 (2011).
  40. Uhl, P., Fricker, G., Haberkorn, U., Mier, W. Radionuclides in drug development. Drug Discovery Today. 20, 198-208 (2015).
  41. Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: Implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biolology. 32, 719-725 (2005).
  42. Piel, M., Vernaleken, I., Rösch, F. Positron emission tomography in CNS drug discovery and drug monitoring. Journal of Medicinal Chemistry. 57, 9232-9258 (2014).
  43. Kristensen, J. L., Herth, M. M. In vivo imaging in drug discovery. Drug Design and Discovery. , CRC Press, Taylor & Francis Grou. 119-135 (2017).
  44. Cunha, L., Szigeti, K., Mathé, D., Metello, L. F. The role of molecular imaging in modern drug development. Drug Discovery Today. 19, 936-948 (2014).
  45. Bailly, C., et al. Comparison of Immuno-PET of CD138 and PET imaging with 64CuCl2and18F-FDG in a preclinical syngeneic model of multiple myeloma. Oncotarget. 9, 9061-9072 (2018).
  46. Sóvágó, J., Makkai, B., Gulyás, B., Hall, H. Autoradiographic mapping of dopamine-D2/D3receptor stimulated [35S]GTPγS binding in the human brain. European Journal of Neuroscience. 22, 65-71 (2005).
  47. Sóvágó, J., Dupuis, D. S., Gulyás, B., Hall, H. An overview on functional receptor autoradiography using [35S]GTPγS. Brain Research Reviews. 38, 149-164 (2001).
  48. Solon, E. G. Use of radioactive compounds and autoradiography to determine drug tissue distribution. Chemical Research in Toxicology. 25, 543-555 (2012).
  49. Donnelly, D. J. Small molecule PET tracers in drug discovery. Seminars in Nuclear Medicine. 47, 454-460 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

AutoradiographyRadioligand BindingTissue SectioningPhosphor ImagingProtein TargetsBrain TissueBinding AssaySignal To NoiseAnatomical DistributionPharmacological Analysis

Related Articles