Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Evaluatie van de Host-Pathogen reacties en werkzaamheid van het vaccin in muizen

10K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58930

⸱

22 februari 2019

 ,  ,  , 
1Department of Microbial Infection & Immunity, The Ohio State University, 2Department of Microbiology, The Ohio State University

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een elegante protocol voor in vivo evaluatie van vaccin effectiviteit en host immuunrespons. Dit protocol kan worden aangepast voor vaccin modellen die studeren virale, bacteriële of parasitische ziekteverwekkers.

Samenvatting

Vaccins zijn een 20th century medisch wonder. Ze hebben drastisch verminderd de morbiditeit en mortaliteit veroorzaakt door infectieziekten en bijgedragen tot een opvallende toename van de levensverwachting rond de hele wereld. Bepaling van de werkzaamheid van het vaccin blijft echter een uitdaging. Opkomende bewijs suggereert dat de huidige Acellulair vaccin (aPV) voor Bordetella pertussis (B. pertussis) suboptimaal immuniteit induceert. Daarom een belangrijke uitdaging is het ontwerpen van een volgende generatie vaccin dat protectieve immuniteit zonder de negatieve bijwerkingen van een geheel-cel vaccin (wPV induceert). Hier beschrijven we een protocol dat we gebruikt om te testen van de werkzaamheid van een veelbelovende, roman adjuvans immuun reacties op een beschermende Th1/Th17 fenotype scheef en promoot een betere Goedkeuringvande een uitdaging van B. pertussis uit de lymfkliertest luchtwegen. Dit artikel beschrijft het protocol voor muis immunisatie, bacteriële inoculatie weefsel oogsten en analyse van de immuunrespons. Met behulp van deze methode, binnen ons model, hebben wij met succes cruciale mechanismen ontlokte door een veelbelovende, volgende-generatie Acellulair kinkhoest vaccin toegelicht. Deze methode kan worden toegepast op elke infectieziekte model om te bepalen van de werkzaamheid van het vaccin.

Inleiding

Vaccins vertegenwoordigen een van de grootste verworvenheden van de volksgezondheid van de 20e eeuw, maar we nog steeds niet volledig begrijpen de mechanismen waarmee succesvolle vaccins protectieve immuniteit stimuleren. De identificatie van moleculaire signaturen (bv., cel activatie markeringen, uitbreiding van cellulaire subtypen en patronen van genexpressie) veroorzaakt na vaccinatie een overvloed aan informatie biedt voor het voorspellen en het genereren van een doeltreffend immuunrespons. De complexiteit van de gastheer-pathogeen reacties kan niet voldoende worden gerepliceerd met behulp van in vitro cel cultuur systemen1. In vivo vaccin modellen zijn ontworpen om gelijktijdig meerdere soorten van immuun cellen binnen de host te evalueren. Dit biedt een voordeel wanneer karakteriseren vaccin antigeen verwerking en presentatie, differentiële cytokine secretie en uitbreiding van immuuncellen. Het protocol hier beschreven biedt een gedetailleerde methode om te bepalen van de werkzaamheid van het vaccin door evaluatie van de systemische en lokale immuunrespons en kwantificering van pathogen last in weefsels van belang. In het hier gegeven voorbeeld test de werkzaamheid van een experimenteel vaccin voor het pathogene agens Bordetella pertussis (B. pertussis).

B. pertussis is een gram-negatieve bacterie die is het etiologische agens van de respiratoire aandoeningen kinkhoest (pertussis)2,3. Nauw contact met besmette personen (symptomatisch of asymptomatisch) leidt tot transmissie, kolonisatie, en ziekte. Ondanks de aanzienlijke wereldwijde vaccin dekking4, kinkhoest wordt beschouwd als een resurging ziekte in veel landen over de hele wereld en is een belangrijke oorzaak van vermijdbare jeugd sterfgevallen5,6,7, 8. in 2015, B. pertussis en kinkhoest werden opgenomen in het nationale Instituut van allergie en besmettelijke ziekten (NIAID) opkomende infectieziekten pathogenen/lijst, nadruk op de behoefte aan ontwikkeling van een beter vaccin dat verleent langlevende protectieve immuniteit.

Een actief gebied van onderzoek bepalen van pertussis heropleving is momenteel de ontwikkeling van een vaccin (aPV) van de volgende generatie Acellulair kinkhoest met een optimale combinatie van roman hulpstoffen en antigenen om na te bootsen de immune reactie ontlokte door de geheel-cel kinkhoest vaccin (wPV)9. Met behulp van het protocol beschreven, we onlangs gemeld dat de wijziging van een huidige FDA-goedgekeurde aPV door toevoeging van een nieuwe adjuvans, Bordetella kolonisatie factor A (BcfA), resulteerden in efficiëntere daling van B. pertussis bacteriële verontreiniging vanaf muis longen10,11. Deze verhoogde bescherming werd vergezeld door het scheeftrekken van een aluin-geïnduceerde Th1/Th2 immune reactie op het meer beschermende Th1/Th17 immuun profiel10. Dit protocol is gedetailleerde en uitgebreide, waardoor de onderzoeker maximale informatie verkrijgen door de gelijktijdige evaluatie van host- en immuun reacties op een scala aan pathogenen.

