Kwantificeren van de heterogene verdeling van een Synaptic proteïne in de hersenen van de muis met immunofluorescentie

Summary

Hier beschrijven we een kwantitatieve benadering bij de vaststelling van de verdeling van een synaptic eiwit ten opzichte van een marker eiwit met immunofluorescentie kleuring, confocal microscopie en computer-gebaseerde analyse.

Abstract

De aanwezigheid, afwezigheid of niveaus van specifieke synaptic eiwitten kunnen ernstige synaptische transmissie beïnvloeden. Naast het ophelderen van de functie van een eiwit, is het belangrijk om ook de verdeling ervan. Hier beschrijven we een protocol met immunofluorescentie, confocal microscopie en computer-gebaseerde analyse om te bepalen van de verdeling van de synaptische proteïne verhuizer (ook wel TPRGL of SVAP30 genoemd). We vergelijken de verdeling van de Mover met die van de synaptische vesikel eiwit synaptophysin, waardoor het bepalen van de verdeling van de Mover op een kwantitatieve manier ten opzichte van de overvloed van synaptische vesikels. Deze methode kan met name mogelijk worden uitgevoerd als u wilt toestaan voor de vergelijking van de verdeling van eiwitten met verschillende antilichamen of microscopen of over verschillende studies. Onze methode omzeilt de inherente variabiliteit van immunefluorescentie technieken door de opbrengst van een verhouding in plaats van absolute fluorescentie niveaus. De methode die we beschrijven, kunnen bovendien de onderzoeker voor het analyseren van de verdeling van een eiwit op verschillende niveaus: van hele hersenen segmenten hersengebieden aan verschillende deelgebieden in één hersenen gebied, zoals de verschillende lagen van de hippocampus of sensorische cortices. Verhuizer is een gewerveld dier-specifieke eiwit dat is gekoppeld aan de synaptische vesikels. Met deze methode, laten we zien dat de Mover is ongelijkmatig verdeeld over de hersengebieden, met hoge niveaus in het ventrale pallidum, de septal kernen en de amygdala en ook binnen één hersengebieden, zoals de verschillende lagen van de hippocampus.

Introduction

Communicatie tussen de neuronen gebeurt op gespecialiseerde contact sites synapsen genaamd. Synapsen bevatten een groot aantal verschillende eiwitten die orkestreren van synaptische transmissie. Sommige van deze eiwitten Toon een heterogene distributie in het zenuwstelsel en zijn niet aanwezig in elke synapse¹. Een voorbeeld van een dergelijke eiwitten is Munc13, die bij het proces van de priming van synaptische vesikels betrokken is. Er zijn verschillende isoforms van Munc13, die zijn ongelijkmatig verdeeld in de hersenen², en de aanwezigheid of de afwezigheid van specifieke isoforms kunt beïnvloeden op korte termijn synaptische plasticiteit en synaptische vesikel dynamics^{3, 4 , 5}. Daarom is het van vitaal belang voor zitten kundig voor de aanwezigheid van verschillende synaptic eiwitten over hersengebieden identificeren.

De methoden van keuze voor kwantificering van synaptic eiwitten - tot dusver - zijn massaspectrometrie en westelijke bevlekken, in plaats van immunohistochemistry^6,,^7,,^8,9. In sommige gevallen zijn verschillende methoden gebruikt als aanvulling op elkaar om te beoordelen van zowel het aantal en de lokalisatie van specifieke proteïnen (d.w.z.Wilhelm, et al.. ¹⁰). de methode we hier beschrijven voorziet de lokalisatie en de kwantificering van proteïnen van belang zonder de noodzaak van het gebruik van elke biochemische methode, gewoon dienst immunefluorescentie technieken. Een ander voordeel hier is dat de kwantificering kan worden gedaan over gebieden veel kleiner, verwezenlijkt en derhalve, meer specifiek, dan die door andere methoden. Echter moet men rekening houden dat een betrouwbare referentie-eiwit nodig is om te beoordelen van de verdeling van de proteïne van belang.

