Colletotrichum fioriniae Ontwikkeling in Water en Chloroform gebaseerde Blueberry en Cranberry Floral extracten

Samenvatting

Bioassays ontworpen om te controleren van de ontwikkeling van een schimmel pathogeen, Colletotrichum fioriniae, in aanwezigheid van bosbessen of cranberry floral extracten op glas coverslips worden hier beschreven. Water-, chloroform en veld regenwater - gebaseerd floral extractie technieken zijn gedetailleerd en inzicht in hoe deze informatie kan worden toegepast.

Samenvatting

U wilt nauwkeurig controleren de fenologie van de periode van bloei en de temporele dynamiek van floral chemische signalen op schimmel vrucht rotten van pathogenen, werden floral extractiemethoden en dekglaasje aan bioassays ontwikkeld met behulp van Colletotrichum fioriniae. In bosbessen en cranberry, wordt deze ziekteverwekker optimaal beheerd door fungiciden toepassen tijdens de bloei periode vanwege de rol van de bloemen in de eerste stadia van de infectie. Het protocol hier gedetailleerd wordt beschreven hoe floral extracten (FE) werden verkregen met behulp van water-, chloroform en veld regenwater gebaseerde methoden voor later gebruik in overeenkomstige glas dekglaasje aan bioassays. Elke FE diende om een andere set van informatie: reactie van C. fioriniae aan gemobiliseerde floral chemische cues in water (waterbasis), pathogene reactie op bloem en vrucht oppervlakte wassen (chloroform-gebaseerd), en het veld gebaseerde bewaking van verzameld floral regenwater, in vitro opmerkingen naar een agrarische setting. De FE in grote lijnen beschreven als ofwel water of chloroform gebaseerde, met een passende bioassay beschreven om te compenseren voor de inherente verschillen tussen deze twee materialen. Regenwater dat bloemen had weggelopen was verzameld in unieke apparaten voor elk gewas, gezinspeeld op de flexibiliteit en de toepassing van deze benadering voor andere systemen gewas. De bioassays zijn snel, goedkoop, eenvoudig, en bieden de mogelijkheid voor het genereren van Spatio en site-specifieke informatie over de aanwezigheid van stimulerend floral stoffen uit verschillende bronnen. Deze informatie zal uiteindelijk beter informeren ziekte beheersstrategieën, zoals FE verminderen de tijd die nodig is voor infectie optreden, waardoor inzicht in veranderende risico's voor pathogen infectie gedurende het groeiseizoen.

Inleiding

Colletotrichum fioriniae veroorzaakt een rot fruit van blauwe bes (Vaccinium corymbosum L.) zowel als de grote Amerikaanse Cranberry (V. macrocarpon Aiton)^1,2. Deze ziekteverwekker werd onlangs afgebakend van de C. acutatum soorten complexe^3,4,5,6 en is een causaal agens van blueberry anthracnose en een lid van de cranberry vruchten rot complex, naast talrijke andere plantaardige ziekten wereldwijd⁷veroorzaakt. C. fioriniae heeft een latent, hemibiotrophic levensstijl⁸, met infecties die zich voordoen tijdens de bloei en symptoom ontwikkeling niet merkbaar totdat de vruchten in de definitieve stadia van rijping^{9 zijn}. In bosbessen en cranberry, wordt vruchten rot alleen afdoende beheerst met fungicide toepassingen gemaakt tijdens de bloei periode. Het pathogene agens overwintert in slapende blueberry floral bud schalen¹⁰ en sporulates tijdens de bloei. Conidiën worden verplaatst gedurende de luifel via^11,12 van de versnippering van de regen-splash en entmateriaal opbouw heeft sterk is gecorreleerd aan de bloei periode¹³. Reactie van Colletotrichum soorten op host bloemen is niet uniek voor Vaccinium, zoals bloemen belangrijke onderdelen van citrus post bloei vruchten neerzetten zijn (PFD)¹⁴ evenals aardbei anthracnose¹⁵, in beide gevallen veroorzaakt het pathogene agens te sporulate. Al deze gevallen wijzen op de noodzaak van effectieve methoden om te evalueren van de temporele dynamiek van floral chemische signalen op C. fioriniae en andere pathogenen die tijdens bloei infecteren. De inzichten die geboden door de hier beschreven methoden worden steeds waardevoller.

Dit protocol gedetailleerd methoden van floral extract (FE) aanbestedingen en de evaluatie van C. fioriniae reacties op FE begeleidt via glas dekglaasje aan bioassays^15,16. De bloemen extractie technieken zijn onderverdeeld in twee hoofdtypen; Watergebaseerde extracties (actieve-FE, passieve (pass -FE) en veld regenwater gebaseerde (rw-FE)), en op basis van chloroform (ch-FE)¹⁷ extracties. De watergebaseerde extracties toestaan voor inspectie van water gemobiliseerd floral chemische signalen. Deze gemobiliseerde aanduidingen zijn waarschijnlijk belangrijke onderdelen van het Hof van de infectie, aangezien er FE verhoogt de snelheid van infectie¹⁶, naast het verstrekken van het vocht nodig zijn voor de infectie optreden. Bovendien vertegenwoordigen ze een meer natuurlijke toestand als floral stimulatie worden in de luifel tijdens bedplassen-evenementen zoals eerder waargenomen in bosbessen en andere gewas systemen^{14,16 gewassen kan}. Chloroform gebaseerde floral extracties (ch-FE) bieden ook waardevolle informatie met betrekking tot pathogen reactie op host oppervlak was^17,18, ophelderen van de vroege groeistadia van conidiën eenmaal gestort op gevoelig de organen van de host (d.w.z. bloemen, eierstokken en ontwikkelende fruit). Pathogen reactie op seizoensgebonden veranderingen in host oppervlakte wassen kan ook worden gecontroleerd met behulp van dit protocol. Dienovereenkomstig, de bioassays zijn afgestemd op het werken met waterbasis FE of chloroform gebaseerde FE te verzachten van de inherente verschillen tussen deze twee materialen.