Het protocol beschreven hier volgt het schema van de representatieve vaccin, afgebeeld in Figuur 1, om de optimale host immuunrespons.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten met levende dieren werden uitgevoerd volgens een protocol goedgekeurd door de Ohio State University IACUC volgens IACUC richtlijnen. C57BL/6 muizen werden gebruikt in alle inentingen en infecties. Zowel vrouwelijke als mannelijke muizen worden gebruikt in elke groep per NIH richtsnoeren. Het aantal dieren per groep werd bepaald door macht berekeningen gebaseerd op de voorspelde verschillen in uitkomst tussen experimentele groepen. Bijvoorbeeld 8 muizen per groep levert 80% vermogen bij α = 0,05 (2-zijdig) voor een 2-sample t- test voor de opsporing van verschillen in de uitkomst van het belang van 1,33 standaarddeviaties (SDs).

1. de immunisatie van muizen

  1. Een mix van de meester vaccin in een steriele fysiologische buffer zoals zoutoplossing bereiden of DPS.
    Opmerking: Het totale volume in de mix moet zijn inclusief 10% meer dan die nodig voor immunisatie van de hele groep. Concentraties van de samenstelling van het vaccin zijn hieronder in stappen 1.1.1 en 1.1.2. Vervoer de items naar de vivarium op ijs.
    1. Voor B. pertussis studies, omvatten de volgende groepen van het vaccin: aPV en aPV + BcfA. Daarnaast gebruiken aluin, vaccin-antigenen alleen (FHA, en Prn) en naïef (niet-geïmmuniseerd) muizen als controlegroepen.
      Opmerking: aPV is 1/5th de humane dosis van een FDA-goedgekeurde aPV, die is samengesteld uit tetanus tetanustoxoïd, tetanustoxoïd verminderde difterie, kinkhoest tetanustoxoïd (PT), draadvormige hemagglutinine (FHA) en pertactine (Prn) geadsorbeerd aan aluminium zouten. Een humane dosis van huidige pertussis aPV is 0,5 mL, dus 1/5th van een dosis is 0,1 mL. Volumes voor aPV + BcfA zijn 0,1 mL van de aPV (1/5th van de humane dosis) + 0.046 mL BcfA (30 µg) per muis. Het maximale volume dat veilig kan worden geleverd aan een spier is 0,1 mL. Omdat de aPV + BcfA vaccin volume hoger is dan 0,1 mL, het vaccin moet worden geleverd in beide schouders, ongeveer gelijk, verdeeld om veilig worden toegediend.
    2. Ter voorbereiding van een experimenteel vaccin, voor één dosis combineren 1 µg FHA en 0,5 µg Prn met 50 µg aluminium hydroxide gel in steriele PBS. Toestaan dat de experimentele aPV te mengen op de roller van een laboratorium gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT). Daarna, draai de buis bij 18.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de inhoud in 1 mL steriele PBS.
  2. In het terrarium, instellen van de machine van de anesthesie (Figuur 2).
    Opmerking: Zorg ervoor dat er adequaat niveau van zuurstof en Isofluraan in hun respectieve tanks vóór gebruik zijn. Weeg de Isofluraan scavenger bus en vervangen wanneer het gewicht door 50 g toeneemt.
  3. Grondig reinigen van het biologische veiligheid kabinet (BSC) en plaats de kamer schoon inductie binnen de BSC. Verbinden met de narcose en scavenger lijnen uit de narcose machine de inductie-zaal. Open de zuurstof tank via de regulator om zuurstof stroomt en het machtigingsniveau instellen naar 1,5-2 L/min.
  4. Muizen van gewenste leeftijd (6-12 weken) plaats in de bedwelmingsruimte inductie. Zet de Isofluraan tot 2,5-3% om het licht anesthetize de muizen. Volgen de dieren totdat ze zich niet in de zaal en hun ademhaling is vertraagd.
  5. Test het niveau van inductie door teen-knijpen, voor elke reflexieve beweging waarnemen. Indien er geen, dan is de muizen zijn klaar om te spuiten.
    Opmerking: In dit experiment, de hele kooi van dieren werden verdoofd in een keer. Men kan kiezen anesthetize dieren individueel voor injectie of injecteren de dieren zonder verdoving. Een van deze methoden is geschikt.
  6. Ondertussen bereiden 1 mL insuline spuiten (28G 1/2) met 0,1 mL van elk vaccin. Wanneer dieren volledig worden veroorzaakt, verwijdert u één dier uit de zaal en leggen van het muis ventrally op een handdoek of bench pad.
  7. Het vaccin intramuscularly beheren. Met de spuit in een hoek van 45° met de schuine kant naar boven, de spuit ~ 5 mm steek de deltaspier van de muis en inspuiten van het vaccin.
    Opmerking: De hind kwartaal/flank kan worden gebruikt als een injectieplaats in plaats van de deltoideus.
  8. Houd de naald in de spier voor ~ 5-10 s ingevoegd na injectie. Zodra het volume wordt geleverd, draai de spuit op 180° zo dat de schuine kant gezichten weg te maken van een zegel en voorkomen van het weglekken van het vaccin. Dan, langzaam Trek de naald uit de injectieplaats.
  9. Terug de muis naar de kooi. Herhaal de procedure met alle dieren in de aangewezen groep.
  10. De Isofluraan uitschakelen en leegmaken van de inductie-zaal met zuurstof vóór anesthetizing de volgende kooi van muizen.
  11. Volgen de dieren totdat ze allemaal alert en bewegen in de kooi zijn. Retourneren van de kooi naar de locatie van de behuizing.
  12. Monitor dieren elke 12 h post vaccinatie, langzaam omhoog tot 48 h, voor klinische symptomen van ziekte zoals ruwe/onverzorgde jas, gang of gearbeid ademhaling. Als de symptomen aanhouden, overleggen met de institutionele dierenarts en de muizen verwijderen uit de studie, indien nodig.
  13. Vier weken na de eerste vaccinatie, verhoog muizen door anesthetizing en het beheer van intramusculaire injecties in de juiste deltaspier van de muis met de zelfde vaccin formulering die eerder werd gegeven.
  14. Nogmaals, monitor dier voor geen klinische symptomen. Huis dieren een extra 2 weken en gaat u verder met de infectie.