Fluorescerende vlekken door immunohistochemistry stelt ons in staat om routinematig de lokalisatie van eiwitten over hersengebieden alsook binnen verschillende neuronale compartimenten. Ter identificatie van de verschillende compartimenten, worden specifieke markers gebruikt. Typisch, antilichamen tegen synapsin en synaptophysin¹¹ kunnen worden gebruikt om te etiketteren van synaptische vesikels, terwijl antilichamen tegen fagot label de actieve zone van een presynaptische terminal¹². Vesiculaire vervoerders, zoals de vesiculaire glutamaat vervoerders (vGluT) of vesiculaire GABA vervoerder (vGAT), worden gebruikt voor het label excitatory¹³ en remmende¹⁴ presynaptische terminals, respectievelijk. Aan de postsynaptisch kant, kunnen antistoffen tegen het eiwit Homer worden gebruikt om te markeren postsynaptisch terminals en antilichamen tegen postsynaptisch dichtheid eiwit 95 (PSD95)^15,16,17 of gephyrin^{18 , 19 , 20} kan respectievelijk excitatory of remmende postsynaptisch terminals, label. Met behulp van antilichamen tegen een proteïne van belang en markeringen zoals degene hierboven beschreven, kan men de lokalisatie van dergelijke eiwitten bepalen. Veel studies tot nu toe hebben gedaan in een kwalitatieve wijze²¹. Echter om te bepalen op een betrouwbare manier de differentiële verdeling van een specifieke synaptic proteïne, moet een niet alleen bepalen de aanwezigheid of afwezigheid maar ook haar relatieve concentratie. De heterogeniteit van grootte en bevolkingsdichtheid van synapsen is het belangrijk om een verhouding tussen de synaptische markering en de proteïne van belang. Anders, synapse-rijke regio's zoals de niet-piramidale lagen van de hippocampus en de moleculaire laag van het cerebellum zal tonen een hoge dichtheid van synaptic eiwitten, alleen als gevolg van de hogere dichtheid van synapsen maar niet als gevolg van een sterke aanwezigheid van deze eiwitten in elke synapse (b.v., Wallrafen en Dresbach¹). Aan de andere kant, zal eiwitten in de neuronale soma (b.v., TGN38²²) meestal sterke aanwezigheid in de hippocampal piramidale cellaag of hippocampal of cerebellaire submodule cellaag vanwege de hoge concentratie van neuronale cel organen weergeven in die gebieden. Deze niet-homogene verdeling van structuren, synapses daarom in dit geval, kan leiden tot een valse raming van de verdeling van de proteïne van belang zelf. Bovendien is er een intrinsieke variabiliteit in intensiteiten in verschillende steekproeven in technieken immunohistochemische kleuring. Het protocol beschreven hier houdt dit rekening en vermijdt dergelijke vooroordelen, evenals andere beperkingen die voortvloeien uit de immunohistochemische methoden.

In onze recente studie, wij hebben gebruikte deze methode voor het beschrijven van de differentiële expressie van Mover (ook wel TPRGL²³ SVAP30²⁴) over 16 verschillende hersenen gebieden¹. Verhuizer is een gewerveld dier-specifieke synaptic eiwit dat kan worden gevonden in associatie met synaptische vesikels en invloeden van de neurotransmitter release^25,26,27. We hebben de Mover uitdrukking aan de overvloed van synaptische vesikels, gerelateerde door kleuring voor synaptophysin als merkstof referentie synaptic blaasje. We vonden de hoge niveaus van de Verhuizer van met name in de septal kernen, de ventrale pallidum en de amygdala. Binnen de hippocampus vonden we een heterogene verdeling van de Mover, met hoge niveaus in de lagen die zijn gekoppeld aan de intra-hippocampal berekening, en lage niveaus in de input- en output lagen.

Protocol

Dit protocol geen experimenten op levende dieren. Experimenten met euthanizing van dieren naar het verkrijgen van de hersenen monsters werden goedgekeurd door de bescherming van de dieren van de lokale autoriteiten (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) onder het goedkeuringsnummer T 10/30.

Opmerking: Voor dit protocol, 3 volwassen mannelijke C57BL/6 muizen werden gebruikt.