De gegevens die zijn gegenereerd uit de bioassays geopenbaard dat waterbasis extracties hogere niveaus van secundaire conidiation dan chloroform gebaseerde extracties stimuleren waar er een definitieve appressorial antwoord, dus we meerdere verbindingen aanwezig in de FE. Interessant, werden beide van deze groei antwoorden waargenomen wanneer met behulp van regenwater dat had uitgevoerd off van bosbessen en cranberry bloemen, met vermelding van meerdere stimulerend verbindingen kan worden gewassen van het oppervlak van de bloemen. Dus, voor floral stimulatie zal verschaffen inzicht in de kans op succes van de pathogen in een landbouwsysteem.

Het uiteindelijke doel van dit protocol is bedoeld als een methode voor het genereren basislijn biologische informatie over schimmel plant ziekteverwekkers in reactie op floral chemische signalen, evenals de initiatiefnemende methodologieën die kunnen gebruiken deze bloemen informatie om te helpen bij Sitespecifiek beheer en besluitvorming ziekteprocessen.

Protocol

1. schimmel isolaten en Spore schorsingen

1. Colletotrichum fioriniae isoleren van een natuurlijk besmette gastheer¹⁹. Sla de schone culturen op maïsmeel agar (CMA) schuin. Plaats de stekker van de cultuur (van CMA inslag) op een standaard plastic cel cultuur schotel (9 cm diameter) met die een V8 sap agar (cV8A) (gewijzigd van Miller-1955), of niet-verduidelijkt V8 sap agar (V8A)²⁰verduidelijkt. Wanneer kolonies begint te sporulate, strijk conidiën (oranje conidial massa) naar een ander cV8A of V8A met cel cultuur schotel (met een standaard steriele lus) voor de productie van een high-density Sporulerende cultuur.
   Opmerking: Elk protocol stappen met schimmels moeten worden uitgevoerd in een laminaire flow kap om de mogelijkheid van besmetting van schimmel culturen en/of bioassays.
2. Na 7 dagen van de groei, met behulp van een standaard steriele lus een kleine hoeveelheid conidiën ophalen over de high-density cultuur (door het licht aanraken van de lus naar de conidial massa) en roer dit in een tube van 15 mL centrifuge met 10 mL steriel gedeïoniseerd water (SDW). Vortex in dit voorbeeld voor 10 s, vervolgens met behulp van een standaard pipet duik op en neer talloze malen aan verdere mix het monster.
3. Dan, breng een druppel van het monster van de vortexed op de hemocytometer en de raming van de spore concentraties. Graaf 5-10 velden op de hemocytometer, het gemiddelde verkrijgen en gemiddelde te vermenigvuldigen met de passende verdunningsfactor (d.w.z. 10.000), aldus het verkrijgen van de conidial concentratie per mL SDW.
4. Vervolgens met behulp van een volume (V) / concentratie (C) vergelijking (V₁● [C₁] = V₂● [C₂]) aanpassen (met SDW) 1,0 X 10⁵ conidiën per mL SDW met een eindvolume van 5 mL. Dit wordt aangeduid als de entsuspensie en alleen onmiddellijk vóór gebruik in beide bioassay is gemaakt.

2. actieve, waterbasis Floral extracten (actieve -FE)^15,16

Opmerking: Zie aanvullende figuur 1, aanvullende figuur 2, aanvullende figuur 3en aanvullende film 1.

1. Zorgvuldig hand-verzamelen bosbes (April-mei) en cranberry (juni-juli) bloemen tijdens de bloei van hun respectieve piek in het veld (aanvullende figuur 1). Draag en wijzigen van nitril handschoenen tussen bemonstering locaties (rassen/variëteiten/fysieke locaties) te remmen van menselijke huid olie verontreiniging, alsmede het Kruis besmetting tussen floral variëteiten. Plaats van de bosbessen of cranberry bloemen (uit een enkele bron) in plastic zakken (Vul een tas 100 x 150 mm) en onmiddellijk koelkast bij 4 ° C, zodra de bloemen zijn verzameld.
   Opmerking: De actief - extractie uit Leandro et al.is gewijzigd. (2003) ¹⁶.
2. Voorafgaand aan de winning, Verwijder eventuele verslechterde, beschadigde, zieke bloemen, dan met behulp van gezonde bloemen verwijderen van de eierstokken, de kelkbladen en de steeltjes met een gebogen Tang (45˚ pincet) en negeren. Gebruik alleen de overige organen (corolla, stigma, stijl en meeldraad) voor actieve- extracties uit te voeren. Knippen kaasdoek (150 x 150 mm) en plaatsen binnen een 7 x 7 mm-trechter, plaats in een centrifugebuis schone 50 mL en gereserveerd.
3. Combineren van 1 deel bloemen tot 9 delen SDW verwerkt (1 wt: 9 vol verhouding) in een mortier. Voorzichtig slijpen met een stamper voor 30 s (zorg aan de monsters niet volledig te verpulveren). Stam resulterende pulp door bereid kaasdoek/trechter en verzamelen in de centrifugebuis (50 mL). Schoon of gebruik nieuwe mortel/stamper tussen elke extractie met 95% EtOH en warm stromend water.
4. Bereiden van een vacuüm filtratie apparaat: verzamelen Buchner trechter, vacuüm filter conische kolf (maximaal 1000 mL capaciteit) 55 mm cirkel filtreerpapier en vacuüm slang/bron. Filtreerpapier toevoegen aan een passende formaat Buchner trechter en plaats bovenop de kolf dan apparaat verbinden met een water / zuignap bron via vacuümslang en zet opzij.
5. Verduidelijken de floral extracten van bosbessen door gedurende 10 minuten bij 8,055 x gcentrifugeren. Giet af supernatant in bereid vacuüm filter apparaat, zet vacuüm, bovendrijvende vloeistof filteren, dan giet inhoud van de kolf in een nieuwe centrifugebuis (50 mL). Reinig alle onderdelen van het apparaat tussen elke filtratie met 95% EtOH en warm stromend water. Verder filteren door middel van een spuit aangepast met een 0,22 µm poriegrootte, acetaat steriliseren, filter in een nieuwe centrifugebuis (50 mL).
   1. Voor de cranberry floral extracten, enige vacuüm filteren door filterpapier en giet inhoud van de kolf in een nieuwe centrifugebuis (50 mL).
6. Resulterende voorbereiding wordt aangeduid als actieve- floral extract (actieve -FE). Bewaren alle waterbasis floral extracten (actieve- passieve-, regenwater collecties) bij-20 ° C in 5-50 mL aliquots tot experimenteel gebruik. Herhaal extracties uit te voeren met meerdere monsters (ten minste 3 extracties per monster type) om wordt gerepliceerd.