2. de groei van B. pertussis stammen en voorbereiding van infectie entmateriaal

  1. Uit bevroren voorraden [cryopreserved bij-80 ° C in 15% glycerol, bevroren van plankton in Stainer-Scholte (SS) media12], streak uit B. pertussis op Bordet-Gengou (BG) agar13 platen aangevuld met 10% defibrinated schapenmelk bloed en 100 µg/mL streptomycine (Sm + 10% BG) voor selectie. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 4 dagen.
  2. Kies ~ 8-10 afzonderlijke kolonies van de strain(s) van de plaat en enten van 3 mL SS media aangevuld met 22.8 mM L-cysteïne, 3,6 mM ferro-sulfaat, 3,3 mM niacine, 48.8 mM glutathion, 227 mM ascorbinezuur, heptakis 1 mg/mL en 100 µg/mL streptomycine. Het groeien van de cultuur bij 37 ° C in de trommel van een roller op 60 rpm voor 16-24 uur.
  3. De volgende dag, Verdun de primaire cultuur 1:600, 1:300, 1:120, 1:60, 1:30, en 1:15 in 3 mL aangevuld SS media. Incubeer de cultuur bij 37 ° C in de trommel van de roller op 60 rpm voor 16-24 uur.
  4. Uitvoeren van de extinctie metingen op 600 nm (OD600) voor de bacteriële culturen. Met behulp van spectrofotometer cuvettes, Verdun de culturen 1:10 door de toevoeging van 0,1 mL van de vloeibare culturen tot 0,9 mL steriele PBS.
  5. Selecteer een cultuur met OD600≈ 0,8-1,2. Berekenen van het volume die nodig zijn voor het verkrijgen van 1 OD (Figuur 3). Spin omlaag het volume in een buis microcentrifuge 1,5 mL bij 6000 x g gedurende 5 min bij 25 ° C. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de bacteriële cel pellet in 1 mL steriele PBS te verkrijgen van een dichtheid van 1 OD/mL [1-3 x 109 kolonievormende eenheden (kve) /mL].
  6. Ter voorbereiding van een entmateriaal van ~ 5 x 105 tot en met 1.5 x 106 CFUs/muis in 40-50 µL, vortex en serieel Verdun de bacteriële oplossing (uit stap 2.5) 100-fold in 1 mL steriel PBS tot ~ 1-3 x 10,7 CFUs/mL (Figuur 4A). Vervoer van het entmateriaal aan de vivarium op ijs.

3. lymfkliertest intranasale infectie Model

  1. Stel in het vivarium, zuurstof en anesthesie voorwaarden zoals beschreven in stap 1.3 en 1.4. Zoals beschreven in stap 1.5, plaatst u de muizen in de zaal om anesthetize. Volgen de dieren totdat de verdoving van kracht wordt.
  2. Wanneer de muizen zijn verdoofd, één dier tegelijk verwijderen uit de zaal inductie. Neem de muis door het nekvel van de dorsale thorax, achter de schouderbladen en nek. Plaats de muis rechtop voor toegang tot de neus.
  3. Met een 200 µL pipette uiteinde, langzaam toepassen van 40-50 µL van de bacteriële entmateriaal op de neusgaten van de muis (20-25 µL in elke nare). Houd de muis totdat het gehele entmateriaal heeft al ingeademd door het dier. Als sommige van de entmateriaal belletjes uit, verzamelen de bubbels en opnieuw inboezemen in de neusgaten. Leveren een gelijke hoeveelheid van steriel PBS tot één groep van muizen als negatieve controle.
  4. Zoals gedaan in stappen 1.10-1.12, de geënte dieren terug te keren naar hun kooi en controleren van de dieren totdat zij alert en bewegende zijn. De kooi terugkeren naar haar oorspronkelijke behuizing ruimte op het rek. Spoel de inductie kamer met zuurstof te verwijderen van de resterende Isofluraan voordat de anesthetizing van de volgende reeks van dieren. Toezicht op de dieren voor 48 uur na infectie.
  5. In het laboratorium, plaat seriële verdunningen van het entmateriaal, in steriel PBS, om te controleren of de werkelijke CFUs afgeleverd bij de muizen. Plaat 0,1 mL verdunningen op 10% BG + Sm platen (Figuur 4A). Plaats de platen in de 37 ° C incubator en groeien voor 4 dagen. Rekenen en berekenen van de CFUs van het entmateriaal geleverd aan de muis (Figuur 4B).

