Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Opsporen van Protease-activiteit door fluorescerende Peptide Zymography

13K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58938

⸱

20 januari 2019

 ,  , 
1Comprehensive Cancer Center, James Cancer Hospital and Solove Research Center, Ohio State University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Ohio State University

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor een gewijzigde zymographic techniek waarin fluorescerende peptides worden gebruikt als het afbreekbaar substraat in plaats van de inheemse proteïnen. Elektroforese van biologische monsters in fluorescerende peptide zymograms maakt detectie van een breder scala van proteasen dan vorige zymographic technieken.

Samenvatting

Het doel van deze methode is voor het meten van de proteolytic activiteit van complexe biologische monsters. De monsters worden gescheiden door molecuulgewicht met behulp van elektroforese via een oplossen gel ingebed met een afbreekbare substraat. Deze methode verschilt van de traditionele gel zymography daarin een gehard fluorogenic peptide covalent is opgenomen in het oplossen gel in plaats van volledige lengte eiwitten, zoals gelatine of caseïne. Gebruik van de fluorogenic peptiden kan directe detectie van proteolytic activiteit zonder extra kleuring stappen. Enzymen in de biologische monsters klieven de gehard fluorogenic peptide, resulterend in een verhoging in fluorescentie. De fluorescerende signaal in de gels is dan beeld met een standaard TL gel scanner en gekwantificeerd aan de hand van densitometrie. Het gebruik van peptiden als het afbreekbaar substraat sterk breidt de mogelijke proteasen aantoonbaar met zymographic technieken.

Inleiding

Gel zymography is een biologische techniek voor het meten van proteolytic activiteit binnen biologische monsters, zoals lichaamsvloeistoffen of cel voedingsbodems1,2,3. De monsters worden gescheiden door hun molecuulgewicht met elektroforese via een polyacrylamidegel ingebed met een afbreekbare substraat. Gemeenschappelijke afbreekbaar substraten omvatten gelatine, caseïne, collageen en elastine, die zijn gebruikt voor het meten van de activiteit van matrix metalloproteinasen (MMP) -1 -2, -3, -7, -8, -9, en -11, naast een verscheidenheid van cathepsins1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. na elektroforese, de enzymen zijn renatured en toegestaan te degraderen de eiwit binnen de gel. In traditionele gel zymography, de gel is gekleurd met een eiwit kleurstof, zoals Coomassie Blue, en protease-activiteit wordt gedetecteerd als een verlies van signaal, dat wil zeggen, witte banden (afbraak van eiwitten) op een donker blauwe achtergrond.

Hier beschrijven we een protocol voor een alternatieve methode van gel zymography, waarin het afbreekbaar substraat een korte, fluorogenic peptide covalent opgenomen in het polyacrylamidegel (Figuur 1 is). De vervanging van synthetische peptides als de afbreekbaar substraten maakt detectie van een breder scala van proteasen in vergelijking met traditionele gel zymography met inheemse proteïnen9. Covalente koppeling van de fluorogenic peptide verhindert diffusie van peptide en migratie tijdens gelelektroforese waargenomen met vorige methoden9,10. Het gebruik van een substraat fluorogenic maakt bovendien direct opsporen van protease-activiteit zonder extra kleuring en -kleuring stappen. Het algemene doel van deze methode is het opsporen van protease-activiteit in biologische monsters via de covalente opneming van fluorogenic peptiden in zymogram gels.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. bereiding van de oplossing laag van Gel

  1. Voorbereiden van een 10%-polyacrylamide oplossen van gel oplossing volgens tabel 1. Voeg de Tetramethylethylenediamine (TEMED) en Ammonium Persulfate (APS) onmiddellijk voorafgaand aan de gel gieten als hun toevoeging polymerisatie reactie initieert.
  2. Vul een lege 1,5 mm mini gel cassette halverwege (5 mL) met de 10%-oplossing voor oplossen gel.
  3. Een dun laagje van isopropanol (~ 500 µL) toevoegen aan de bovenkant van het polyacrylamidegel te produceren een niveau gel en luchtbellen voorkomen. Gebruik de overgebleven polyacrylamide-oplossing voor het bijhouden van de voortgang van de polymerisatie-reactie. Wanneer de polyacrylamide in de buis is volledig verhard, is de reactie voltooid (~ 40 min).