3. passief , waterbasis Floral extracten ( pass -FE) ¹⁶

Opmerking: Zie aanvullende film 2.

1. Hand verzamelen hele blueberry bloemen (50 g) zoals hierboven, en na het verzamelen van koel. Voorafgaand aan de winning, Verwijder eventuele verslechterde, beschadigde, zieke bloemen en alleen de steeltjes van intact bloem. Koelkast bereid monsters totdat het passief - extractie systeem, hieronder beschreven, in de plaats is.
2. Spoel alle onderdelen vóór gebruik met 95% ethanol (EtOH) en warm stromend water om te voorkomen dat besmetting (netwave blad, twee netwave manden, glas brood pan en pomp mist fles). Ook bereiden een 4 laag kaasdoek/trechter/50 mL centrifugebuis voor elke extractie zoals hierboven beschreven (in stap 2.2), en de braaklegging.
3. Voorbereiden van de zeef: Leg een netwave vel (aka doorzichtig bar matten) in één netwave mand (114 x 102 mm). Plaats een tweede, identieke, mesh mand ondersteboven (omgekeerde) in een glas brood-pan (127 x 229 mm) (om de bloemen zitten in SDW) en plaats de Maas sheet met mand bovenop. Voeg 50 g van de voorbereide bloemen in de zeef.
   Opmerking: U kunt ook kleine reageerbuis [zuivering] manden kunnen worden gebruikt in plaats van de oorspronkelijk gebruikte netwave manden (oude, groene aardbei mesh pint manden zijn vaak moeilijk te bron).
4. Gelijkmatig mist bloemen met 250 mL met behulp van een pomp fles mist en afvoer in de glazen brood-pan vast te leggen. Vervolgens stam filtraat door de bereid kaasdoek/trechter in een schone centrifugebuis. Resulterende voorbereiding wordt aangeduid als passief- floral extract (pass -FE); opslaan als per boven (stap 2.6).
5. Reinig alle onderdelen tussen elke extractie met 95% EtOH en warm stromend water. Herhaal extracties uit te voeren met meerdere monsters te verstrekken wordt gerepliceerd (ten minste 3 per monster type).

4. chloroform gebaseerde Floral extracten (ch-FE) ¹⁷

1. Bosbes en cranberry bloemen als per boven (stap 2.1) verzamelen en bereiden van bloemen voor extractie (stap 2.2, zonder kaasdoek/trechter voorbereiding). Houd bereide bloemen gekoeld tot vóór gebruik.
   1. Geen werk uitgevoerd met chloroform moet worden uitgevoerd in een zuurkast om veiligheidsredenen. Dit omvat voorbereiding van materialen / glaswerk, extractie procedures en bioassay huidgeleiding (stappen met behulp van ch-FE).
2. Reinigen van alle onderdelen met 95% EtOH tweemaal en vervolgens tweemaal met chloroform om te voorkomen dat besmetting voor elke extractie: threaded glazen cultuur buizen, 2 glazen bekers, klein RVS scherm en een [glas] afgestudeerde cilinder. Gereserveerd voor droge ondersteboven. Spoel van polytetrafluorethyleen (PTFE) bekleed caps tweemaal met 95% EtOH alleen (chloroform beschadigt de buitenste materialen van het GLB) en zet opzij om te drogen.
3. Combineren van 1 deel verwerkt bloeit tot 9 delen chloroform (1 wt: 9 vol verhouding) in een bekerglas (bloemen dan chloroform), zachtjes swirl voor 30 s, en druk via een RVS-scherm in het bekerglas van de tweede. Ch-FE uit het tweede bekerglas giet in de glazen buis voor cultuur (10-15 mL) en brengt het GLB PTFE. Wikkel het GLB met parafilm ter voorkoming van verdamping.
4. Deze voorbereiding is het chloroform gebaseerde floral extract (ch-FE). Monster in duisternis (om aantasting van het licht) bij 4 ° C tot experimenteel gebruik opslaan. Herhaal extracties uit te voeren met meerdere monsters te verstrekken wordt gerepliceerd (ten minste 3 per monster type).

5. verzameling van regenwater van Blueberry bloemen (BB rw-FE)¹⁶

Opmerking: Het apparaat blueberry floral regenwater collectie bestaat uit een lucht spuitpistool wegwerp verf spray cup met verbinding adapter (cup: binnendraad, adapter: male-male draad), 50 mL centrifuge buizen (polypropyleen), parafilm en kunststof gecoate draden () standaard telefoonsnoer, individuele interne draad onderdeel inhoud).

1. Selecteer meerdere locaties binnen een bosbes bush te vangen regenwater aanloop van bloemen vóór het maken van de stroomafname-inrichtingen. Deze omvatten direct onder bloeiwijzen (bloem) aan de basis van de bush (kroon). Record diameter van de stammen (variërend van 1-5 cm) op geselecteerde locaties, als dit zal bepalen de grootte van de gaten gebruikt voor apparaat bevestiging, die hieronder worden beschreven.
2. Maak een collectie apparaat voor elke geselecteerde locatie. Boor een gat aan de onderkant van een kopje van de spray (waar de cup buigt naar de schroefdraad opening) met de bijbehorende diameter van de stam, eerst met een stap-bits gekoppeld aan een boor-pers. Knip dan, een rechte lijn vanaf de bovenkant van de thehole tot de monding van de spray-cup. Boorgaten 4 equidistante (groot genoeg om draad de plastic gecoate draad), aan de monding van de spray-cup, en sluit één uiteinde van de plastic gecoate draden videoconnectors gratis verlaten.
3. Boor een gat groot genoeg om de schroef van de verf adapter voor de kop van de sproeier in een 50 mL centrifuge GLB deksel. Adapter threads met parafilm om te voorkomen dat lekkende afdichting. Sluit dit aan zowel de centrifuge GLB en schroefdraad gedeelte van de sproeier cup. Bevestig de centrifugebuis erop 50 mL.
4. Herhaal stappen 5.3-5.4 om meerdere apparaten per geselecteerde locaties, een minimum van 4 stroomafname-inrichtingen per bemonstering locatie maken.
5. Implementeren apparaten op geselecteerde locaties door het buigen van de sproeier bekers om te passen op de stengels. De besnoeiing-kant van de spray-beker omhoog met behulp van de kunststof beklede draden aangesloten op andere stengels (om te verzekeren het water passeren over bloemen is opgevangen) oriënteren. Brengt parafilm alle openingen die regenwater lekken kunnen. (Aanvullende figuur 3, aanvullende figuur 4, aanvullende figuur 5en aanvullende figuur 6).
6. Label collectie buizen met implementatie datum / tijd. Na een regen-event, verwijder en vervang het bodemgedeelte (buis) van de centrifugebuis (label van datum / tijd van collectie). Afvoer collecties (bosbes regenwater floral extract (BB rw-FE) genoemd) binnen brengen en vacuüm filter (filtratie beschreven in stappen 2.4-2.5). Winkel als hierboven (stap 2.6), totdat in een bioassay waterbasis gebruikt.