4. het verzamelen van dierlijk weefsel na infectie

  1. Voorbereiden op muis dissectie en weefsel oogst.
    1. Alle hulpmiddelen (grove en fijne schaar, gebogen schaar, fijne pincet, pellet pestles en spreiders van de driehoek) die nodig zijn voor de verwerking van weefsels in een autoclaaf steriliseren. Het zegel van de hulpmiddelen in sterilisatie zakjes. De glas dounce homogeniseerders in folie wikkelen en toevoegen autoclaaf tape om aan te geven van de steriliteit.
    2. Bereiden agar platen 1 of 2 dagen vóór de oogst weefsel om ervoor te zorgen dat de platen zijn verhard vóór gebruik. Voor B. pertussis, 10% BG + SM Label platen voor neus, luchtpijp en longen voor elke muis met de gewenste verdunningen, empirisch bepaald voor elk experiment te gebruiken.
    3. Vul- en label CFU verdunning buizen. Voeg 0,9 mL steriele PBS steriele 1,5 mL microcentrifuge buizen baseert het op aantal organen aan proces en verdunningen per orgel.
    4. Vul- en label buizen voor weefsel collectie:
      1. Neus en de luchtpijp: Vul een steriele 1,5 mL microcentrifuge buis met 0.3 mL steriele 1% caseïne in PBS (Ca2 + en Mg2 +-gratis). Bewaren bij 4 ° C.
      2. Longen: Voeg toe 2 mL steriele 1% caseïne in PBS om een steriele 15 mL conische buis en sla bij 4 ° C. Om te oogsten longen voor histologie, voeg toe 2 mL 10% neutraal gebufferde formaline (NBF) en op te slaan op RT.
      3. Milt: Voeg 3 mL RPMI + 5% FBS naar een conische tube van 15 mL. Bewaren bij 4 ° C.
      4. Bloed: label twee sets van steriele 1,5 mL microcentrifuge buizen, één voor volbloed en één voor serum.
    5. Verse 70% ethanol moet bereid zijn om te vullen bekers en flessen voor dissectie spuiten.
  2. Alle materialen om het terrarium op een kar te vervoeren op de dag van de oogst. Reinigen van het Comité voor bankentoezicht en het opzetten van de machine van de verdoving zoals in stap 1.3 en 1.4.
  3. Plaats de muizen te worden ontleed in de inductie-zaal, met zuurstof stroomt, zet de Isofluraan tot 5% en wacht tot de dieren zijn onbewuste. Muizen één tegelijk te verwijderen, en cervically het dier te ontwrichten als een secundaire methode om dood. Naar aanleiding van cervicale dislocatie, moet euthanasie worden bevestigd door het ontbreken van een respiratoire tarief en/of afwezigheid van de terugtrekking reflex (Teen snuifje test).
  4. Plaats de muis, de ventrale zijde naar boven, op het bord van de dissectie en pin van de armen en benen open. Spuiten van het lichaam van de muis met 70% ethanol.
  5. Met behulp van Tang, gesp de huid onder de buik, in het midden van het bekken. Maak een verticale snee tot de onderkaak met scherpe schaar. Vervolgens het ontleden van de huid van de peritoneale muur door te duwen de twee lagen uit elkaar, werken met kleine bewegingen met de schaar is gesloten. Plaats de huid aan de zijkanten van het karkas om een vrij veld voor steriele orgel oogst te maken.
  6. Pak het intact buikvlies onder de ribbenkast op of rond de lever en snijd het open richting de ribbenkast. De onderste maagdarmkanaal bloot en de dikke darm naar links onthullen de milt. Met behulp van gebogen pincet, pak de milt en ontleden weg het bindweefsel met een schaar. Plaats de milt in een conische tube van 15 mL, met 3 mL RPMI + 5% FBS en plaats de buis op ijs.
  7. Gebruik pincet te stabiliseren van de ribbenkast op de xiphoid process en het middenrif opengesneden. Longen moeten laten leeglopen en vallen naar de rug. Opengesneden de ribbenkast aan de zijkanten te verwijderen van de borstplaat.
  8. Isoleren en de superieure kwab van de juiste Long14, snijden de pulmonary slagaders en aders verwijderen. Plaats de kwab in een conische tube van 15 mL, met 10% NBF en plaats de buis op RT gedurende ten minste 24 uur om te herstellen van het weefsel. Isoleren van de resterende lobben van de juiste Long en de linker long. Lobben plaats in een conische tube van 15 mL, met 2 mL 1% caseïne in PBS en plaats het op het ijs.
  9. Laat na het snijden de pulmonary aders en slagaders te ontleden uit de longen, de borstholte te vullen met bloed, zoals de muis exsanguinates. Met behulp van een pipetman van 1 mL met tip, verzamelen van het bloed en overdragen naar de vooraf gelabelde 1,5 mL microcentrifuge buis. Plaats de buis op ijs.
  10. Verwijder vervolgens van de nek, de weke delen (klieren parotide, sublinguaal en onderkaak en lymfklieren), dat betrekking heeft op de luchtpijp. Open en verwijder de beschermende membranen rond de luchtpijp. Subtiel, met fijne Tang en schaar, scheiden de luchtpijp van de slokdarm en elke andere bindweefsel vanaf bovenkant van de sleutelbeenderen, naar beneden van de onderkaak.
  11. Met behulp van Tang, vasthouden aan de luchtpijp en snijd de luchtpijp aan de bovenkant van het sleutelbeen. Trek de luchtpijp naar beneden om te maximaliseren van de elasticiteit en de luchtpijp aan de onderkant van de onderkaak pal boven het strottenhoofd, zoveel mogelijk isoleren (~ 1 cm) snijden. Plaats het orgel in een tube microcentrifuge vooraf gelabelde 1,5 mL met 0.3 mL 1% caseïne in PBS en plaats het op het ijs.
  12. Losmaken van de muis en leg het ventrally, met de muis tegenover de onderzoeker voor duidelijke toegang tot de neus. Het hoofd van de muis spray met 70% ethanol en, met handen, greep de muis direct achter de schedel.
  13. Met behulp van schaar, knip weg zachte vlees van de snuit, vanaf de onderkant van de neus en omhoog verplaatsen. Bovendien, verwijderen de vacht, huid en snorharen rond de neus. Vervolgens, met pincet en gebogen schaar, invoegen de toppen van schaar neusgaten met de bochten erop naar buiten, en de nasale doorgang naar de ogen, het maken van een V-achtige formatie opengesneden.
  14. Met behulp van fijne pincet, verzamelen het neustussenschot en het zachte weefsel binnen de gemaakte vorming. Plaats het weefsel in een tube microcentrifuge vooraf gelabelde 1,5 mL met 0.3 mL 1% caseïne in PBS en plaats het op het ijs.
  15. Ontdoen van het karkas in een zak van biohazard. Voordat de ontrafeling van het volgende dier, de gereedschappen met gedeïoniseerd water spoelen en vervolgens Breng in een bekerglas gevuld met 70% ethanol. Verwijderen van de hulpmiddelen, overtollige ethanol afschudden en ga vervolgens verder met de volgende dissectie
  16. Elke muis na stappen 4.3-4.14 ontleden.
  17. De weefsels worden verwerkt zoals hieronder beschreven.

