Methodenartikel

Bio-energetica onderzoek naar Candida albicans met behulp van Real-time extracellulaire Flux Analysis

6.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58913

⸱

19 maart 2019

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Biochemistry and Molecular Genetics, New Jersey Medical School, Rutgers, The State University of New Jersey, 2Public Health Research Institute, Rutgers, The State University of New Jersey

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een stapsgewijze protocol om te onderzoeken de mitochondriale ademhaling en de glycolytic functie in Candida Albicans met behulp van een extra flux-analyzer.

Samenvatting

Mitochondriën zijn essentiële organellen voor het cellulaire metabolisme en het voortbestaan. Een aantal belangrijke gebeurtenissen plaatsvinden in de mitochondriën, zoals cellulaire ademhaling, oxidatieve metabolisme, signaaltransductie en apoptosis. Bijgevolg, mitochondriale dysfunctie wordt gemeld dat een belangrijke rol spelen in de antischimmel drug tolerantie en de virulentie van pathogene schimmels. Recente gegevens hebben ook geleid tot de erkenning van het belang van het mitochondrium als een belangrijke bijdrage geleverd aan schimmel pathogenese. Ondanks het belang van de mitochondriën in de schimmel biologie, zijn gestandaardiseerde methoden om haar functie te begrijpen slecht ontwikkeld. Hier presenteren we een procedure om te bestuderen van de basale zuurstof verbruik tarief (OCR), een maatregel van de mitochondriale ademhaling en extracellulaire verzuring tarieven (ECAR), een maatregel van glycolytic functie bij C. albicans stammen. De hier beschreven methode kan worden toegepast op alle stammen Candidaspp. zonder de noodzaak voor het zuiveren van de mitochondriën van de intact schimmel cellen. Bovendien, dit protocol kan ook worden aangepast aan het scherm voor remmers van mitochondriale functie in C. albicans stammen.

Inleiding

Invasieve schimmelinfecties doden meer dan 1,5 miljoen mensen per jaar wereldwijd. Dit nummer is op de stijging te wijten aan een toename in het aantal mensen met gecompromitteerde immuniteit, met inbegrip van de bejaarden, premature zuigelingen, transplantatie ontvangers en kanker patiënten1. C. albicans is een opportunistische menselijke schimmel pathogeen die een deel uitmaakt van de menselijke darmflora. Hij bewoont ook mucosal oppervlakken en het maag-darmkanaal als een commensale organisme. C. albicans produceert ernstige systemische ziekte bij mensen met immuun tekortkomingen, die een operatie hebben ondergaan, of die zijn behandeld met lange cursussen van antibiotica. De Candida soorten behoren tot de top drie tot vier oorzaken van nosocomiale infectieziekten (NID) in mens2,3,4,5,6,7. Het jaarlijkse globale aantal Candida bloedbaan infecties wordt geschat op 400.000 ~ gevallen, met bijbehorende sterfte van 46-75%1. De jaarlijkse sterfte vanwege candidiasis is ongeveer 10.000 in de Verenigde Staten alleen. De omvang van NID veroorzaakt door schimmels wordt ook weerspiegeld in astronomische geduldige kosten5. In de Verenigde Staten overtreft de jaarlijkse kosten voor de behandeling van invasieve schimmelinfecties 2 miljard dollar, een enorme spanning toe te voegen aan de toch al overbelaste systeem van de gezondheidszorg. Momenteel zijn beschikbare standaard antischimmel therapieën beperkt vanwege toxiciteit, steeds meer voorkomende resistentie en interactie van de drug-drug. Daarom is er dringend behoefte aan nieuwe antischimmel drug targets die in betere behandelingsopties voor hoog-risico patiënten resulteren zal identificeren. Echter is de ontdekking van nieuwe drugs op schimmel doelstellingen ingewikkeld omdat schimmels, eukaryoten zijn. Dit beperkt aanzienlijk het aantal schimmel-specifieke drug targets.

