Methodenartikel

Gelijktijdige elektrische en mechanische stimulatie ter verbetering van de cellen Cardiomyogenic potentieel

DOI:

10.3791/58934

⸱

18 januari 2019

 ,  , 
1Insuficiencia Cardiaca y Regeneración Cardiaca (ICREC) Research Program, Health Science Research Institute Germans Trias i Pujol, 2Amsterdam Universitair Medisch Centrum (UMC), Vrije Universiteit Amsterdam, Pulmonology and Physiology, Amsterdam Cardiovascular Sciences, 3Electronic and Biomedical Instrumentation Group, Departament d'Enginyeria Electrònica, Universitat Politècnica de Catalunya, 4Cardiology Service, Germans Trias i Pujol University Hospital, 5Department of Medicine, Universitat Autònoma de Barcelona, 6Centro de Investigación Biomédica en Red (CIBER) Cardiovascular, Instituto de Salud Carlos III

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol voor de opleiding van de bevolking van een cel met behulp van elektrische en mechanische stimuli emuleren cardiale fysiologie. Deze elektromechanische stimulatie verbetert het cardiomyogenic potentieel van de behandelde cellen en is een veelbelovende strategie voor verdere celtherapie, ziekte modellering en drug screening.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cardiovasculaire aandoeningen zijn de belangrijkste doodsoorzaak in de ontwikkelde landen. Bijgevolg heeft de vraag naar effectieve cardiale celtherapieën gemotiveerd onderzoekers in de cel van de stam en bioengineering velden te ontwikkelen in vitro HiFi-menselijke myocard voor zowel basisonderzoek en klinische toepassingen. De onrijpe fenotype van hartcellen is echter een beperking op het verkrijgen van weefsels die functioneel na te bootsen de volwassen myocard, dat vooral wordt gekenmerkt door mechanische en elektrische signalen. Het doel van dit protocol is dus, voor te bereiden en oudere van de cel doelgroep door middel van elektromechanische stimulatie, Recapitulerend fysiologische parameters. Cardiale weefselengineering evolueert naar meer biologische benaderingen en strategieën op basis van biofysische stimuli, dus, zijn goed op stoom. Het apparaat ontwikkeld voor dit doel is uniek en kan afzonderlijk of gelijktijdig elektrische en mechanische stimulatie, zorgvuldig gekenmerkt en gevalideerd. Bovendien, hoewel de methode is geoptimaliseerd voor deze stimulator en de bevolking van een specifiek cel, kan het gemakkelijk worden aangepast aan andere apparaten en cellijnen. De resultaten hier bieden bewijs van de toegenomen cardiale verbintenis de celpopulatie na elektromechanische stimulatie. Electromechanically gestimuleerd cellen tonen een verhoogde expressie van belangrijkste cardiale markers, met inbegrip van vroege, structurele en calcium-regulering genen. Deze cel conditionering kan nuttig zijn voor verdere regeneratieve celtherapie, ziekte modelleren, en high-throughput drug screening.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hartfunctie is gebaseerd op de koppeling van elektrische excitatie en contractie van de mechanische. Kort, cardiomyocyte intercellulaire kruispunten toestaan elektrische signaal doorgeven aan het produceren van bijna synchrone contracties van het hart dat bloed pomp, systemisch en via het pulmonaire systeem. Hartcellen, ondergaan dus zowel elektrische en mechanische krachten die regelen van gen expressie en cellulaire functie. Dienovereenkomstig, vele groepen hebben geprobeerd te ontwikkelen cultuur platformen die de cardiale fysiologische omgeving om te begrijpen van de rol van mechanische en elektrische stimulatie op cardiale ontwikkeling, functie en rijping na te bootsen. In vitro elektrische en mechanische stimulaties individueel toegepaste uitgebreid in cardiale weefselengineering functionele eigenschappen verbeteren, cel rijping vergroten of verbeteren cel koppeling en calcium behandeling1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. synchrone elektromechanische conditionering blijft echter onbenut vanwege de uitdaging van de ontwikkeling van een stimulator en protocol, en de verplichte optimalisatie22.