5. de verwerking van de milt

  1. Om zich te distantiëren van milt, een 70 µm cel zeef in een 60 mm weefselkweek schotel te plaatsen. Giet de milt en de bijbehorende media in de filter, door middel van de zuiger van een injectiespuit 3 mL. Zorgvuldig prak het orgel totdat het volledig losgekoppeld en gefilterd door cel zeef.
  2. Spoelen van het filter met 3 mL RPMI + 5% FBS in de weefselkweek schotel. Verzamelen van de celsuspensie en plaats deze in de originele tube van 15 mL. Centrifugeer de buizen bij 450 x g gedurende 5 min bij 4 ° C tot pellet van de cellen.
  3. Gecombineerd of de bovendrijvende vloeistof decanteren en lyse van de rode bloedcellen door de pellet in 2 mL van de ammoniumchloride kalium (ACK) buffer (ammoniumchloride 150 mM, 10 mM kaliumbicarbonaat, 0.1 mM natrium EDTA) resuspending. Incubeer gedurende 3 minuten op RT (25 ° C).
  4. Vul de buizen tot 8 mL met RPMI + 5% FBS en centrifuge buizen bij 450 x g gedurende 5 min bij 4° C. Gecombineerd of decanteren van de bovendrijvende substantie. Resuspendeer de cel pellets in 5 mL RPMI + 5% FBS en graaf de splenocytes met een hemocytometer en een microscoop.
  5. Bereken het volume van cellen die nodig zijn voor het stimuleren van 2.5 x 106 cellen per putje. Seed in een 48-well plaat, de cellen in 0,5 mL van T-cel media (RPMI 1640 + 10% FBS, 10 µg/mL gentamicine en 50 µM β-mercaptoethanol) per putje.
  6. Op basis van de bovenstaande berekening, plaatst u het vereiste volume van de celsuspensie in een verse buis en pellet-cellen bij 450 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
  7. Resuspendeer de pellet in het vereiste volume van T-cel-media. Testen voor een B. pertussis infectie model, de reactie van de antigeen-specifieke cytokine aan vaccin-antigenen: pertactine (Prn) en hechting van de draadvormige hemagglutinine (FHA). Daarom 3 behandelingen nodig zijn: 1) geen stimulatie (NS, als negatieve controle), 2) Prn en 3) FHA. Voor de bepaling is 7,5 x 106 cellen in 1,5 mL van T-cel media vereist (2.5 x 106 cellen per 0,5 mL).
  8. Aliquot 0,5 mL van de celsuspensie in een 48-well-plaat.
  9. Om te stimuleren cellen, meng antigenen op 2 keer de gewenste concentratie in T-cel-media. Eindconcentraties van Prn en FHA = 1 µg/mL en 0,5 µg/mL, respectievelijk. Daarom Meng 2 µg/mL Prn of 1 µg/mL FHA in 0,5 mL. Vervolgens, aliquoot 0,5 mL van het medium van de stimulatie in elk goed, aangewezen verdunning van het antigeen behandeling om 1 x in een eindvolume van 1 mL in elk putje.
  10. Incubeer de platen bij 37 ° C in 5% CO2. Supernatant op dag 7 en aliquoot 0,5 mL van het supernatant in vooraf gelabelde microcentrifuge buizen verzamelen. Het bewaren van de monsters in een-20 ° C tot klaar voor het testen van antigeen-specifieke cytokines door ELISA (Figuur 6).