Recente studies hebben aangegeven dat de mitochondriën zijn een essentiële bijdrage aan de schimmel virulentie en tolerantie tot antischimmel geneesmiddelen Aangezien mitochondriën belangrijk voor cellulaire ademhaling, oxidatieve metabolisme, signaaltransductie en apoptosis8 zijn ,9,10,11. Zowel de glycolytic als de niet-glycolytic metabolisme zijn essentieel voor het voortbestaan van C. albicans in de zoogdieren host12,13,14,15,16. Bovendien is verschillende C. albicans mutanten ontbreekt mitochondriale eiwitten, zoals Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 etc. gebleken dat defect in filamentation, een belangrijke virulentiefactor van C. albicans17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Bovendien deze mutanten waren ook aangetoond worden verzacht voor virulentie in een muismodel van verspreid candidiasis17,18,19,20,21 ,22. Dus, schimmel mitochondriën vertegenwoordigen een aantrekkelijk doelwit voor drugontdekking. Echter, de studie van mitochondriale functie in C. albicans is uitdagend omdat C. albicans petite negatieve23, wat betekent is dat het kan niet zonder het mitochondriaal genoom overleven.

Hier beschrijven we een protocol dat kan worden gebruikt voor het onderzoeken van mitochondriale en glycolytic functie in C. albicans zonder de noodzaak voor het zuiveren van de mitochondriën. Deze methode kan ook worden geoptimaliseerd voor het onderzoek naar het effect van de genetische manipulatie of chemische modulatoren op mitochondriale en glycolytic trajecten in C. albicans.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Opmerking: De gedetailleerde stapsgewijze protocol van de test is hieronder beschreven, en het schematisch protocol is afgebeeld in Figuur 1.

1. C. albicans spanningen en groei-omstandigheden

  1. Groeien de C. albicans stammen in vloeibare gist Extract-pepton-Dextrose (YPD) medium bij 30 °C in een broedstoof shaker's nachts.
    Opmerking: Candida stammen als bevroren voorraden te handhaven en te groeien op YPD agar (gistextract 1%, 2% pepton, dextrose van 2% en 2% agar).

2. bereiding van reagentia

  1. Het medium assay als volgt voorbereiden:
    1. Voor mitochondriale functie assay, los 1.04 g Roswell Park Memorial Instituut (RPMI) 1640 poeder en 2 g glucose (2%) in 90 mL steriel water en warm de media tot 37 ° C. Breng de pH op 7.4 met 5 M NaOH en make-up van het volume met steriel water tot 100 mL.
    2. Voor glycolytic stress assay, los 1.04 g RPMI 1640 poeder alleen in 90 mL steriel water, warm de media tot 37 ° C en breng de pH op 7.4. Waaruit het volume met steriel water tot 100 mL. RPMI 1640 poeder heeft geen bicarbonaat, die essentieel zijn voor het controleren van de pH-verandering als een maatregel van glycolyse tijdens de test.
  2. Injectie verbindingen.
    1. Bereiden van 1 M glucose stock in steriel water en winkel bij-20 ° C.
    2. Bereiden van 100 mM oligomycin voorraad in dimethylsulfoxide (DMSO), aliquoot in kleine volumes en opgeslagen bij-20 ° C.
    3. 100 mM antimycin A voorraad in DMSO, aliquoot in kleine hoeveelheden voor te bereiden en op te slaan bij-20 ° C.
    4. 100 mM SHAM (salicylhydroxamic zuur) voorraad in ethanol voorbereiden op de dag van de test.
    5. Bereiden 1 M KCN op in de steriel water op de dag van de test.

3. coating van de plaat assay met Poly-D-Lysine (PDL)

Opmerking: Alle uitvoeren de onderstaande stappen in een laminaire kap.

  1. Poly-D-Lysine in weefselkweek rang water zodat 50 µg Mo/mL eindconcentratie ontbinden. Meng het goed en aliquoot in een 1,5 mL microcentrifuge buizen en opgeslagen bij-20 ° C voor de lange termijn.
    Opmerking: 50 µL per putje nodig is, en voor 24 putten, 1,2 mL is vereist. Daarom aliquot ten minste 1,3 mL per microcentrifuge buis.
  2. Voeg 50 µL per putje en Incubeer bij kamertemperatuur met het deksel gedekt voor 1-2 h.
  3. De oplossing gecombineerd en één keer met 500 µL steriele weefselkweek rang water spoelen.
  4. Open het deksel en laat de putten in de lucht droog. Gebruik de plaat op de dezelfde dag of bewaren bij 4 ° C voor een maximum van 2-3 dagen.

4. de hydratatie van sensor cartridge

Opmerking: Deze stap uitvoeren, één dag voor het experiment.