Voorbereidende werkzaamheden gericht elektromechanische stimulatie als een combinatie van elektrische stimulatie en media perfusie; de stroom gaat echter niet om de stam gebaseerde vervorming typische van ventriculaire vulling23,24,25. Later meer fysiologische benaderingen elektrische prikkels gecombineerd met fysieke vervorming of uitrekken om na te bootsen de isovolumetric contractie26,27,28,29,30 ,31. Feng et al. beschreef de eerste demonstratie van elektromechanische stimulatie in 2005, rapportage cardiomyocyte grootte en contractiele eigenschappen26verbeterd. Wang et al. mesenchymale stamcellen met 5-azacytidine voorbehandeld en gelijktijdige elektrische en mechanische conditionering, verbetering van de recellularization, levensvatbaarheid van de cellen, cardiale differentiatie en weefsel remodeling27toegepast. Sinds die publicaties, meer groepen hebben gemeld op elektromechanische stimulatie van cel monolayers of weefsels (bijvoorbeeld zwart28Vunjak-Novakovic29,31, en onze fractie30) ontworpen met de eerste geconditioneerde cellen getest in vivo30. Kort, Morgan en zwart getest verschillende combinaties van elektrische en mechanische stimuli, melden dat de timing tussen stimulaties was van cruciaal belang omdat vertraagde gecombineerde elektromechanische stimulatie de beste resultaten-28 leverde. Vervolgens Godier-Furnémont en medewerkers geoptimaliseerd een elektromechanische stimulatie-protocol voor de gemanipuleerde hart spier constructies van neonatale rat hart cellen en bereikt, voor de eerste keer, een positieve kracht-frequentie relatie29. Daarna, onze fractie gerapporteerd dat electromechanically geconditioneerde cellen verhoogd de uitdrukking van de belangrijkste cardiale markeringen in vitro en brede gunstige effecten in vivo, zoals verbeterde cardiale functie of toegenomen dichtheid van het vaartuig in het infarct grens regio30. De meest recente publicatie aangetoond dat cardiale weefsels uit stamcellen-cell-derived cardiomyocytes aan elektromechanische conditionering bereikt een rijping niveau dichter bij menselijke volwassen cardiale structuur en functie31 onderworpen. Bovendien, alternatieve driedimensionale stimulatie platformen omvatten electroactive steigers waarmee de elektrische, mechanische en topografische signalen naar de cellen gekoppeld32. Mechanische vervorming (cel enkelgelaagde uitrekken en compressie) kan bovendien ook worden opgewekt met elastische elektroden nabootsen van normale fysiologische omstandigheden, evenals extreme omstandigheden33.

De grondgedachte is derhalve dat in vitro elektromechanische prikkels op basis van fysiologische omstandigheden zou kunnen het potentieel van de cardiomyogenic van een cel vergroten. Inderdaad, deze stimulatie kan profiteren verder integraties van therapeutische cellen in het myocardium in een klinische scenario of weefsel rijping voor drug-screening toepassingen te verhogen.

Bovendien, we geïsoleerd en een bevolking van menselijk vetweefsel afkomstige voorlopercellen van cardiale gekenmerkt oorsprong (cardiale ATDPCs)34. Deze cellen bevinden zich in het epicardial vet. Deze cellen weergeven histopathologisch en functionele voordelen bij de behandeling van een hartinfarct en ook het onderhouden van cardiale en endotheel differentiatie potentiële. 30 , 35. wij veronderstelde dat deze voordelen na biofysische stimulatie verhogen zou.

Dus we ontwikkelde een apparaat en een regeling van de stimulatie voor de bevolking van de cel van belang en onderzocht de effecten. Dit elektromechanische protocol is een nieuwe strategie voor het opwekken van actieve cel die zich uitstrekt in een steriele wijze en noninvasively vergeleken met eerdere publicaties36, in combinatie met elektrische veld stimulatie. De techniek hier gemeld wordt uitgelegd in detail het apparaat en de methode die wordt gebruikt voor de elektrische, mechanische en elektromechanische stimulatie van cellen.

Dit apparaat kan bieden zowel elektrische en mechanische stimulatie, onafhankelijk of gelijktijdig. De stimulatie wordt uitgevoerd met een noninvasive en aseptische nieuwe benadering, die presterilized cel ondersteunt, elektroden geplaatst binnen een standaard cultuur plaat, en een platform dat induceert de mechanische en elektrische krachten (Figuur 1).

Het platform kan houden tot zes cultuur platen en bestaat uit een sandwich constructie van laser-gesneden poly(methyl methacrylate) en printplaat stukken. Het prototype platform is gebaseerd op een combinatie van een monofasische programmeerbare computer gestuurde elektrische stimulator, een Printplaat voor de robuuste aansluiting van de elektroden, en zes 10 mm x 10 x 5 mm vernikkeld neodymium-vaste magneten geplaatst in de buurt van de één-kant van de platen van de cultuur. Er is ook een aluminium bar met zes drijvende magneten (hetzelfde model) voor de andere kant van de cultuur-platen geplaatst en vertrok met een lineaire servomotor. De motor wordt aangedreven door een motorcontroller, beheerd via een RS-232 poort door commerciële software (Zie de Tabel van de materialen). Via de gebruikersinterface en programmeerbare stimulator is het mogelijk om te programmeren van de elektrische intensiteit, de impulstijd en frequentie, de frequentie van mechanische stimulatie, de taakcyclus, het aantal pulsen, de amplitude van de pols (magneet excursie), en de helling.

figure-introduction-1
Figuur 1 : Elektromechanische stimulator. (A) PDMS-constructie voor de conditionering van de cel gebruikt. (B) een tekening van het PDMS construct, met inbegrip van de elektroden en magneten. (C) Detail van de printplaat (platform) gebruikt voor het uitvoeren van de elektromechanische conditionering. Dit paneel is gewijzigd van Llucià-Valldeperas et al.30. (D) foto van de elektromechanische stimulatie platform en de user interface (computer). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Zowel de stimulator en de methode voor elektromechanische conditioning zijn volledig beschreven in twee internationale patenten, WO-2013185818-A137 en38van de WO-2017125159-A1.