6. verwerking van de longen

  1. Breng de longen (in 2 mL zuiver 1% caseïne in PBS) in een steriele, 15 mL dounce homogenizer. Gebruik stamper te homogeniseren weefsel. Totdat geen grote deeltjes van weefsel blijven distantiëren. Plaats de gehomogeniseerde schorsing terug in de originele tube van 15 mL.
  2. Verwijderen van een 0.3 mL aliquoot voor plating CFUs samen en Centrifugeer het homogenaat bij 450 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verzamelen en aliquot wordt het supernatant in 0,5 mL aliquots in vooraf gelabelde microcentrifuge buizen. Bewaren van de monsters in een-20 ° C tot de analyse van cytokines door ELISA.
  3. Maak gekozen verdunningen door serieel verdunning van 0,1 mL van de gehomogeniseerde Long suspensie in verdunning buizen (0,9 mL steriele PBS). Plaat 0,1 mL van empirisch gekozen verdunningen op vooraf gelabelde 10% BG + Sm platen en verspreiding met behulp van steriele driehoek strooier.
  4. Incubeer de platen bij 37 ° C in de kamer lucht voor 4 dagen.
  5. Rekenen en berekenen CFUs/Long (Figuur 6). Kort, herstelde CFU-getallen te vermenigvuldigen, door de verdunningsfactor van de plaat, vervolgens ook door het totale volume waarin het orgel werd verwerkt. De CFU-berekeningen worden vervolgens omgezet in Log10 waarden voor elk dier en opgenomen in een grafiek.
    1. Platen met 30-300 kolonies worden gemakkelijk en nauwkeurig geteld. Platen met minder dan 6 kolonies moeten niet worden gebruikt voor berekeningen, omdat dergelijke lage kolonie nummers fout15 invoeren. Voor het verkrijgen van een ondergrens voor detectie, het totale volume waarin een orgel was gehomogeniseerd wordt gedeeld door het volume dat wordt gebruikt om ter plaatse op een bord van de onverdunde homogenaat (bv., totale volume van 2 mL gedeeld door 0,1 mL van de onverdunde homogenaat is gelijk aan de ondergrens van 20 CFUs detecteerbare).

7. de verwerking van de neus en de luchtpijp

  1. Meng het weefsel in de 0.3 mL van de 1% de stamper van de PBS/caseïne met pellet draadloze motor homogeniseerders. Meng het weefsel voor 0,5-1 min tot het weefsel is grotendeels losgekoppeld. Bacteriën moeten worden uitgescheiden in de opschorting.
  2. Bereiden van gekozen 10 x verdunningen door seriële verdunning van 0,1 mL van de gehomogeniseerde suspensie in verdunningen buizen met 0,9 mL steriele PBS. Stip 0,1 mL van elke verdunning op vooraf label 10% BG + Sm platen en verspreiden van de opschorting met behulp van een driehoek-strooier die door een 70% ethanol wassen en vlam is gesteriliseerd.
  3. Incubeer de platen bij 37 ° C in de kamer lucht voor 4 dagen.
  4. Rekenen en berekenen CFUs/orgel zoals in stap 6.5 (Figuur 6). Voor het verkrijgen van een ondergrens voor detectie, het totale volume waarin een orgel was gehomogeniseerd wordt gedeeld door het volume dat wordt gebruikt om de stip op een plaat van de onverdunde homogenaat (bv., 0.3 mL totale volume gedeeld door 0,1 mL van de onverdunde is gelijk aan de ondergrens van 3 CFUs detecta ble).

8. de verwerking van bloed

  1. Centrifugeer de buizen met geïsoleerde volbloed bij 18.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C tot pellet van rode bloedcellen.
  2. Zorgvuldig opstijgen naar de serum supernatant en Pipetteer in een vooraf gelabelde serum microcentrifuge buis. Bewaren van de buizen in de-20 ° C tot klaar voor verdere downstream analyse (dwz., totale en specifieke Ig ELISA).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het model beschreven toont een methode om te evalueren van de efficiëntie van het vaccin en immuunresponsen tijdens gastheer-pathogeen interacties. Figuur 1 toont de planning van de representatieve vaccin gebruikt om te immunizeren en infecteren van muizen en oogsten van weefsels voor analyse. Figuur 2 toont de setup van het systeem van de verdoving werkzaam voor het opwekken van muizen, waardoor onderzoekers inentingen en bacter...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het uitgebreide protocol hier beschreven om te bestuderen van de vaccin-geïnduceerde immuniteit aan B. pertussis infectie zal ook toestaan dat evaluatie van host reacties op een verscheidenheid van andere ziekteverwekkers. Het protocol wordt beschreven methoden leveren inentingen te bepalen vaccin werkzaamheid volgende pathogen uitdaging en parallelle dissectie van immune functie. Bij de aanpassing van het protocol te bestuderen van andere ziekteverwekkers, zou verschillende parameters moeten worden gewijzigd. D...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door 1R01AI125560-01 en start-up middelen aan The Ohio State University.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2L inductiekamerVet Equip941444
FlurisoVet OneV1 501017elk merk is geschikt
Bordet Gengou Agar BaseBD bioscience248200
CaseïneSigmaC-7078
CasaminozurenVWRJ851-500GStrainer Scholte (SS) media componenten
L-GlutaminzuurResearch Products IntG36020-500
L-ProlineResearch Products IntP50200-500
NatriumchlorideFisherBP358-10
Kaliumfosfaat monobasischFisherBP362-1
KaliumchlorideFisherP217-500
Magnesiumchloride hexahydraatFisherM2670-500G
CalciumchlorideFisherC75-500
Tris baseFisherBP153-1
L-cysteïne HClFisherBP376-100SS media supplementen
Ferrosulfaat heptahydraatSigmaF-7002
NiacineResearch Products IntN20080-100
GlutathioneResearch Products IntG22010-25
AscorbinezuurResearch Products IntA50040-500
RPMI 1640ThermoFisher Scientific11875093
FBSSigmaF2442-500mL elke VS bron, niet-hitte-inactivering
GentamicineThermoFisher Scientific15710064
B-mercaptoethanolFisher BP176-100
15mL dounce weefselgrinderWheaton357544elk soortgelijk merk is geschikt
Snoerloze handhomogenisatorKontes/Sigma Z359971-1EAelk soortgelijk merk is geschikt
Instrumenten - schaar, kromme schaar, pincetten, fijne pincetten, driehoekige spreiderselk merk is geschikt
3mL spuitenBD bioscience309657
15mL conische buizenFisher 339651
1,5mL microfugebuizenDenvilleC2170
70um celstrainersFisher 22363548
60mm platenThermoFisher Scientific130181
48-wells weefselkweekplatenThermoFisher Scientific08-772-1C
1mL insulinespuit 28G1/2Fisher Scientific/Excel Int.14-841-31
Muis IFN-gamma ELISA Ready-SET-Go! KitInvitrogen / eBioscience50-173-21
Muis IL-17 ELISA Ready-SET-Go! KitInvitrogen / eBioscience50-173-77
Muis IL-5 ELISA Ready-SET-Go! KitInvitrogen / eBioscience50-172-09