6. verzameling van regenwater van Cranberry bloemen (CB rw-FE)

1. De bloemen regenwater collectie apparaat in cranberry bestaat uit een polypropyleen trechter van 7 X 7 cm, 50 mL centrifuge buizen (polypropyleen), parafilm, en 4 standaard, kunststof bekleed twist banden (per apparaat).
2. Eerst, warmte doorprikken 8 equidistante gaten (diameter van twist banden) rond de monding van de trechter met een metalen sonde. Draai banden invoegen met 4 gaten. Sluit de andere uiteinden aan dat gaten tegenovergestelde locatie, vormen een nette overschrijding patroon. Trechter down-stam met parafilm wrap en zet opzij.
3. Boor een gat groot genoeg is voor het invoegen van de trechter down-stam in een 50 mL centrifuge dop met een stap-bits. Bereid trechter invoegen in het GLB centrifuge. Herhaal stap 6.2-6.3 om meerdere apparaten, een minimum van 4 stroomafname-inrichtingen per bemonstering locatie maken.
4. Implementeren gelabelde (datum/tijd) apparaten in de geselecteerde cranberry moerassen. Netjes plooi twee bloem dragende bloeiwijzen (ook wel staanders genoemd) onder de gekruiste kunststof draai-banden. Verticaal oriënteren dan het apparaat door de centrifugebuis piercing in de cranberry luifel (aanvullende figuren 7-8, aanvullende Movie 3).
5. Na regenval of overhead irrigatie Verwijder en vervang het bodemgedeelte (buis) van de centrifugebuis (label van datum / tijd van collectie). Afvoer (cranberry regenwater floral extract (CB rw-FE) genoemd) binnen brengen en vacuüm filter (filtratie beschreven in stappen 2.4-2.5). Winkel als hierboven (stap 2.6), totdat in een bioassay waterbasis gebruikt.

7. de bioassay met behulp van Water gebaseerd Floral extracten^15,16 (actieve-FE, pass-FE, rw-FE)

Opmerking: Zie Figuur 1.

1. Deze bioassay wordt bereid in een laminaire flow-kap. Bereiden van de materialen: triple spoelen glas coverslips met 95% EtOH en lucht droog, dan opzij te zetten. Gesneden papier handdoek schijven aan de binnendiameter van een standaard plastic cel cultuur gerechten (9 cm). Plaatsen van 2 lagen papier schijven binnen cultuur gerechten en geniet met 2 mL SDW.
2. Bereiden ten minste 5 mL van een 1.0 X 10⁵ conidiën per mL SDW de entsuspensie (C. fioriniae) als per boven (stap 1.2-1.4), gereserveerd. Hierna sloeg Meng gelijke hoeveelheid SDW en waterbasis floral extract in 2 mL microcentrifuge buizen. Dan, voeg een gelijk volume van de entsuspensie aan de bereid 2 mL microcentrifuge buizen (SDW plus FE); de resulterende voorbereiding is een waterige behandelingsmengsel genoemd. Voor het besturingselement, FE gedeelte weglaten en vervangen door SDW, conidial concentraties om consistent te houden.
   N.B. de portiegrootte is afhankelijk van aantal replicatieonderzoeken en tijd-punten. Meestal gedeelten niet meer dan 500 µL. Zodra conidiën en FE worden gecombineerd is de bioassay begonnen, 0 h na inoculatie.
3. Plaats de coverslips vooraf gereinigd glas bovenop de doorweekte papieren handdoeken binnen de cel cultuur schotel. Plaats een droplet 40 µL van waterige behandelingsmengsel in het midden van een dekglaasje aan. Herhaal voor gewenste behandelingen, met inbegrip van het besturingselement, de cel cultuur schotel sluiten. Herhaal in aparte cel cultuur gerechten voor replicaties (ten minste 3) en tijd punten (elk gerecht is voor 1 punt van de tijd). Zodra alle behandelingen en replicaten hebben is afgezien, plaats alle gerepliceerde cel cultuur gerechten in een verzegelde plastic container (30 x 13 x 7 mm) en Incubeer bij 25° C in het donker.
4. Op vooraf bepaalde tijdstippen, voeg toe 10 µL van een hechtmiddel als lactophenol katoen-blauw (20,0 g fenol kristallen 20,0 mL 2,5% melkzuur, 40.0 mL glycerol, 0,05 g katoen blauw) aan de druppels, stoppen van groei en semi-behoud de mount.
   1. Wacht 2 h voor het verzamelen van de punt van de tijd 0 h zoals dit conidial hechting op het glasoppervlak kan maar niet lang genoeg voor conidial kiemkracht is. Voor alle andere tijdstippen, fixeerspray overeenkomstige keer toevoegen.
5. Zodra een hechtmiddel istoegevoegd; omkeren zorgvuldig de coverslips, plaatsen hen druppel zijde naar beneden op een microscoopglaasje van glas om microscopisch onderzoek (1 dekglaasje aan per dia). Wanneer alle coverslips op de glazen Microscoop dia's zijn, laat ze te regelen en gedeeltelijk droog in de kap van de stroom voor 20 min.
6. Graaf die alle conidiën (totale conidiën) presenteren op het dekglaasje aan (primaire conidiën, gekiemd conidiën en nieuw gevormde secundaire conidiën) evenals apressoria op beide 400 X vergroting (tellen 16 velden) of 200 X (tellen 4 velden), totaal een oppervlakte van 3.808 mm ². repliceren hele bioassay voor statistische analyse. Voor tests met behulp van watergebaseerde FE, analyseren gegevens zoals beschreven in Waller et al. 2017¹⁶, meestal weergeven als gemiddelde graaf/mm² (totale conidiën of apressoria).