  1. Open de extra flux Assay Kit en verwijder de inhoud. Plaats de sensor cartridge ondersteboven naast de utility plaat (Figuur 2).
  2. Vul elk goed van de utility plaat met 1 mL kalibrant en plaats de sensor cartridge terug. Zorg ervoor dat de sensoren die fluorophores bevatten (voor het meten van de zuurstof en pH) zijn ondergedompeld in de kalibrant.
  3. Incubeer de sensor cartridge's nachts in een niet-CO2 -incubator bij 37 ° C.

5. het kweken en zaaien van de cellen in de PDL-gecoate platen

  1. Inoculeer C. albicans in de YPD Bouillon en 's nachts groeien bij 30 ° C in een shaker bij 200 omwentelingen per minuut.
    Opmerking: Gebaseerd op het ontwerp van de bepaling en de rente, kunnen C. albicans ook worden gekweekt in YPG of minimaal medium.
  2. Verdun op de dag van de test, een voldoende aantal cellen in de assay middellange tot een uiteindelijke concentratie van 100.000 cellen per 100 µL opleveren.
  3. Voeg 100 µL van de verdunde cellen in elk putje van de plaat assay behalve putten A1, B4, C3 en D6, waarin slechts 100 µL van het medium assay voor achtergrondcorrectie (Figuur 3) toevoegen.
  4. De plaat overbrengen in een niet-CO2 -incubator bij 37 ° C en incubeer gedurende 60 min, waarmee de cellen die voldoen aan het oppervlak van de plaat.

6. assay Protocol

Opmerking: Het protocol hier geschetst is voor de indeling van de 24-well van het instrument. Volumes zal moeten worden aangepast indien een andere indeling wordt gebruikt.

  1. Mitochondriale functie assay
    1. Voorbereiding van verbindingen
      1. Verbindingen met 10 x concentratie voor mitochondriale functie assay bereiden: bereiden van 20 mM SHAM, 100 µM Oligomycin, 100 mM KCN, en 20 µM Antimycin A in het overeenkomstige assay-medium.
      2. Voeg 50 µL SHAM in de A-poort, 55 µL Oligomycin op poort B, 62 µL KCN op poort C en 68 µL Antimycin A op poort D (Figuur 4).
  2. Glycolytic stress test
    1. Voorbereiding van verbindingen
      1. Verbindingen met 10 x concentratie voor glycolytic stress assay voor te bereiden. Bereiden van 100 mM glucose, 100 µM Oligomycin, 500 mM 2-Deoxy Glucose (2DG) en 20 µM Antimycin A in het overeenkomstige assay-medium.
      2. Voeg 50 µL glucose in poort A, 55 µL Oligomycin op poort B, 62 µL 2-DG op poort C en 68 µL Antimycin A op poort overleden
  3. Dienst extra flux analyzer, die zuurstof verbruik rente (OCR) en extracellulaire verzuring (ECAR) van levende cellen in de indeling van een 24-well plaat meet. Het test protocol vooraf instellen.
  4. Open de extra flux analyzer en de assay sjabloon instellen met behulp van het tabblad assay wizard en volg stap voor stap instructie om alle informatie die uit tijdens de installatie springt in te vullen. Genereren de groep lay-out zoals gelijkaardig aan afgebeeld in Figuur 5. Het protocol instellen zoals weergegeven in tabel 1. Deze indelingen goed vooruit voordat assay instellen en opslaan in de computer. Op het moment van de test, het opgeslagen protocol te herstellen door het bijbehorende bestand te openen in de optie bestand openen op het tabblad wizard assay (Figuur 5).
  5. De 10 x-verbindingen in de respectieve havens van het patroon van de gehydrateerd sensor met de kalibrant geladen en geladen in de lade van de drager van de extra flux-analyzer. Start de calibratie door te drukken op de knop Start op het scherm.
  6. 350 µL van het medium assay zachtjes aan de plaat van de cel langs de kant van de putten om te minimaliseren van de verstoring van de cel om het eindvolume te 450 µL toevoegen.
  7. Vervang de hulpprogramma-plaat met de kalibrant met de assay-plaat en blijven.
  8. Verwijder de cartridge sensor en de plaat zodra de test is voltooid. Sla het bestand in de juiste doelmap.