Referenties

  1. Tacken, P. J., Figdor, C. G. Targeted antigen delivery and activation of dendritic cells in vivo: steps towards cost effective vaccines. Seminars in Immunology. 23 (1), 12-20 (2011).
  2. Kilgore, P. E., Salim, A. M., Zervos, M. J., Schmitt, H. J. Pertussis: Microbiology, Disease, Treatment, and Prevention. Clinical Microbiology Reviews. 29 (3), 449-486 (2016).
  3. Dorji, D., et al. Bordetella Pertussis virulence factors in the continuing evolution of whooping cough vaccines for improved performance. Medical Microbiology and Immunology. 207 (1), 3-26 (2018).
  4. Feldstein, L. R., et al. Global Routine Vaccination Coverage, 2016. Morbidity and Mortality Weekly Report. 66 (45), 1252-1255 (2017).
  5. Cherry, J. D. Epidemic pertussis in 2012--the resurgence of a vaccine-preventable disease. New England Journal of Medicine. 367 (9), 785-787 (2012).
  6. Celentano, L. P., et al. Resurgence of pertussis in Europe. The Pediatric Infectious Disease Journal. 24 (9), 761-765 (2005).
  7. McNabb, S. J., et al. Summary of notifiable diseases. Morbidity and Mortality Weekly Report p. 54 (53), 1-92 (2007).
  8. Sealey, K. L., Belcher, T., Preston, A. Bordetella pertussis epidemiology and evolution in the light of pertussis resurgence. Infection, Genetics, and Evolution. 40, 136-143 (2016).
  9. Warfel, J. M., Merkel, T. J. The baboon model of pertussis: effective use and lessons for pertussis vaccines. Expert Reviews of Vaccines. 13 (10), 1241-1252 (2014).
  10. Jennings-Gee, J., et al. The adjuvant Bordetella Colonization Factor A attenuates alum-induced Th2 responses and enhances Bordetella pertussis clearance from mouse lungs. Infection and Immunity. , (2018).
  11. Sukumar, N., Mishra, M., Sloan, G. P., Ogi, T., Deora, R. Differential Bvg phase-dependent regulation and combinatorial role in pathogenesis of two Bordetella paralogs, BipA and BcfA. Journal of Bacteriology. 189 (10), 3695-3704 (2007).
  12. Stainer, D. W., Scholte, M. J. A simple chemically defined medium for the production of phase I Bordetella pertussis. Journal of General Microbiology. 63 (2), 211-220 (1970).
  13. Bordet, J. Le microbe de le coqueluche. Annales de l'Institut Pasteur. 20, 731-741 (1906).
  14. Cook, M. J. The Anatomy of the Laboratory Mouse. , Academic Press. (1965).
  15. Sutton, S. Accuracy of Plate Counts. Journal of Validation Techniques. 17 (3), 42-46 (2011).
  16. Conover, M. S., Sloan, G. P., Love, C. F., Sukumar, N., Deora, R. The Bps polysaccharide of Bordetella pertussis promotes colonization and biofilm formation in the nose by functioning as an adhesin. Molecular Microbiology. 77 (6), 1439-1455 (2010).
  17. Cattelan, N., Jennings-Gee, J., Dubey, P., Yantorno, O. M., Deora, R. Hyperbiofilm Formation by Bordetella pertussis Strains Correlates with Enhanced Virulence Traits. Infection and Immunity. 85 (12), (2017).
  18. Andreasen, C., Carbonetti, N. H. Pertussis toxin inhibits early chemokine production to delay neutrophil recruitment in response to Bordetella pertussis respiratory tract infection in mice. Infection and Immunity. 76 (11), 5139-5148 (2008).
  19. Mills, K. H., Gerdts, V. Mouse and pig models for studies of natural and vaccine-induced immunity to Bordetella pertussis. Journal of Infectious Diseases. 209, Suppl 1 16-19 (2014).
  20. Dunne, A., et al. A novel TLR2 agonist from Bordetella pertussis is a potent adjuvant that promotes protective immunity with an acellular pertussis vaccine. Mucosal Immunology. 8 (3), 607-617 (2015).
  21. Denoel, P., Godfroid, F., Guiso, N., Hallander, H., Poolman, J. Comparison of acellular pertussis vaccines-induced immunity against infection due to Bordetella pertussis variant isolates in a mouse model. Vaccine. 23 (46-47), 5333-5341 (2005).
  22. Marr, N., et al. Protective activity of the Bordetella pertussis BrkA autotransporter in the murine lung colonization model. Vaccine. 26 (34), 4306-4311 (2008).
  23. Feunou, P. F., Bertout, J., Locht, C. T- and B-cell-mediated protection induced by novel, live attenuated pertussis vaccine in mice. Cross protection against parapertussis. PLoS One. 5 (4), 10178(2010).