8. de bioassay met behulp van Chloroform gebaseerde Floral extracten (ch-FE)¹⁷

Opmerking: Zie Figuur 2.

1. Bereiden van materialen en cel cultuur gerechten als per boven (stappen 7.1). Bovendien spoelen een gelijk aantal Van Tieghem cellen (Goodness. cellen) (8 mm OD, 6 mm ID) coverslips, evenals een glazen pipet (1 mL met 1 µl stappen) in een zuurkast (tweemaal met 95% EtOH vervolgens tweemaal met chloroform), en zet opzij.
2. Laminaire flow Hood, met behulp van een tube van 2 mL microcentrifuge twee gelijke delen (ten minste 500 µL gedeelten) van SDW en 1 deel van de entsuspensie toevoegen, dan opzij. Dit is het waterige behandelingsmengsel voor ch-FE bioassays.
3. Plaats een Goodness in een zuurkast. cel op een glas dekglaasje aan binnen de bereid kunststof cel cultuur schotel. Afzien (met glazen pipet) 33 µL van gewenste ch-FE in het midden van de cel Van T. (raak niet de muren van de Goodness. Cel; voor de behandeling van de controle, voeg Maagd chloroform), en laten drogen. Herhaal in aparte cel cultuur gerechten voor replicaties (ten minste 3).
4. Zodra de ch-FE is gedroogd, afzien van de 99 µL van het behandelingsmengsel bereid waterige met een standaard pipet in het midden van de Goodness. cel, dan sluiten alle celopmaak cultuur gerechten. Zodra het waterige behandelingsmengsel gekomen in contact met de gedroogde ch-FE-behandelingen, is de bioassay begonnen, 0 h na inoculatie.
5. Zodra alle behandelingen en replicaten hebben is afgezien, plaats alle (gesloten) cel cultuur gerechten in een verzegelde plastic container (30 x 13 x 7 mm) en Incubeer bij 25° C in het donker.
6. Op vooraf bepaalde tijdstippen, voeg toe 15 µL van een fixeer (lactophenol katoen-blauw) aan de Goodness. cel en laat zitten voor minstens 5 min om te verzekeren dat voldoende schimmel vlekken. Na die tijd, verwijder voorzichtig de Goodness. cel en stappen dekglaasje aan inversie en data acquisitie boven (stappen 7.5-7.6). Voor data-analyse, volg in Gager 2015¹⁷, meestal gegevens weergeven als appressorium formatie, die is de verhouding van totale conidiën te apressoria geteld in het gebied waargenomen (3.808 mm²) beschreven methoden.

9. cranberry fenologie gebaseerde extracties¹⁷

1. Hand cranberry bloemen verzamelen (in juni; 100 g), onrijp fruit (tweemaal; Juli en augustus; 200 g), en volwassen cranberry fruit bij de oogst (oktober; 200 g), plaats in de gepaste afmetingen plastic zakken en koelkast bij 4 ° C onmiddellijk na het verzamelen. Gebruik de besmetting voorzorgsmaatregelen hierboven (stap 2.1) beschreven.
   Opmerking: Er worden extra plantaardig materiaal verzameld op elk moment, maar deze bedragen hoeden uitpakken natuurlijk schimmel geïnfecteerde eierstokken en fruit (het tonen van symptomen en tekenen van ziekte).
2. Voorafgaand aan de winning, Verwijder eventuele verslechterde, beschadigde, zieke bloemen en vervolgens met behulp van alleen gezonde bloemen, verwijder de kelkbladen, bloemen, corollas, stigma's, stijlen en meeldraden met gebogen pincet (45 ° pincet) en gooi alle, maar de eierstokken. Zodra de eierstokken worden verzameld, voeren de chloroform gebaseerde extractie bij een 1 wt: 9 vol verhouding (Zie stappen 4.2-4.4, alleen eierstokken). Monsters opslaan totdat alle andere extracties voltooid zijn, dat wil zeggen tot bioassay geleidbaarheid.
3. Eenmaal fruit verzameld worden, uitvoeren van een extractie van chloroform gebaseerde (in stappen van 4.2-4.4, gebruikend verzamelde fruit in plaats van bloemen), maar Voeg 10 g fruit tot 90 mL chloroform en eenmaal gewonnen, kunnen de oplossing te laten verdampen tot 9 mL (wat resulteert in een 10 g: 9 mL wt : vol oplossing).
4. Maak fruit extracties onmiddellijk na het verzamelen in juli, augustus en oktober. Opslaan als per boven (stap 4.4) totdat alle extracties worden verzameld. Na de laatste vruchten chloroform gebaseerde extractie, onderwerpt alle Penologie gebaseerde chloroform extracten verzameld voor deze bepaling aan de bioassay chloroform gebaseerde en dienovereenkomstig analyseren (stappen 8.1-8.6).

Resultaten

De resultaten hier zijn een paar voorbeelden van de vele tests die kunnen worden uitgevoerd met gebruikmaking van deze methodiek. Figuur 1 is een geïllustreerde gids voor de bioassay FE waterbasis, en wordt aangevuld met Figuur 2 die op naar de chloroform gebaseerde FE bioassay volgt. Figuur 3 geeft een visuele gids voor wat kan worden verwacht op microscopische evaluatie van C. fioriniae op 24 h, in zowel water en chloroform-gebaseerde bioassays (ten opzichte van SDW controles). Figuur 4 details van een 24u-tijdsverloop studie met C. fioriniae in aanwezigheid van de cranberry verscheidenheid 'Stevens' ch-FE en geeft visuele verwijzing naar een resultaat van de import van dit onderzoek: FE daalde de tijd die nodig is om infectie ten opzichte van SDW. Figuur 5 biedt een voorbeeld van gegevens verzameld uit een dekglaasje aan bioassay met cranberry floral regenwater afvoer (CB "Flower" rw-FE). Figuur 6 is een ander belangrijk resultaat: floral eierstok ch-FE was veel meer stimulerend dan fruit ch-FE, het belang van bloom in de levenscyclus van C. fioriniae. De aanvullende foto's en films bieden belangrijke visuals van de bloemen gebruikt in de extracties en florale regenwater collectie apparaten/implementatie, naast films die de actief- en passief - extractie (visualiseren watergedragen) processen.