2. voorbereiding van de Azido-PEG3-maleimide Linker molecuul

  1. Terwijl de eerste oplossen gel laag is actinemonomeren, de azido-PEG3-maleimide-kit ophalen uit de opslag van-20 ° C en laat de componenten tot kamertemperatuur. Er zijn twee componenten in elke kit. Flacon 1 bevat een maleimide-NHS ester, een gebroken wit naar grijs solide. Flacon 2 bevat azido-PEG3-amine, een lichtgeel olie.
    Opmerking: De auteurs suggereren met behulp van de 25 mg azido-PEG3-maleimide kit, zoals het alleen voor een korte periode van tijd (1-2 uur) kan worden opgeslagen bij-20 ° C na voorbereid voordat het begint te degraderen. 25 mg volstaat voor de productie van 10 peptide gels. Gebruik gels binnen 3 weken van voorbereiding.
  2. Los van de componenten van de flacon 2 in de fabrikant aanbevolen hoeveelheid dimethylsulfoxide (DMSO) en vortex voor 30 s om de vloeistoffen goed zijn gemengd.
  3. Breng de inhoud van de flacon 1 in een schone, droge 100 mL Rondbodemkolf met een roer-bar.
    Opmerking: Spoel de kolf met aceton en volledig drogen vóór gebruik om te voorkomen dat vocht uit te bemoeien met de reactie.
  4. Onmiddellijk invoegen een rubberstop tussenschot met een membraan die met een spuit in de mond van de kolf kan worden doorboord. Werk snel om te voorkomen dat vocht de kolf.
  5. Invoegen twee 18 meter syringe naalden in het middenrif en sluit een aan de gastank van een inert (bijvoorbeeld argon gas). Toestaan dat het inert gas te vullen de kolf gedurende 3 min. Mix de componenten van de flesjes 1 en 2 onder inert gas om te voorkomen dat ongewenste reactieproducten.
    Let op: De tweede naald van de spuit is bedoeld als een vent, waardoor de atmosferische lucht die deel uitmaakt van de kolf uit de kolf stromen als het vult met inert gas. Vergeet niet om op te nemen van een vent naald!
  6. Uitschakeling van het inert gas en het loskoppelen van de naald. Behulp van een spuit, injecteert de volledige inhoud van de flacon 2 in de kolf.
  7. Verwijder zowel naalden en spuiten en de Components wilt mengen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur tijdens het roeren.
  8. Verwijder de rubber tussenschot stop en de inhoud overbrengen in een centrifugebuis schone 5 mL. De azido-PEG3-maleimide-oplossing moet binnen 1 uur bij kamertemperatuur worden gebruikt.

3. voorbereiding van de Peptide Gel laag oplossen

  1. Zodra de eerste oplossen gel laag heeft polymeervorm, giet af de isopropanol-laag. Spoel de bovenkant van de gel door pipetting 1 mL gedeïoniseerd water op de bovenkant van de gel en giet uit het water.
  2. De thiol-matiemaatschappij fluorescerende peptide ophalen-80 ° C-opslag en laat ze ontdooien op kamertemperatuur.
    Opmerking: De thiol-matiemaatschappij peptide kan bereid worden zoals eerder beschreven11,12. Verkrijgbare peptiden kunnen ook worden gebruikt maar vereist de toevoeging van een terminal cysteine residu om de maleimide-thiol Klik op reactie. Los van de peptide tot een voorraad concentratie van 10 mM en opslaan bij-80 ° C in kleine (30 uL) porties te beperken van herhaalde bevriezen-ontdooien cycli.
  3. Voorbereiden van een 10% oplossing van gel oplossing met het linker azido-PEG3-maleimide-molecuul en de fluorescerende peptide volgens tabel 1. Voeg de TEMED en de APS onmiddellijk voorafgaand aan de gel gieten als hun toevoeging polymerisatie reactie initieert.
  4. Vul de helft van het resterende deel van de gel cassette (3 mL) met de peptide oplossen van gel oplossing.
    Opmerking: Een multi-layer oplossen gel aanpak vermindert de hoeveelheid peptide en linker nodig voor elke gel. De grootte van de peptide oplossen gel laag kan worden aangepast aan een grotere reeks molecuulgewichten zo nodig.
  5. Pipetteer een dun laagje van isopropanol (~ 500 µL) naar de top van het polyacrylamidegel te produceren een niveau gel en luchtbellen voorkomen. Gebruik de overgebleven polyacrylamide-oplossing voor het bijhouden van de voortgang van de polymerisatie-reactie. Wanneer de polyacrylamide in de buis is volledig verhard, is de reactie voltooid (~ 40 min).
    Opmerking: De fluorescerende peptide is lichtgevoelig. Houd de gels bedekt met aluminiumfolie ter voorkoming van photobleaching tijdens de voorbereiding van het gel elektroforese, wassen en ontwikkeling.
  6. Giet af de laag isopropanol en spoel de bovenkant van de peptide oplossen van gel met gedeïoniseerd water zoals in stap 3.1.
  7. Als met behulp van de gels onmiddellijk, gaat u verder met stap 4, anders, dompel de bereid gels in 100 mL 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij 4 ° C in een plastic doosje om te voorkomen dat de gels uitdrogen. Wikkel het vak in aluminiumfolie om te voorkomen dat photobleaching. Gels, kunnen worden opgeslagen in PBS voor maximaal 3 weken voorafgaand aan gebruik.