7. de gegevensanalyse

  1. Het gebied onder de curve - variantieanalyse (AUC-ANOVA) tabblad analyse in de software gebruiken voor het berekenen van het aanzienlijke verschil tussen de groepen door het selecteren van de respectieve parameters (OCR of ECAR) zoals aangegeven in Figuur 6.
  2. Selekteer de groepen die moeten worden vergeleken.
  3. Toevoegen aan de groepen van de analyse voor ANOVA en klik op Ok.
    Opmerking: Deze AUC ANOVA analyse zal toevoegen een nieuw blad naar het bestand waarin de AUC is berekend voor elke groep en vergeleken tussen hen door ANOVA. Hierdoor wordt een tabel van p-waarden om te laten zien van de betekenis.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De focus van dit protocol is het bepalen van de bio-energetische functies van C. albicans beoordeeld door extra flux analyzer. Een C. albicans mutant ontbreekt mitochondriale eiwit Mam33 is ook opgenomen samen met haar aanvulling stam, mam33Δ/Δ::MAM33 te bestuderen van de gevolgen van de schrapping van een mitochondriale eiwit voor OCR en ECAR. MAM33 codeert voor een eiwit putatief mitochondriale zure matrix en zijn functie bij Candida is niet ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De Bioenergetica extra flux assay dient als een uitstekend middel om het voorlezen van de mitochondriale functie door het meten van de oxidatieve fosforylatie (OXPHOS)-afhankelijke zuurstofverbruik in real-time. Daarnaast kan ook een glycolytic functie die wordt gemeten als een percentage van de extracellulaire verzuring (estafetteovergave in de extracellulaire pH) tegelijkertijd in real-time analyse te worden onderzocht.

Succesvolle beplating van C. albicans in de assay-plaat is een ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen

Dankbetuigingen

Onderzoek in NC lab is gesteund door een subsidie van de National Institutes of Health (NIH) R01AI24499 en een New Jersey Health Foundation (NJHF)-grant, #PC40-18.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
RPMI 1640CorningMT50020PB
Antimycin ASigmaA8674
KCN
Mito stress kitAgilent103015-100
OligomycinCalbiochem495455
pH meterAccumetAR20
Phenol redSigmaP5530
Poly-D lysineSigmaP6407
RotenoneSanta cruz203242
Seahorse XF24 FluxPakAgilent100850-001
SHAM
Sodium ChlorideAmresco 241
Sodium hydroxie pelletsJ.T Baker3722
Tissue culture grade waterGibco1523-0147
XF assay calibrant solutionAgilent100840-000
Yeast extract Peptone DextroseFisher scientific,BP2469
Yeast extract Peptone Dextrose AgarSigmaA1296
Yeast extract Peptone GlycerolSigmaG2025

Referenties

  1. Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).
  2. Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).
  3. Ascioglu, S., et al. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).
  4. Stover, B. H., et al. Nosocomial infection rates in US children's hospitals' neonatal and pediatric intensive care units. American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).
  5. Wilson, L. S., et al. The direct cost and incidence of systemic fungal infections. Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).
  6. Wenzel, R. P. Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality. Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).
  7. Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities. Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).
  8. Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. M. Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (7), 1272-1279 (2008).
  9. Shingu-Vazquez, M., Traven, A. Mitochondria and fungal pathogenesis: drug tolerance, virulence, and potential for antifungal therapy. Eukaryotic Cell. 10 (11), 1376-1383 (2011).
  10. Brown, A. J., Brown, G. D., Netea, M. G., Gow, N. A. Metabolism impacts upon Candida immunogenicity and pathogenicity at multiple levels. Trends in Microbiology. 22 (11), 614-622 (2014).
  11. Tucey, T. M., et al. Glucose Homeostasis Is Important for Immune Cell Viability during Candida Challenge and Host Survival of Systemic Fungal Infection. Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).
  12. Barelle, C. J., et al. Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).
  13. Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).
  14. Fradin, C., et al. Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood. Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).
  15. Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages. Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).
  16. Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes. Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).
  17. Bambach, A., et al. Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence. Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).
  18. Li, D., et al. Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death. Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).
  19. Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence. Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).
  20. Mavrianos, J., et al. Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).
  21. Koch, B., et al. The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans. Frontiers in Microbiology. 8, 2555(2017).
  22. Qu, Y., et al. Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence. Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).
  23. Brandt, M. E. Candida and Candidiasis. , American Society for Microbiology Press. book review (2002).
  24. Huh, W. K., Kang, S. O. Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans. Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).
  25. Yan, L., et al. The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).
  26. de Moura, M. B., Van Houten, B. Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay. Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Mitochondri le respiratieglycolytische functiezuurstofconsumptiesnelheidextracellulaire verzuringssnelheidmitochondri le inhibitorenschimmelpathogenesebio energetische assaysensorkit

Gerelateerde artikelen