Figuur 1 : Algemeen overzicht van de waterbasis floral extract (FE) bioassay. Deze bepaling werd gebruikt voor watergedragen floral extracten met zowel bosbes en cranberry bloemen: actieve -floral extracten (actieve-FE), passief -floral extracten (pass-FE) en florale regenwater afvoer (rw-FE). De - FE gedeelte vormt meestal de experimentele/variabele factor. Omgekeerd de - FE gedeelte kan constant blijven en tijd punten/uren na inoculatie kan worden geëvalueerd. Voorkeur geboekt 4 veld analyse bij 200 X vergroting. Afkortingen: Steriel gedeïoniseerd water, SDW; Oppervlakte per gezichtsveld, A. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2 : Algemeen overzicht van de door de chloroform gebaseerde floral extract (ch-FE) bioassay. Deze bepaling werd gebruikt voor zowel bosbes en cranberry (bloemen, eierstokken en fruit). Slechts één soort waterige behandelingsmengsel werd gebruikt in deze test, 1 deel entsuspensie op 2 delen SDW (consistent te houden conidial concentratie als gevolg van verdamping van de ch-FE). Deze test kan worden gebruikt om meerdere ch-FE (wassen van verschillende plant oppervlakken), of meerdere tijd punten/uren na inoculatie met behulp van een enkele ch-FE te vergelijken. Afkortingen: Steriel gedeïoniseerd water, SDW; Van Tieghem [glas] cellen, Goodness. cel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3 : Visuele vergelijking van Colletotrichum fioriniae in aanwezigheid van watergebaseerde FE en ch-FE. In deze bepaling blueberry 'Bluecrop' (actieve-FE, waterbasis) (schimmel isolaat: BB #10) en cranberry 'Stevens' chloroform gebaseerde (ch-FE) (schimmel isolaat: CB-PMAP182) floral extracten werden vergeleken met SDW besturingselementen. Een dramatische toename van de secundaire conidiation (ringen) en appressorium vorming (pijlpunten) werden waargenomen bij het vergelijken van conidiën in aanwezigheid van SDW (control) (A) aan actieve-FE (B) op 24 h na inoculatie. Secundaire conidiation was echter niet zo herkenbaar bij het vergelijken van de chloroform bioassay SDW controle (C) naar ch-FE (D); Integendeel, C. fioriniae groei verschoven naar de vorming van de appressorial. Komt te staan is een gemeenschappelijke reactie op elk type van extractie, watergedragen en chloroform gebaseerde, ongeacht host/bloemen soorten beschreven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4 : Tijdsverloop studie (24 h) met Colletotrichum fioriniae in aanwezigheid van ch-FE. In deze test, zijn een SDW controle (A-D) en cranberry 'Stevens' ch-FE (E-F) visueel geïnspecteerd op 0, 6, 12 en 24 h na inoculatie (een voorbeeld van variabele tijd punten in plaats van het vergelijken van meerdere FE). Appressorium vorming (pijlpunten) begon op 6 h in de ch-FE en gestaag toegenomen hele latere tijdstippen. Deze resultaten ontsnapt aan een belangrijke factor voor pathogen biologie tijdens de periode van bloei: bloemen verminderen de tijd die nodig is om infectie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5 : Grafische weergave van gegevens die zijn verzameld met behulp van rw-FE in een bioassay. Regenwater aanloop van cranberry bloemen (CB "Flower" rw-FE) en maagdelijke regenwater dat niet elke cranberry plantaardige weefsels ("Ground" rw-FE) uit een enkele bedplassen-event plus een standaard actief, cranberry waterbasis floral extract (CB actieve had aangeraakt -FE) (positieve controle) en SDW (negatieve controle) werden onderworpen aan een dekglaasje aan waterbasis bioassay en geëvalueerd voor C. fioriniae groei. CB "Flower" rw-FE had hetzelfde niveau van secundaire vorming op het gebied van conidiation en appressorium als de standaard CB actieve-FE op 24u na inoculatie, die aangeeft dat de stroomafname-inrichtingen effectief waren in het vastleggen van floral stimulerende middelen uitgebracht tijdens een bedplassen-event. Totale conidiën bestaat uit primaire (gedeponeerd), conidiën en nieuw gevormde secundaire conidiën. Brieven geven significante verschillen op p < 0.05 volgens Fischers minst Significant verschil testen (LSD); hoofdletters, totale conidiën; kleine letters, apressoria. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 6 : Cranberry fenologie gebaseerd ch-FE bioassay, visuele inspectie. Beheer van de ziekte voor vruchten rot schimmels vaak impliceert bloei tijd fungicide toepassingen. Cranberry chloroform gebaseerde uittreksels (ch-FE) uit meerdere groeistadia van cranberry ('Stevens') werden hier, visueel beoordeeld voor het effect van oppervlakte wassen op C. fioriniae op 24 h na inoculatie. Eierstokken verzameld in juni (A), onrijpe vrucht verzameld in juli en augustus (B, C), geoogst fruit verzameld in oktober (D), en een SDW controle (E) voor appressorial vorming (pijlpunten) werden geïnspecteerd. Eierstok ch-FE had de grootste omvang van de appressorial formatie, die aangeeft dat deze plant fenologie (waas) kritisch belangrijk de levenscyclus van C. fioriniae is. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aanvullende figuur 1: Blueberry bloeiwijze. Blueberry bloemen werden verzameld voor extracties tijdens volle bloei (April-mei in New Jersey, Verenigde Staten) (zie afbeelding 'Bluecrop'). Opmerking de overlapping van corollas/eierstokken uit aangrenzende bloemen en de algemene architectuur van de bloeiwijze vergeleken met aanvullende figuur 2 (cranberry rechtop). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aanvullende figuur 2: Cranberry rechtop. Cranberry bloemen werden verzameld voor extracties tijdens volle bloei (juni-juli in New Jersey, Verenigde Staten) (zie afbeelding 'Stevens'). Opmerking de gevarieerde bloem etappes op een enkele cranberry bloeiwijze (rechtop), en de verslaafd, water druppel behoud van de vorm van de corolla. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aanvullende figuur 3: Blueberry regenwater implementatie (bloem). Blueberry floral regenwater collectie apparaat, geplaatst direct onder een cluster van bloeiwijzen voltooid. Opmerking de kunststof beklede draad gebruikt om het apparaat verticaal te oriënteren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aanvullende figuur 4: Blueberry regenwater implementatie (stam). Voltooide blueberry floral regenwater collectie apparaat, halverwege de stengel tussen een bloeiwijze en de kroon van de struik geplaatst. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aanvullende figuur 5: Blueberry regenwater implementatie (kroon). Blueberry floral regenwater collectie apparaat, geplaatst aan de basis van de bush (kroon) voltooid. Opmerking plastic gecoate draden kunnen worden verwijderd indien niet nodig. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aanvullende figuur 6: Blueberry regenwater implementatie (grond). Voltooid Maagd regenwater collectie apparaat, grenzend aan de bosbes struiken geplaatst. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aanvullende figuur 7: Cranberry regenwater implementatie (close-up). Cranberry floral regenwater collectie apparaat, aangevuld met twee staanders verscholen onder de netjes gekruiste draad banden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aanvullende figuur 8: Cranberry regenwater implementatie. Meerdere voltooid cranberry floral regenwater apparaten ingezet in een moeras. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aanvullende film 1: actieve, watergedragen floral extracten (actieve -FE). Aanvullende videosteun volgt 2.3-2.5.1. Blueberry 'Bluecrop' bloemen werden gebruikt. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Aanvullende Movie 2: passieve, waterbasis floral extracten (pass-FE). Aanvullende videosteun volgende stap 3.3-3.4. Blueberry 'Bluecrop' bloemen werden gebruikt. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Aanvullende Movie 3: implementatie van cranberry floral regenwater stroomafname-inrichtingen. Aanvullende videosteun volgende stap 6.4. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Discussie