4. voorbereiding van de stapelvolgorde Gel

  1. Bereid een 5% stapelen-gel oplossing volgens tabel 1. Voeg de TEMED en de APS onmiddellijk voorafgaand aan de gel gieten als hun toevoeging polymerisatie reactie initieert.
  2. Vul het resterende lege gedeelte van de gel cassette (~ 2 mL) met de stapelvolgorde gel-oplossing.
  3. Snel een 1,5 mm gel kam in de stapelvolgorde gel laag invoegen, om ervoor te zorgen geen luchtbellen blijven opgesloten onder de putten. Gebruik de overgebleven polyacrylamide-oplossing voor het bijhouden van de voortgang van de polymerisatie-reactie. Wanneer de polyacrylamide in de buis is volledig verhard, is de reactie voltooid (~ 10 min).
  4. Verwijder voorzichtig de kam en de tape vanaf de achterkant van de cassette van de gel.

5. bereiding van biologische monsters voor elektroforese

  1. Bereiden geconditioneerde cel media, cel lysates weefsel homogenates en MMP normen zoals elders beschreven onder niet-reducerende omstandigheden2. De monsters niet verhit.
  2. Bijvoorbeeld, bereiden geconditioneerde cel media als volgt:
    1. Plaat 40.000 cellen/cm2 cellen in een 6-well plaat in 10% foetale runderserum (FBS) voedingsbodems. Incubeer de cellen in een bevochtigde kamer (5% CO2 bij 37 ° C) voor 24 uur en laat hen tot 70-80% samenvloeiing.
      Opmerking: Als de cellen de gewenste confluentie na 24 uur niet hebben bereikt, hen in staat stellen om te groeien in 10% FBS voedingsbodems voor een aanvullende 24 uur.
    2. Spoel de cellen tweemaal met PBS en voeg toe 2 mL serum-vrije cultuur media. Incubeer de cellen in een bevochtigde kamer (5% CO2 bij 37 ° C) voor een aanvullende 24 uur.
    3. Met behulp van een serologische precisiepipet, verzamelen de geconditioneerde media van elk putje. Centrifugeer de media van 1200 toeren per minuut gedurende 3 minuten aan elke cel puin te verwijderen. Neem het supernatant en concentreren met behulp van een 15 mL, 10 kDa molecuulgewicht cutoff centrifugaal filter eenheid. Centrifugeer de eenheden van de filter op 4.000 x g gedurende 15 min. in een swingende emmer rotor of 5000 x g gedurende 15 min. in een vaste hoek rotor.
      Opmerking: Deze stap is optioneel, maar de intensiteit van de Proteolytische bands in de peptide zymography gels kunt verbeteren.
    4. Het geconcentreerde filtraat overbrengen in een centrifugebuis verse 1,5 mL. Aliquot en winkel monsters bij-80 ° C gedurende maximaal drie bevriezen-ontdooien cycli.
  3. Gehalte aan andere melkeiwitten met behulp van een standaard eiwit kwantificering assay kwantificeren (bijvoorbeeld BCA, de analyse van Bradford, enz.).