1. de monstervoorbereiding

1. Bereiden fixeer en 0,1 M fosfaatbuffer (PB; Zie tabel 1).
2. Monteren van het dier door transcardial perfusie, zoals beschreven in Gage et al. ²⁸. eerst wassen het bloed met 0,9% NaCl-oplossing, dan perfuse met 30 mL 4% paraformaldehyde (PFA).
3. Open de schedel met een schaar en zorgvuldig het isoleren van de hersenen met behulp van een lepel met stompe randen om te voorkomen beschadiging van het weefsel.
4. Vullen van een tube van 50 mL reactie met fixeer en de hersenen in 4% postfix PFA bij 4 ° C's nachts.
5. Verwijder de fixeer en wassen van de hersenen in 50 mL 0,1 M PB op een shaker voor 30 min.
6. Na het wassen, Incubeer de hersenen in een 50 mL reactiebuis in 30% sacharose in 0,1 M PB gedurende 48 uur of totdat het zinkt in de buis bij 4 ° C voor cryoprotection.
7. Versiering van de hersenen van cryoprotected met een scherp mes, plaatst u deze in een cryomold en insluiten met optimale scherpe temperatuur (OCT) samengestelde. Vermijd bellen. Oriënteren van de hersenen en het bevriezen van de cryomold in de vriezer-80 ° C.
8. Monteer het bevroren weefsel voor segmenteren. Equilibreer het weefsel aan de cryomicrotome temperatuur gedurende ten minste 15 minuten voordat het segmenteren.
9. Het gedeelte van de hersenen in 25 µm dik coronale plakjes. Raak de LGO zorgvuldig met een glas haak zonder het aanraken van het hersenweefsel. 3 aangrenzende segmenten per putje in een 24 goed bord verzamelen en bewaren ze in 0,1 M PB bij 4 ° C tot vlekken.
   Opmerking: Het protocol kan worden gepauzeerd hier voor maximaal twee weken. Langere opslag tijden kunnen interfereren met de kwaliteit van het weefsel en dus invloed op de uitkomst van het experiment.

2. immunofluorescentie

1. Bereiden van oplossingen, waaronder de buffer met blokkerend, antilichaam buffer, wassen van de buffer 1 en wassen buffer 2 (Zie tabel 1).
2. Spoel segmenten eenmaal met PB te verwijderen overtollige OCT.
   1. Verwijder de oplossing met een plastic pipet zonder zuigen in de segmenten van de hersenen. Voeg 250 µL van verse PB met een 1000 µL pipet.
      Let op: Segmenten moeten niet uitdrogen, dus verwijderen en toevoegen van vloeistoffen goed door goed.
3. Verwijder de PB met een plastic pipet en voeg 250 µL van buffer met blokkerend per putje met een 1000 µL pipet. Incubeer gedurende 3 uur bij kamertemperatuur (RT) op het schudapparaat.
4. Tijdens de incubatietijd, Verdun de primaire antilichamen in antilichaam buffer in een reactiebuis. Gebruik van 250 µL antilichaam buffer per putje en voeg de juiste hoeveelheid antilichaam (Zie tabel 2) waarbij het direct in de oplossing met behulp van een precisiepipet 2 µL eveneens. Meng de oplossing door zachtjes op en neer meermaals pipetteren. Vortex kort daarna opgeven, zodat de juiste mengen.
   Opmerking: Om te bepalen van de achtergrond fluorescentie, technieken moet ook worden uitgevoerd zonder toevoeging van het primaire antilichaam. Incubeer het segment in antilichaam oplossing zonder primaire antilichamen volgens het protocol daarvoor.
5. Nadat de incubatietijd, verwijdert u de buffer met blokkerend met een plastic pipet en voeg 250 µL van antilichaam oplossing met primaire antilichamen per putje. Incubeer segmenten met primair antilichaam 's nachts bij 4 ° C op een shaker.
6. Volgende dag wassen de segmenten met het wassen van de buffer 1 3 x voor 10 min op RT op een shaker.
   1. Verwijder het medium met een plastic pipet en voeg 300 µL per putje buffer 1 te wassen. Incubeer bij RT gedurende 10 min. Herhaal 3 keer.
7. Verdun de fluorophore-coupled secundaire antilichamen in antilichaam buffer in een reactiebuis tijdens de stappen wassen. Gebruik van 250 µL antilichaam buffer per putje en voeg de juiste hoeveelheid antilichaam (Zie tabel 2) waarbij het direct in de oplossing met behulp van een precisiepipet 2 µL eveneens. Meng de oplossing door zachtjes op en neer meermaals pipetteren. Vortex kort daarna opgeven, zodat de juiste mengen.
   Let op: Omdat de antilichamen lichtgevoelig zijn, moeten alle stappen vanaf dit punt worden uitgevoerd in het donker.
8. Na het wassen stappen, verwijder het wassen met een plastic pipet buffer en voeg 250 µL van antilichaam oplossing met secundaire antilichamen per putje. Incubeer de plakjes met secundair antilichaam voor 90 min op de RT in het donker.
9. Wassen van de segmenten met het wassen van buffer 2 3 x voor 10 min op RT.
10. Tijdens de stappen wassen, Verdun 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) in 0,1 M PB in een concentratie van 1:2000.
11. Verwijder de wassen buffer 2 met een plastic pipet en voeg 250 µL van DAPI oplossing per putje. Incubeer gedurende 5 min op RT op het schudapparaat.
12. Verwijder de DAPI-oplossing met een plastic pipet en voeg 500 µL van 0,1 M PB per putje met een 1000 µL pipet.
13. Segmenten op Microscoop-dia's koppelen.
    1. Plaats een microscoopglaasje onder de stereoscoop. Met een fijne borstel, voeg drie afzonderlijke druppels van 0,1 M PB in de dia verschijnt. Plaats één segment per druppel op het microscoopglaasje.
    2. Gebruik de fijne borstel afvlakken en oriënteren van de segmenten op het microscoopglaasje.
    3. Als alle segmenten correct zijn geplaatst, verwijderen van overtollige PB met een tissue en droog de dia zorgvuldig.
       Let op: Vermijd de segmenten van de hersenen volledig drogen.
    4. Voeg 80 µL van het medium in de dia insluiten. Zorgvuldig lager het dekglaasje aan in de dia verschijnt, waardoor de hersenen segmenten te embedding.
    5. Laat de dia's in de zuurkast gedurende 1-2 uur drogen (behandelen hen Voorkom blootstelling aan licht) en bewaar ze in een Microscoop dia doos bij 4 ° C.
       Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