De bioassays detecteren de C. fioriniae reactie op floral extracten (FEs) werden ontwikkeld met de bosbes en cranberry vruchten rot pathosystems maar kunnen gemakkelijk aangepast worden aan andere tuinbouwgewassen. Het protocol hierboven is waardevol in het verwerven van vele belangrijke verzamelingen van gegevens met inbegrip van, maar niet beperkt tot: FE effecten op meerdere isolaten van talrijke pathogenen, tijdsverloop informatie met betrekking tot de groei van zwammen stadia in de aanwezigheid van verschillende FEs, vergelijking van extractie technieken, inspectie van individuele chemische stoffen op de C. fioriniae groei en differentiatie, evaluatie van de individuele bloem orgel extracten, effecten van temperatuur op de C. fioriniae in aanwezigheid van FE, effecten van fenologie afhankelijke wax extracties en florale regenwater-effecten. Door het gebruik van deze technieken heeft gegevens gegenereerd ook een veel duidelijker begrip van C. fioriniae leven stadia en ten dele verklaart waarom de bloei periode zo belangrijk zijn voor de controle van veel fruit is, rotten van ziekteverwekkers.

In eerste instantie alle bloemen identiek zijn verwerkt op de actieve-FE, maar het extractieproces is verhuisd naar het gebruik van hele bloemen. Floral dissectie was tijdrovend en had weinig effect op de topicale van de resulterende Fez. Echter individuele floral organen kunnen en moeten zijn beoordeeld met behulp van dit protocol, maar grote zorg moet worden genomen om niet volledig maceraat de floral weefsels (aanvullende film 1, met de voorzorgsmaatregelen beschreven in stap 2.3), aangezien dit kan leiden tot vrijgegeven schimmels-giftig/static verbindingen in de FE die de microscopische evaluaties kunnen verstoren. Minder invasieve extracties zoals pass -zijn FE (aanvullende film 2) en rw-FE nu gunstiger vanwege hun gemak van acquisitie. Bovendien, vereisen deze extractie technieken alleen vacuüm filtratie te verwerven van biologisch actieve floral chemische signalen.

De bloemen gebruikt in alle extracties waren meestal gekoeld voor 0-3 dagen vóór de voorbereiding van het extract. Een uitdaging van dit protocol is tijdsbeheer van FE omzet (veld collectie door opslag van fragmenten). Dit werd verergerd door de talloze voorbeelden uit meerdere bronnen en datums. Bevroren bloemen zijn niet geëvalueerd in hoeverre elke echte, zoals ontdooide bloemen verslechterde en verkleurd verschijnen. Echter, zodra het FEs waterbasis zijn opgesteld, herhaald bevriezen en ontdooien blijkt geen effect op de topicale van de FE, dus zolang de FE zijn snel refrozen na bioassay voorbereiding (levensvatbare 3-jarige FE).

Chloroform gebaseerde extractie kan de onderzoek naar pathogeen reacties op driedimensionale bloemen/vruchten oppervlakte wassen in een twee-dimensionale vlak via ch-FE verdamping op glas coverslips. Het is echter onwaarschijnlijk dat de werkelijke kristallijnen structuren van wassen gestort van de ch-FE zijn identiek aan het oppervlak waaruit zij verzameld werden. Betekenis, aanvullende technieken moeten worden toegepast als schimmel reactie op specifieke wax structuren in vivo de belangrijkste focus van onderzoek zijn. Chloroform gebaseerde extracten nodig meer opslag onderhoud dan de extracties waterbasis. Naast het bijhouden van de ch-FE extracten in het donker, de cultuur van de cel van de PTFE bekleed tube caps en parafilm afdichten wrap moet regelmatig worden gecontroleerd voor de verdampingsemissie lekken en vervangen waar nodig.