De biocompatibel siliconen constructies ontworpen om structurele steun geven aan cellen, elektroden, en magneten zijn geweest beschreven eerder10,21. Kortom, ze bestaan uit Polydimethylsiloxaan (PDMS), gegoten en genezen bij kamertemperatuur, met een Youngs modulus van 1.3 MPa, dicht bij de fysiologische niveaus. De constructie bevat een cel cultuur zwembad in een flexibele ruimte (10 x 10 x 2 mm), twee innerlijke transversale "slots" om te houden van de elektroden, en twee ingesloten 6 x 2 mm x 4 mm vernikkeld neodymium-magneten. De elektroden zijn gebouwd met 0,2 mm platina-draad twisted rond een 2 x 3 mm x 12 mm polytetrafluorethyleen (PTFE) kern bar (21 cm per elektrode, ongeveer 23 bochten) en aan weerszijden van de flexibele ruimte maken van een elektrisch veld voor inducerende geplaatst elektrische stimulatie. Mechanische uitrekken wordt bereikt door magnetische aantrekkingskracht tussen magneten ingebed in de steun en externe magneten geplaatst naast de cultuur-plaat en op de bewegende aluminium arm. Op deze manier, kan de cel ondersteuning worden uitgebreid zonder verbreking van de steriele barrière. Deze aanpak is geschikt voor een cel enkelgelaagde maar kon worden aangepast aan de driedimensionale constructies, ook.

Bovendien zou een regelmatig patroon ingeprinte waar de cellen worden overgeënt, met behulp van een gelinieerde diffractie raspen (1.250 groeven/mm). De directe visualisatie van de cellen gekweekt op het PDMS construct onder helderveld en fluorescente microscopen is mogelijk omwille van de transparantie en de 0.5 mm dikte. In het onderhavige geval heeft het PDMS cultuur zwembad een verticale oppervlaktepatroon, loodrecht op de uitrekkende force, de cellen loodrecht naar het elektrische veld, die het verloop van het elektrisch veld in de cel minimaliseert uitgelijnd.

Figuur 1 toont een detailbeschrijving van de constructie en het apparaat dat wordt gebruikt voor de stimulatie. De PDMS construeren en kenmerken zijn geoptimaliseerd voor mobiele rekken (figuur 1A, B). De stimulator is ontwikkeld en gevalideerd voor de effectieve toepassing van de gewenste elektrische en mechanische stimulatie naar cellen die zijn gekoppeld aan de PDMS construct. Dit proces omvat zorgen voor goede connectiviteit en gebruiker operability via de interface van de software (Figuur 1 c, D).

De procedure voor stimulatie van de cel met behulp van dit hulpmiddel naar maat wordt beschreven in de sectie protocol.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie maakt gebruik van menselijke cardiale ATDPCs van monsters van de patiënt. Hun gebruik is goedgekeurd door de lokale ethische Commissie, en alle patiënten gaf geïnformeerde toestemming. Het studie-protocol voldoet aan de beginselen die zijn uiteengezet in de verklaring van Helsinki.

1. voorbereiding

  1. Autoclaaf twee pincet, 12 platina PTFE-meet-elektroden elektrische stimulatie en sommige papieren handdoeken, bij 121 ° C gedurende 20 minuten.
  2. Steriliseren 12 PDMS custom-made constructies (Figuur 1).
    1. Wassen elke constructie met 5 mL steriele, gedestilleerd water met magnetische agitatie bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
    2. 1 x met 5 mL 70% ethanol met magnetische agitatie bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten wassen.
    3. Wassen 5 x met 5 mL steriele, gedestilleerd water met magnetische agitatie bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten per wasbeurt, voor het verwijderen van alcoholische residuen.
    4. Droog de constructies op steriele papieren handdoeken binnen de stroom kabinet overnachting.
    5. Bewaren ze in steriele 50 mL centrifuge buizen tot gebruik.