  24. Mills, K. H., Ryan, M., Ryan, E., Mahon, B. P. A murine model in which protection correlates with pertussis vaccine efficacy in children reveals complementary roles for humoral and cell-mediated immunity in protection against Bordetella pertussis. Infection and Immunity. 66 (2), 594-602 (1998).
  25. Higgs, R., Higgins, S. C., Ross, P. J., Mills, K. H. Immunity to the respiratory pathogen Bordetella pertussis. Mucosal Immunology. 5 (5), 485-500 (2012).
  26. Alving, C. R. Design and selection of vaccine adjuvants: animal models and human trials. Vaccine. 20, Suppl 3 56-64 (2002).
  27. Ipp, M. M., et al. Adverse reactions to diphtheria, tetanus, pertussis-polio vaccination at 18 months of age: effect of injection site and needle length. Pediatrics. 83 (5), 679-682 (1989).
  28. Fessard, C., Riche, O., Cohen, J. H. Intramuscular versus subcutaneous injection for hepatitis B vaccine. Vaccine. 6 (6), 469(1988).
  29. Bergeson, P. S., Singer, S. A., Kaplan, A. M. Intramuscular injections in children. Pediatrics. 70 (6), 944-948 (1982).
  30. Zhang, L., Wang, W., Wang, S. Effect of vaccine administration modality on immunogenicity and efficacy. Expert Review of Vaccines. 14 (11), 1509-1523 (2015).
  31. Ross, P. J., et al. Relative Contribution of Th1 and Th17 Cells in Adaptive Immunity to Bordetella pertussis: Towards the Rational Design of an Improved Acellular Pertussis Vaccine. PLoS Pathogens. 9 (4), 1003264(2013).
  32. Warfel, J. M., Zimmerman, L. I., Merkel, T. J. Acellular pertussis vaccines protect against disease but fail to prevent infection and transmission in a nonhuman primate model. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (2), 787-792 (2014).
  33. Allen, A. C., et al. Sustained protective immunity against Bordetella pertussis nasal colonization by intranasal immunization with a vaccine-adjuvant combination that induces IL-17-secreting TRM cells. Mucosal Immunology. , (2018).
  34. Solans, L., et al. IL-17-dependent SIgA-mediated protection against nasal Bordetella pertussis infection by live attenuated BPZE1 vaccine. Mucosal Immunology. , (2018).
  35. Miller, M. A., et al. Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia. PLoS One. 7 (2), 31359(2012).
  36. Sato, Y., Izumiya, K., Sato, H., Cowell, J. L., Manclark, C. R. Aerosol infection of mice with Bordetella pertussis. Infection and Immunity. 29 (1), 261-266 (1980).
  37. Warfel, J. M., Beren, J., Merkel, T. J. Airborne transmission of Bordetella pertussis. Journal of Infectious Diseases. 206 (6), 902-906 (2012).
  38. Scanlon, K. M., Snyder, Y. G., Skerry, C., Carbonetti, N. H. Fatal Pertussis in the Neonatal Mouse Model Is Associated with Pertussis Toxin-Mediated Pathology beyond the Airways. Infection and Immunity. 85 (11), (2017).
  39. Martinez de Tejada, G., et al. Neither the Bvg- phase nor the vrg6 locus of Bordetella pertussis is required for respiratory infection in mice. Infection and Immunity. 66 (6), 2762-2768 (1998).
  40. Higgins, S. C., Jarnicki, A. G., Lavelle, E. C., Mills, K. H. TLR4 mediates vaccine-induced protective cellular immunity to Bordetella pertussis: role of IL-17-producing T-cells. Journal of Immunology. 177 (11), 7980-7989 (2006).
  41. Mahon, B. P., Brady, M. T., Mills, K. H. Protection against Bordetella pertussis in mice in the absence of detectable circulating antibody: implications for long-term immunity in children. Journal of Infectious Diseases. 181 (6), 2087-2091 (2000).
  42. Karlsson, A. C., et al. Comparison of the ELISPOT and cytokine flow cytometry assays for the enumeration of antigen-specific T-cells. Journal of Immunological Methods. 283 (1-2), 141-153 (2003).
  43. Hagen, J., et al. Comparative Multi-Donor Study of IFNgamma Secretion and Expression by Human PBMCs Using ELISPOT Side-by-Side with ELISA and Flow Cytometry Assays. Cells. 4 (1), 84-95 (2015).
  44. Raeven, R. H. M., et al. Molecular and cellular signatures underlying superior immunity against Bordetella pertussis upon pulmonary vaccination. Mucosal Immunology. 11 (3), 1009(2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Gastheer-pathogeenresponsimmunisatie van muizenbacteriële inoculatieoogsten van weefselsCFU-enumeratieflowcytometrieELISpot-analyseBordetella pertussisTh1 Th17-polarisatie
Evaluatie van de Host-Pathogen reacties en werkzaamheid van het vaccin in muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.