Het concept van toezicht floral regenwater afvoer is geworteld in de idee van bevordering van site-specific ziekte controlehulpprogramma's. De stroomafname-inrichtingen van regenwater kunnen aangepast worden naar vele andere achitecturen van de plant, zolang het apparaat collectie vangt regenwater dat heeft aanloop van bloemen. Deze aanpak biedt informatie over wel of niet floral stimulatie is aanwezig in het veld op een bepaald moment en kan worden gecontroleerd gedurende het gehele seizoen. Anderzijds kunnen stroomafname-inrichtingen worden geïmplementeerd op meerdere locaties van de luifel om te bepalen hoe ver floral signalen zijn gewassen tijdens een gegeven bedplassen-event. In de toekomst experimenten, rw-FE zal dicteren waarop fungicide toepassingen moeten beginnen en wanneer zij veilig kunnen eindigen. Bovendien, door monitoring fenologie afhankelijke wax extracties (protocol sectie 9), is het belang van de bloei periode tot pathogen biologie geworden nog duidelijker. Dat gedeelte werd ook opgenomen om aan te tonen van de flexibiliteit van deze bioassays, verstrekken van methoden waarmee voor side-by-side vergelijking van host oppervlakte wassen die stoffelijk zijn gescheiden. De gegevens die zijn gegenereerd met de floral extractie technieken en bioassays vertegenwoordigen concrete indicatoren van pathogen stimulatie, specifieke chemische klassen moeten pathogen biologie, en doelstellingen voor de toekomstige bestrijdingsstrategieën.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.22 µm pore size, acetate sterilizing filter	VWR	101102-280	Blueberry floral extract (FE) clarification
200-1000 µl pipette with tips	-	-	Equipment, any make within range will be adequate
40-200 µl pipette with tips	-	-	Equipment, any make within range will be adequate
5-40 µl pipette with tips	-	-	Equipment, any make within range will be adequate
Air spray gun disposable paint spray cup with connection adapter	Harbor Freight	97098	Blueberry rainwater (rw-)FE collection
Autoclave	Amsco	3011	Equipment, media preparation
Bar mesh matting (plastic mesh sheet)	Winco	BL-240	Passive (pass)-FE collection
Benchtop timer	Fisher Scientific	06-662-47	Equipment, FE preparation
Black pressure/vacuum hose	VWR	62994-795	Vacuum filter component
Buchner funnel	Coors USA	60240	Vacuum filter component, accepts 55 mm filter paper disks
Bunsen burner	-	-	Equipment
Calcium carbonate	Fisher Scientific	C64-500	Media component
Centrifuge	Sorvall	RC 5B Plus	Equipment
Centrifuge tubes (15 ml)	Fisher Scientific	05-527-90	Equipment
Centrifuge tubes (50 ml)	VWR	10025-694	Equipment, rw-FE collection
Cheesecloth (grade 50)	Fisher Scientific	AS240	Equipment, FE preparation
Chloroform	VWR	JT9175-3	Chemical, trichloromethane: assay grade, ≥ 99% pure, for molecular biology, peroxide-free
Corn Meal Agar (CMA)	Fisher Scientific	B11132	Pre-mix media, isolate storage on slants
Cotton-blue stain	Sigma-Aldrich	61335	Lactophenol cotton-blue stain
Difco Agar	VWR	90004-032	Media component
Drill-press	Delta	-	Equipment, rw-FE collection
EASYpure LF Ultrapure water	Barnstead	D738	Equipment, deionized water source
Ethanol (95%)	-	-	Chemical
Filter flask (500 ml)	Pyrex	No. 5340	Vacuum filter component
Fume hood	Hamilton	-	Equipment, chloroform usage
Funnel (7 X 7 cm)	VWR	60820-110	Cranberry rw-FE collection, FE preparation
Generic glass slide	Fisher Scientific	22-038-101	Bioassay conductance
Generic plastic pump spray bottle	VWR	16126-454	pass-FE collection, at least 250 ml capacity
Glass cell culture tubes	-	-	Storage of ch-FE
Glass coverslips (22 x 22 mm)	Fisher Scientific	12-542B	Bioassay conductance
Glass Van Tieghem cells (hand cut glass tubes)	-	-	Chloroform (ch)-FE bioassay, (8 mm OD 6 mm ID)
Glass-pipette (1-100 µl)	Hamilton Co. Inc.	#710	ch-FE bioassay
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Lactophenol cotton-blue stain
Hemocytometer	Bright-Line	5971R10	Equipment
Lactic acid	Sigma-Aldrich	W261106	Lactophenol cotton-blue stain
Laminar flow hood	Labconco	3730400	Equipment, sterile work environment
Metal probe (generic)	-	-	Equipment
Microcentrifuge tubes (2 ml)	Fisher Scientific	05-408-138	Aqueous treatment mixture storage and preparation
Microscope, Leica DMLB	Leica	020-519.010	Equipment
Mortar (ceramic)	Coors USA	60313	Vacuum filter component
Nitrile gloves	Fisher Scientific	19-130-1597D	Flower collection
Paper disks (cut paper towels)	Office Basics	KCC01510	humidity control in bioassay
Parafilm	Bemis	PM-996	Plastic paraffin film
Pestle (ceramic)	Coors USA	60314	Vacuum filter component
Phenol crystals	Fisher Scientific	A92-100	Lactophenol cotton-blue stain
Plastic bags (~100 mm X 152 mm)	Uline	S1294	Equipment, flower refrigeration
Plastic cell culture dishes (9 cm diameter)	Fisher Scientific	FB0875712	(Petri dish), bioassay conductance
Polytetrafluoroethylene (PTFE) lined caps	VWR	60927-228	Storage of ch-FE
Pyrex beakers (100 ml)	Pyrex	No. 1000	Preparation of ch-FE
Pyrex bread-pan	-	-	pass-FE collection
Pyrex graduated cylinder	-	-	Equipment, FE preparation
Sealed plastic container (30 mm X 13 mm X 7 mm)	-	-	Bioassay conductance
Sharp-pointed dissecting scissors	Fisher Scientific	8940	Equipment, to cut cheese-cloth and paper disks
Stainless steel mesh strainer	VWR	470149-756	Preparation of ch-FE
Step drill bit (step-bit)	Dewalt	-	Equipment, rw-FE collection
Sterile loop (combi-loop)	Fisher Scientific	22-363-602	Culture preparation
Telephone wire (internal wires)	-	-	Blueberry rw-FE collection
Test tube basket	VWR	470137-792	Readily available substitution for plastic mesh [strawberry] basket
V8 Juice	Campbell's Soup Company	-	Fungal media component
Vintage plastic mesh [strawberry] baskets	Donation	-	pass-FE collection, can substitute for test tube basket (470137-792)
Vortex Genie (Vortex)	Fisher Scientific	12-812	Spore suspension preparation
Whatman No. 1 Qualitative 55 mm circles	Whatman	1001-055	Vacuum filter component