2. de cel zaaien (dag -1)

  1. Voor cel zaaien, de schoongemaakte PDMS constructies overbrengen in steriele platen en hen blootstellen aan het ultraviolet licht voor 5 min om volledige sterilisatie.
  2. Elke constructie overbrengen in een 35 mm cel cultuur plaat, of 6-well plaat, voor onmiddellijke cel zaaien.
  3. Trypsinize een confluente T75 kolf met cardiale ATDPCs.
    1. Wassen van de T75 kolf met 5 mL 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    2. Voeg 1 mL trypsine-EDTA 0,05% en Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten om de cellen los te maken.
    3. Voeg 5 mL van volledige middellange tot de inactivering van de trypsine-EDTA.
    4. Verzamel alle cellen in een tube van 15 mL en wassen de kolf 2 x met 5 mL PBS voor het verzamelen van alle resterende cellen.
    5. Centrifugeer bij 230 x g gedurende 5 minuten bij 22 ° C, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 2 mL zuiver compleet medium om ze te tellen met de hemocytometer-zaal.
  4. Zaad van 200 µL van cardiale ATDPCs (2,5 x 105 cellen/mL) in de pool van de cel van de 12 PDMS constructies (Figuur 1A, B) dat ~ 80% van het seeding oppervlak bedekt door cellen overmorgen, en Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2.
    Opmerking: Na 2-4 h, moeten de cellen worden gekoppeld. Cel entmateriaal is bereid volgens de celgrootte en groei. Voor kleinere cellen, moet de seeding dichtheid worden verhoogd.
  5. Zachtjes, voeg 2 mL van voorverwarmde compleet medium (α-MEM aangevuld met 10% foetale boviene serum, 1 L-glutamine, en 1% penicilline-streptomycine) per plaat.
  6. Incubeer de constructies op kweekomstandigheden (meestal 37 ° C en 5% CO2) 's nachts.

3. elektromechanische stimulatie Setup (dag 0)

  1. Neem voordat u de procedure, zes constructies voor elektromechanische stimulatie en zes als nonstimulated besturingselementen. Met minder dan zes platen per stimulatie, gebruik lege constructies met de dezelfde Mediuminhoud om juiste elektrisch veld stimulatie.
  2. Reinigen van de eenheid van de stimulatie met 70% ethanol en plaats deze in de stroom kabinet.
  3. Breng de steriele elektroden en pincet in de flow-kast.
  4. 90% van de media uit de plaat van de cultuur te gemakkelijk te manipuleren de elektroden en constructies te verwijderen. Eerste, plaats de PDMS constructies in de juiste positie om de magnetische aantrekkingskracht (PDMS verplaatsing binnen de cultuur plaat naar de magneet) tussen zowel mobiele als vaste magneten. Vervolgens sluit de platina draad aan op de connectors van de elektrode en het deel van de PTFE in haar aangewezen ruimte in het PDMS construct.
  5. 2,5 mL verse voorverwarmde volledige voedingsbodem aan elke constructie toevoegen.
    Opmerking: De steriliteit gedurende de hele procedure handhaven en werken op een constructie op een moment. Handhaving van de rest van de constructies in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2 tot gebruik.
  6. Zodra alle PDMS constructies zijn geplaatst en elektrisch op het platform aangesloten, het platform terug brengen in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
  7. Sluit de elektrische en mechanische bron.
  8. Configureer het programma stimulatie. Elektrische en mechanische stimulatie regimes via de gebruikersinterface van de elektrische stimulator en de applicatie, die de mechanische stimulatie besturingselementen opgeven Stel als volgt de gelijktijdigheid.
    1. Schakel de elektrische stimulator. Wachten op het belangrijkste menu te verschijnen op het display.
      1. Selecteer optie 2: bewerken van reeks + Enter.
      2. De reeks Menu als volgt bewerken.
        1. Gebruik het tabblad modus selecteert u spanning of stroom. Selecteer huidige door te klikken op + en druk op Enter.
        2. Voor de Amplitude tab, selecteer 1 (mA) met +/- en druk op Enter.
        3. Voor de Periode (T), 1000 (ms) met +/- selecteert en druk op Enter.
        4. De impulstijd (Tw) ingesteld op 2 (ms) met +/- en druk op Enter.
        5. Selecteer externe door software voor het tabblad Trigger modus en druk op Enter.
        6. Terug in het hoofdmenu, selecteer optie 4: genereren van reeks en druk op Enter.
          Opmerking: De elektrische stimulator berust in de standby-modus totdat het een trigger-opdracht van de toepassing van de mechanische stimulator via de seriële poort ontvangt.
    2. Voer de volgende stappen in de sectie van de mechanische stimulatie van het Configuratiescherm voor de toepassing (Figuur 2C).
      1. 1.000 (ms) in het tekstvak Pulse periode schrijven.
      2. 500 (ms) in het tekstbesturingselement ON tijd (Tw) om in te stellen van de mechanische impulstijd schrijven.
      3. Schrijven 2.000 (AU) in het tekstbesturingselement excursie te leveren van een 10% construct-rek. Dit is het aantal stappen in de lineaire controle motor.
        Opmerking: Het protocol van de stimulatie hier toegepast bestaat uit afwisselende-current 2 ms monofasische blokgolf pulsen van 50 mV/cm 1 Hz en 10% stretching voor 7 dagen. De opkomst en ondergang tijden van de mechanische impuls worden ingesteld 100 ms, ongeveer imiteren de vorm van de haard druk pols. Ook de herhaling-modus is ingesteld op doorlopend en er is een teller het aantal pulsen weergeven.
  9. Wijzig de media 2 x per week (maandag en donderdag middag). Eerst, verwijder de oude media; Voeg vervolgens de warme media op de zijkanten van de PDMS steun, nooit rechtstreeks op de pool van de cel.
    Opmerking: Als de cellen een hoog groeipercentage hebben, moet de media gewijzigde 3 x per week (bijvoorbeeld maandag, woensdag en vrijdag). Het is noodzakelijk te verbreken en sluit alle kabels weer aan, maar er is geen noodzaak om de cultuur platen en elektroden van hun plaats.
  10. Verzamelen van de monsters nadat de experimenten wordt uitgevoerd.