6. de Elektroforese van biologische monsters in Peptide Zymography Gels

  1. Ontbinden van monsters in conventionele zymography monster buffer (62,5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 25% glycerol, 4% SDS, 0,01% bromophenol blauw). Voor cel- en weefseltransplantaties monsters, ~ 30 µg totaal eiwit per putje wordt aanbevolen, en 50-100 ng van eiwitten voor de MMP-normen.
  2. Voeg 400 mL 1 x Tris-Glycine SDS uitvoeren Buffer op de gel-apparatuur. Laad tot 35 µL van monster per putje. De monsters worden uitgevoerd op 120 V bij 4 ° C gedurende 1,5 uur of totdat de molecuulgewicht normen geven aan dat de proteasen van belang binnen de peptide oplossen van gel laag zijn (die heeft een zichtbare oranje kleur).
    Opmerking: De meeste MMP en hun varianten vallen binnen het bereik van 35-100 kDa. Wanneer de molecuulgewicht normen aangeven dat deze gewichten zijn binnen de peptide oplossen van gel laag, kan elektroforese worden gestopt. Hetzelfde principe kan worden toegepast op andere soorten proteasen met bekend molecuulgewicht. Als er belangstelling voor het opsporen van meerdere proteasen over een grotere reeks molecuulgewichten, verminderen van de grootte van het oplossen gel laag en het vergroten van de peptide oplossen gel laag.
  3. Na elektroforese, verwijder de gels uit de plastic cassette en wassen gels driemaal voor elke 10 min bij kamertemperatuur onder zachte agitatie in waterlopen buffer met 2,5% Triton X-100, 1 µM ZnCl2en 5 mM CaCl2 in 50 mM Tris-HCl, pH 7.5.
  4. Gels voor overdracht aan een derde Bufferoplossing met 1% Triton X-100, 1 µM ZnCl2 en 5 mM CaCl2 in 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 voor 15 min. vervangen met de ontwikkeling van de verse buffer oplossing en incubeer gels bij 37 ° C onder zachte agitatie voor 24 uur , om ervoor te zorgen de gels zijn volledig onderdompelen in de oplossing.

7. beeldvorming van Peptide Zymography Gels

  1. Na 24 uur gel afbeelding gels met behulp van een TL scanner/imager met behulp van de geschikte filters voor excitatie en emissie. Bijvoorbeeld, de peptide gels in de representatieve resultaten weergegeven zijn geconjugeerd met fluoresceïne en werden beeld met behulp van een filter van de excitatie van 488 nm en een filter van de emissie van 521 nm. Met behulp van de juiste filters voor uw fluorophore zal het maximaliseren van de opsporing van proteolytic activiteit.
    Opmerking: Afbeeldingen kunnen ook worden genomen met een gel imager uitgerust met een UV-transilluminator, vaak gebruikt voor de beeldvorming van DNA gels gekleurd met ethidiumbromide. Afbeelding van de gels met behulp van de UV-transilluminator (365 nm) instelling en een filter van de emissie van 590 nm.
  2. Densitometric evaluatie van intensiteiten van de band met behulp van ImageJ zoals elders beschreven13uit te voeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Met behulp van de methode beschreven hier, twee fluorescerende protease-afbreekbaar peptiden werden ingelijfd bij polyacrylamide gels: GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (afgekort als QGIW in de gehele tekst en cijfers) en GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2 C (afgekort als LACW in de gehele tekst en cijfers). ↓ geeft aan de site van decollete. QGIW is een collageen-ik afgeleid reeks ontworpen voor het opsporen van cellulaire collagenases14. LACW is een reeks ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Huidige zymographic technieken, is afhankelijk van de opneming van een native substraten in polyacrylamide gels voor de detectie van proteolyse. Terwijl deze technieken hebt opgeslaen wijdverbreide gebruik, zijn ze nog steeds beperkt in het aantal proteasen die ze kunnen detecteren. Hier werd een protocol beschreven in welke TL, protease-afbreekbaar peptiden zijn opgenomen in de polyacrylamide oplossen van gel. Covalente koppelen met behulp van een azido-PEG3-maleimide linker molecuul in staat stelt de scheiding en opspo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Financiering verstrekt door The Ohio State University College of Engineering, Biomedical Engineering afdeling en de uitgebreide Cancer Center - Arthur G. James kanker ziekenhuis en Richard J. Solove Research Institute.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mm Empty Gel CassettesThermoFisher ScientificNC2015
1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette CombsThermoFisher ScientificNC3510
1x Phosphate Buffered SalineFisher Scientific10-010-049
20% SDS SolutionAmbionAM9820
3x Zymography Sample BufferBio-Rad1610764
40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1)AmbionAM9022
6 Well Tissue Culture PlatesThermoFisher Scientific087721B
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO)Sigma-AldrichUFC201024
Ammounium PersulfateSigma-AldrichA3678
Azido-PEG3-Maleimide KitClick Chemistry ToolsAZ107
Calcium ChlorideThermoFisher ScientificBP510100
Dimethyl SulfoxideFisher ScientificBP231
IsopropanolFisher ScientificA416P
Micro BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23235
N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)Sigma-AldrichT9281
PowerPac Basic Power SupplyBio-Rad1645050
Precision Plus Protein Dual Color StandardBio-Rad161-0374
PrecisionGlide Hypodermic NeedlesFisher Scientific14-826
Round Bottom Flask (100 mL)Fisher Scientific50-873-144
Septum Rubber StopperFisher Scientific50-872-546
Sterile Slip Tip Syringe (1 mL)Fisher Scientific14-823-434
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Trizma hydrochlroideSigma-AldrichT5941
Typhoon 9410 Molecular ImagerGE Amersham8149-30-9410
Zinc ChlorideSigma-Aldrich208086