4. sample collectie aan het eind van de experimenten (dag 7)

  1. Voor RNA analyses
    1. De constructie wassen 2 x met 3 mL 1 x PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Voeg 3 mL trypsine-EDTA 0,05% op elke plaat (genoeg ter dekking van de hele constructie) en wacht 5 minuten bij 37 ° C.
    3. Nadat de cellen zijn vrijstaand, voeg 2 mL volledige middellange tot de inactivering van de trypsine-EDTA.
    4. Verzamel alle cellen in een 15 mL tube en wassen van de constructie 2 x met 3 mL PBS voor het verzamelen van alle resterende cellen.
    5. Centrifugeer bij 230 x g gedurende 5 min bij 22 ° C.
    6. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 mL PBS.
    7. Breng de cel oplossing over in een tube 1,5 mL en centrifugeer bij 230 x g gedurende 5 min.
    8. Verwijder het supernatant en bewaar de pellet-80 ° c op 700 µL van lysis reagens voor verdere RNA isolatie.
    9. Isoleren van RNA met behulp van een commerciële kit, na instructies van de fabrikant.
    10. Omgekeerde-transcriberen de geïsoleerde RNA met behulp van de kit en willekeurige hexamers, volgens de fabrikant protocol.
    11. Preamplify voor kleine concentraties van RNA, en vervolgens verdund 1:5 met RNase-gratis water voordat daaropvolgende real-time omgekeerde transcriptie polymerasekettingreactie (RT-PCR) wordt uitgevoerd. Ga verder met het standaardprotocol voor RT-PCR in real time en belangrijkste cardiale markeringen controleren.
      Opmerking: Typische cardiale markeringen bestaan uit vroege en late markers van verschillende categorieën, zoals cardiale transcriptiefactoren (myocyte-specifieke enhancer factor 2A [MEF2A], GATA-bindend-proteïne 4 [GATA-4]) en structurele (cardiale troponine ik [cTnI], cardiale troponine T [cTnT], α-actinin) en calcium verordening (Connexin43 [Cx43], sarco-/ endoplasmatisch reticulum Ca2 +-ATPase [SERCA2])30. Isolatie van de eiwit kan ook worden uitgevoerd indien nodig. Gelijktijdige RNA en eiwit isolement kan worden uitgevoerd met hetzelfde monster, met behulp van verkrijgbare reagentia en kits (Tabel of Materials), indien de hoeveelheid van de steekproef kleiner is.
  2. Voor immunostainings
    Opmerking: Dit wordt direct op de cellen die zijn gekoppeld aan de pool van de cel van het PDMS construct uitgevoerd. Daarom raden we plaatsen, elke keer, 1 x 1 cm van paraffine film op de bovenkant van de cel-zwembad, afgezien van de plaat deksel, om te minimaliseren van de verdamping van de incubatie-oplossingen.
    1. De constructie wassen 2 x met 3 mL PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    2. De cellen die zijn gekoppeld aan de constructie met 2 mL 10% formaline gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur vast te stellen.
    3. Wassen van de cellen 3 x met 3 mL PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Voor langdurige opslag, laat de monsters in PBS met 0,1% natriumazide bij 4 ° C.
    4. Permeabilize van de cellen met 3 mL PBS + 0,5% wasmiddel (3 x, elk tijd van 5 – 10 min, bij kamertemperatuur).
    5. Incubeer de cellen met 100 µL van PBS + 10% paard serum + 0,2% wasmiddel 1% bovien serumalbumine bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, voor het blokkeren van niet-specifieke antilichaam binding.
    6. Incubeer de cellen met 100 µL van PBS + 10% paard serum + 0,2% wasmiddel + 1% bovien serumalbumine, primair antilichaam bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Bijvoorbeeld, primaire antilichamen tegen Cx43 (1:100), sarcomeric α-actinin (1:100), GATA-4 (1:50), MEF2 (1:25), en SERCA2 (1:50).
    7. 3 x met 3 mL PBS bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten wassen.
    8. Incubeer de cellen met 100 µL van PBS + secundair antilichaam bij kamertemperatuur in het donker gedurende 1 uur.
      Opmerking: Secundaire antilichamen geconjugeerd met verschillende fluorophores en een counterstaining agent werden gebruikt.
    9. Was ze 3 x met 3 mL PBS bij kamertemperatuur in het donker gedurende 5 minuten.
    10. Incubeer de cellen met 100 µL van nucleaire kleuring (0,1 µg/mL) in PBS bij kamertemperatuur in het donker gedurende 15 minuten.
    11. Was ze 3 x met 3 mL PBS bij kamertemperatuur in het donker gedurende 5 minuten.
    12. Bewaren van de monsters in 3 mL PBS met 0,1% natriumazide bij 4 ° C tot de overname.
      Opmerking: Microscoop verwerving is mogelijk op omgekeerde TL en confocal microscopen met lang-werkende afstand doelstellingen omdat de dikte van de constructie ongeveer 0,5 mm is.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 2 geeft het algemene schema gevolgd voor de stimulatie van de cel. Cellen werden kort, ontpit op het PDMS construct en onderworpen aan elektromechanische stimulatie, met een verandering van de media uitgevoerd tweemaal per week. Nonstimulated cellen werden gebruikt als een besturingselement voor de elektromechanische conditionering. Bovendien, we een extra besturingselement toegevoegd aan het experiment en onderhuids ATDPCs werden gebruikt als een best...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektromechanische stimulatie lijkt te zijn een veilig alternatief voor voorbereiden op een vijandige omgeving van de cardiale cellen en verbetering van hun cardiale inzet. Hier, een protocol beschreven voor cardiale voorlopercellen verhoogd de expressie van belangrijkste cardiale markers en was gemeld dat zij heilzaam zijn voor hun volgende implantatie op infarcted lymfkliertest myocard30. Electromechanically gestimuleerd cardiale ATDPCs verhoogd in het algemeen, de uitdrukking van de genen gerel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te verstrekken, behalve dat de stimulatie apparaat- en protocolondersteuning waren eerder gepatenteerd (WO-2013185818-A1, WO-2017125159-A1).