Referenties

  1. Vandooren, J., Geurts, N., Martens, E., Vanden Steen, P. E., Opdenakker, G. Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes. Nature Methods. 10 (3), 211-220 (2013).
  2. Toth, M., Fridman, R. Assessment of Gelatinases (MMP-2 and MMP-9) by Gelatin Zymography. Methods in Molecular Medicine. 57, (2001).
  3. Heussen, C., Dowdle, E. B. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Analytical Biochemistry. 102 (1), 196-202 (1980).
  4. Gogly, B., Groult, N., Hornebeck, W., Godeau, G., Pellat, B. Collagen zymography as a sensitive and specific technique for the determination of subpicogram levels of interstitial collagenase. Analytical Biochemistry. 255 (2), 211-216 (1998).
  5. Inanc, S., Keles, D., Oktay, G. An improved collagen zymography approach for evaluating the collagenases MMP-1, MMP-8, and MMP-13. BioTechniques. 63 (4), 174-180 (2017).
  6. Perera, H. K. I. Detection of Aspartic Proteinase Activities Using Gel Zymography. Zymography. , 43-52 (2017).
  7. van Beurden, P. A. M. S. noek-, Vonden Hoff, J. W. Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors. BioTechniques. 38 (1), 73-83 (2005).
  8. Oliver, G. W., Stetler-Stevenson, W. G., Kleiner, D. E., Zymography, Zymography, Casein Zymography, and Reverse Zymography: Activity Assays for Proteases and their Inhibitors. Proteolytic Enzymes. Springer Lab Manual. , Springer. Berlin, Heidelberg. 63-76 (1999).
  9. Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. Detection of proteolytic activity by covalent tethering of fluorogenic substrates in zymogram gels. BioTechniques. 64 (5), 203-210 (2018).
  10. Yasothornsrikul, S., Hook, V. Y. Detection of proteolytic activity by fluorescent zymogram in-gel assays. BioTechniques. 28 (6), 1172-1173 (2000).
  11. Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
  12. Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).
  13. Ren, Z., Chen, J., Khalil, R. A. Zymography as a Research Tool in the Study of Matrix Metalloproteinase Inhibitors. Methods in Molecular Biology. 1626, Clifton, N.J. 79-102 (2017).
  14. Nagase, H., Fields, G. B. Human matrix metalloproteinase specificity studies using collagen sequence-based synthetic peptide. Biopolymers. 40 (4), 399-416 (1996).
  15. Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1′ Positions. Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).
  16. Thimon, V., Belghazi, M., Labas, V., Dacheux, J. -L., Gatti, J. -L. One- and two-dimensional SDS-PAGE zymography with quenched fluorogenic substrates provides identification of biological fluid proteases by direct mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 375 (2), 382-384 (2008).
  17. Sun, X., Salih, E., Oppenheim, F. G., Helmerhorst, E. J. Activity-based mass spectrometric characterization of proteases and inhibitors in human saliva. Proteomics. Clinical Applications. 3 (7), 810-820 (2009).
  18. Yu, W., Woessner, J. F. Heparin-Enhanced Zymographic Detection of Matrilysin and Collagenases. Analytical Biochemistry. 293 (1), 38-42 (2001).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Detectie van proteaseactiviteitpeptide-scheidingsgelvergelijking van gelatinzymografiefluorescente gelscannerincubatie in ontwikkelingsbufferbehandeling met MMP-remmerontwerp van peptidesubstraatanalyse van biomateriaaldegradatieWestern blot-verificatie
Opsporen van Protease-activiteit door fluorescerende Peptide Zymography
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.