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen de leden van de ICREC Research Program (IGTP, Badalona) en de elektronische instrumentatie groep Biomedische (UPC, Barcelona), met name Prof. J. Rosell-Ferrer bedanken. Bovendien, erkennen de auteurs stamcellen Translational Medicine journal en AlphaMed pers voor het toelaten van de aanpassing van de eerder gepubliceerde cijfers (Llucià-Valldeperas, et al.. 30). de ontwikkeling van dit prototype en het ontwerp van het protocol werden ondersteund door Ministerio de Educación y Ciencia (SAF 2008-05144), Ministerio de Economía y Competitividad (SAF 2014-59892), de EuropeseCommissie 7e kaderprogramma ( RECATABI, NMP3-SL-2009-229239), Fundació La Marató de TV3 (080330, 201516, 201502) en Fundación para la Innovación y la Prospectiva nl Salud nl España (FIPSE; 06-00001396-15).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Stimulator
nikkel geplateerde neodymium magnetenSupermagneteQ-10-10-05-N
nikkel geplateerde neodymium magnetenSupermagneteQ-06-04-02-HN
polydimethylsiloxaan (PDMS) SYLGAR 184 Siliconen Elastomer KitDow Corning Corp184
geribde diffractiegrating (1250 groeven/mm)Newport05RG150-1250-2
Motor controllerFaulhaberMCLM-3006-S
LabviewNational Instruments
Celcultuur
fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)Gibco70013-065
0,05% trypsin-EDTAGibco25300-120
35 mm celcultuur schaalBD Falcon45353001
foetaal bovien serum (FBS)Gibco10270-106
L-Glutamine 200 mM, 100xGibco25030-024
Penicilina/Streptomicine, 10.000 U/mLGibco15140-122
Minimum essentieel medium eagle (alfa-MEM)SigmaM4526-24x500ML
Proteïne & RNA analyses
protease inhibitor cocktailSigmaP8340
QIAzol Lysis ReagensQiagen79306
AllPrep RNA/Protein KitQiagen50980404
Rneasy mini kitQiagen74104
iTaq Universal Probes One-Step KitBio-Rad Laboratories172-5140
Random hexamersQiagen79236
TaqMan PreAmp MasterMix 2xApplied Biosystems4391128
TaqMan Universal PCR MasterMixApplied Biosystems4324018
Immunostaining
10% formalinSigmaHT-501128-4L
paarden serumSigmaH1138
Triton X-100SigmaX100-500ML
Bovine Serum Albumine (BSA)SigmaA7906-100G
PARAFILMSigmaP6543
4’,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI)SigmaD9542
Phalloidin Alexa 568InvitrogenA12380
natrium azideSigmaS8032-100g
Hoechst 33342Sigma14533
Connexin-43 konijn primaire antilichaamSigmaC6219 lot#061M4823
sarcomeer α-actinine muis primaire antilichaamSigmaA7811 lot#080M4864
GATA-4 geit primaire antilichaamR&DAF2606 VAZ0515101
MEF2 konijn primaire antilichaamSanta Cruzsc-313 lot#E0611
SERCA2 geit primaire antilichaamSanta Cruzsc-8095 lot#D2709
Cy3 secundair antilichaamJackson ImmunoResearch711-165-152
Cy3 secundair antilichaamJackson ImmunoResearch715-165-151
Cy3 secundair antilichaamJackson ImmunoResearch712-165-150
Cy2 secundair antilichaamJackson ImmunoResearch715-225-150
Cy2 secundair antilichaamJackson ImmunoResearch711-225-152
Cy2 secundair antilichaamJackson ImmunoResearch705-225-147

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McDonough, P. M., Glembotski, C. C. Induction of atrial natriuretic factor and myosin light chain-2 gene expression in cultured ventricular myocytes by electrical stimulation of contraction. Journal of Biological Chemistry. 267, 11665-11668 (1992).
  2. Tandon, N., et al. Electrical stimulation systems for cardiac tissue engineering. Nature Protocols. 4, 155-173 (2009).
  3. Serena, E., et al. Electrical stimulation of human embryonic stem cells: cardiac differentiation and the generation of reactive oxygen species. Experimental Cell Research. 315, 3611-3619 (2009).
  4. Tandon, N., et al. Optimization of electrical stimulation parameters for cardiac tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5, 115-125 (2011).
  5. Zhang, X., Wang, Q., Gablaski, B., Lucchesi, P., Zhao, Y. A microdevice for studying intercellular electromechanical transduction in adult cardiac myocytes. Lab on a Chip. 13, 3090-3097 (2013).
  6. Chan, Y. C., et al. Electrical stimulation promotes maturation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Journal of Cardiovascular Translational Research. 6, 989-999 (2013).
  7. Pietronave, S., et al. Monophasic and biphasic electrical stimulation induces a precardiac differentiation in progenitor cells isolated from human heart. Stem Cells and Development. 23, 888-898 (2014).
  8. Pavesi, A., et al. Electrical conditioning of adipose-derived stem cells in a multi-chamber culture platform. Biotechnology and Bioengineering. 111, 1452-1463 (2014).
  9. Baumgartner, S., et al. Electrophysiological and morphological maturation of murine fetal cardiomyocytes during electrical stimulation in vitro. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 20, 104-112 (2015).
  10. Llucià-Valldeperas, A., et al. Electrical stimulation of cardiac adipose tissue-derived progenitor cells modulates cell phenotype and genetic machinery. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (11), 76-83 (2015).
  11. Llucià-Valldeperas, A., et al. Physiological conditioning by electric field stimulation promotes cardiomyogenic gene expression in human cardiomyocyte progenitor cells. Stem Cell Research and Therapy. 5, 93(2014).
  12. Radisic, M., et al. Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (52), 18129-18134 (2004).
  13. Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB Journal. 14, 669-679 (2000).
  14. Zimmermann, W. H., et al. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nature Medicine. 12 (4), 452-458 (2006).
  15. Birla, R. K., Huang, Y. C., Dennis, R. G. Development of a novel bioreactor for the mechanical loading of tissue-engineered heart muscle. Tissue Engineering. 13, 2239-2248 (2007).
  16. Salameh, A., et al. Cyclic mechanical stretch induces cardiomyocyte orientation and polarization of the gap junction protein connexin43. Circulation Research. 106, 1592-1602 (2010).
  17. Galie, P. A., Stegemann, J. P. Simultaneous application of interstitial flow and cyclic mechanical strain to a three-dimensional cell-seeded hydrogel. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (5), 527-536 (2011).
  18. Leychenko, A., Konorev, E., Jijiwa, M., Matter, M. L. Stretch-induced hypertrophy activates NFkB-mediated VEGF secretion in adult cardiomyocytes. PLoS One. 6, 29055(2011).
  19. Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circulation Research. 109, 47-59 (2011).
  20. Mihic, A., et al. The effect of cyclic stretch on maturation and 3D tissue formation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 35, 2798-2808 (2014).
  21. Llucià-Valldeperas, A., et al. Unravelling the effects of mechanical physiological conditioning on cardiac adipose tissue-derived progenitor cells in vitro and in silico. Scientific Reports. 8, 499(2018).
  22. Stoppel, W. L., Kaplan, D. L., Black, L. D. Electrical and mechanical stimulation of cardiac cells and tissue constructs. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 135-155 (2016).
  23. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10, 781-787 (2013).
  24. Barash, Y., et al. Electric field stimulation integrated into perfusion bioreactor for cardiac tissue engineering. Tissue Engineering Part C: Methods. 16, 1417-1426 (2010).
  25. Maidhof, R., et al. Biomimetic perfusion and electrical stimulation applied in concert improved the assembly of engineered cardiac tissue. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 6, 12-23 (2012).
  26. Feng, Z., et al. An electro-tensile bioreactor for 3-D culturing of cardiomyocytes. A bioreactor system that simulates the myocardium's electrical and mechanical response in vivo. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 24 (4), 73-79 (2005).
  27. Wang, B., et al. Myocardial scaffold-based cardiac tissue engineering: application of coordinated mechanical and electrical stimulations. Langmuir. 29 (35), 11109-11117 (2013).
  28. Morgan, K. Y., Black, L. D. Mimicking isovolumic contraction with combined electromechanical stimulation improves the development of engineered cardiac constructs. Tissue Engineering Part A. 20 (11-12), 1654-1667 (2014).
  29. Godier-Furnémont, A. F., et al. Physiologic force-frequency response in engineered heart muscle by electromechanical stimulation. Biomaterials. 60, 82-91 (2015).
  30. Llucià-Valldeperas, A., et al. Electromechanical Conditioning of Adult Progenitor Cells Improves Recovery of Cardiac Function After Myocardial Infarction. Stem Cell Translational Medicine. 6 (3), 970-981 (2017).
  31. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  32. Gelmi, A., et al. Direct Mechanical Stimulation of Stem Cells: A Beating Electromechanically Active Scaffold for Cardiac Tissue Engineering. Advanced Healthcare Materials. 5 (12), 1471-1480 (2016).
  33. Poulin, A., et al. An ultra-fast mechanically active cell culture substrate. Scientific Reports. 8 (1), 9895(2018).
  34. Bayes-Genis, A., et al. Human progenitor cells derived from cardiac adipose tissue ameliorate myocardial infarction in rodents. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (5), 771-780 (2010).
  35. Bagó, J. R., et al. Bioluminescence imaging of cardiomyogenic and vascular differentiation of cardiac and subcutaneous adipose tissue-derived progenitor cells in fibrin patches in a myocardium infarct model. International Journal of Cardiology. 169, 288-295 (2013).
  36. Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circulation Research. 90 (2), 223-230 (2002).
  37. Methods and devices for mechanical and electrical stimulation of stem cell monolayer and 3d cultures for tissue engineering applications. Spanish patent. , Barcelano, Spain. WO/2013/185818 (2013).
  38. Method for Conditioning Stem Cells. Spanish patent. , Barceleno, Spain. WO/2017/125159 (2017).
  39. Roura, S., Gálvez-Montón, C., Bayes-Genis, A. Myocardial healing using cardiac fat. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 16 (4), 305-311 (2018).
  40. Zhang, Y. M., Hartzell, C., Narlow, M., Dudley, S. C. Stem cell-derived cardiomyocytes demonstrate arrhythmic potential. Circulation. 106 (10), 1294-1299 (2002).
  41. Liu, J., Fu, J. D., Siu, C. W., Li, R. A. Functional sarcoplasmic reticulum for calcium handling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: insights for driven maturation. Stem Cells. 25 (12), 3038-3044 (2007).
  42. Wipff, P. J., et al. The covalent attachment of adhesion molecules to silicone membranes for cell stretching applications. Biomaterials. 30 (9), 1781-1789 (2009).
  43. Kim, C. iPSC technology--Powerful hand for disease modeling and therapeutic screen. Biochemistry and Molecular Biology Reports. 48 (5), 256-265 (2015).
  44. Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-Chip: A Fast Track for Engineered Human Tissues in Drug Development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
  45. Bruyneel, A. A., McKeithan, W. L., Feyen, D. A., Mercola, M. Will iPSC-cardiomyocytes revolutionize the discovery of drugs for heart disease. Current Opinion inPharmacology. 42, 55-61 (2018).
  46. Farley, A., Johnstone, C., Hendry, C., McLafferty, E. Nervous system: part 1. Nursing Standard. 28 (31), 46-51 (2014).
  47. Brotto, M., Bonewald, L. Bone and muscle: Interactions beyond mechanical. Bone. 80, 109-114 (2015).
  48. Park, S. J., et al. Neurogenesis Is Induced by Electrical Stimulation of Human Mesenchymal Stem Cells Co-Cultured With Mature Neuronal Cells. Macromolecular Bioscience. 15 (11), 1586-1594 (2015).
  49. Vianney, J. M., Miller, D. A., Spitsbergen, J. M. Effects of acetylcholine and electrical stimulation on glial cell line-derived neurotrophic factor production in skeletal muscle cells. Brain Research. 1588, 47-54 (2014).
  50. Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line. Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Electromechanische stimulatiecardiale ATDPC sPDMS constructenelektrische stimulatiecelzaaienreal time PCRGATA 4 expressieconnexine43 distributie

Gerelateerde artikelen