3. beeldvorming

1. Nadat het insluiten medium volledig gehard is, plaatst u het microscoopglaasje onder de confocal microscoop.
   Opmerking: Epifluorescence microscopie in combinatie met deconvolutie software moet soortgelijke beeldkwaliteit opleveren.
2. De laser-instellingen aanpassen door vergroten of verkleinen van de intensiteit van de laser voor elk kanaal, zodat enkele pixels zijn overbelicht om ervoor te zorgen maximale verspreiding van grijze waarden.
3. Verwerven van virtuele weefsels van het hele brein segment voor de verschillende kanalen.
   1. In de denkbaar software (Zie Tabel of Materials), selecteert u de optie van de tegels en het segment van de hersenen met de Tegel regio Setuphandmatig af te bakenen.
   2. Steunpunten in de hele regio tegel verspreiden en aanpassen van de focus voor de verschillende steunpunten door op te drukken Controleren of tegel regio's / posities...
   3. Pas de instellingen in de Acquisitie modus volgens de gewenste resolutie en bestandsgrootte van de resulterende afbeelding en de scan starten.
4. Wanneer de scan is voltooid, de Stitching functie gebruiken voor het verwerken van het virtuele weefsel. Het bestand exporteren als een TIF met de functie Afbeelding exporteren.

4. computer-gebaseerde analyse

1. Alle interne kanalen voor één afbeelding in FIJI²⁹ door te klikken op bestand laden | Open.
2. Met het gereedschap Freehand bakenen een halfrond in de DAPI-kanaal. Maak een masker van de selectie door te klikken op bewerken | Selectie | Masker maken.
3. Bepalen van de intensiteit van de fluorescentie van de gemiddelde voor de enkele kanalen (Mover en synaptophysin) door te klikken op analyseren | Maatregel.
   Opmerking: Zorg ervoor dat de verschillende kanalen om te bepalen van de gemiddelde fluorescentie intensiteitswaarden voor elk kanaal te selecteren.
4. De intensiteit van de fluorescentie van de gemiddelde voor de enkele kanalen naar een werkblad kopiëren.
5. Bepalen de intensiteit van de fluorescentie van de gemiddelde voor de enkele kanalen in een gebied van belang door het gebied ook met het gereedschap Freehand selecteren uitgezet. Een muis hersenen atlas gebruiken als referentie.
6. Herhaal stap 4.1-4.5 voor alle hemisferen en alle gebieden van belang.
   Opmerking: De waarden voor elk halfrond afzonderlijk bepalen om later vergelijken de waarden in een gebied van belang dat in het halfrond (zie stap 5.2).

5. de gegevensverwerking

1. In het geval dat de achtergrond fluorescentie is hoog (Zie discussie), een achtergrond aftrekken nodig zou zijn. Daarvoor, bepalen de intensiteit van de fluorescentie van de gemiddelde voor het segment worden verwerkt zonder primair antilichaam tegen het referentie-eiwit (hier: synaptophysin) en die waarde van alle waarden die zijn verkregen voor de hersengebieden en halfrond aftrekken.
2. Wanneer de gemiddelde fluorescentie intensiteiten voor de enkele kanalen voor elke halfrond en elk gebied van belang zijn vastgesteld (Zie tabel 3), de Mover in verhouding tot de synaptophysin door de waarde voor de Mover te delen door de waarde voor synaptophysin (berekenen geel in tabel 3). Deze actie uitvoeren voor elk halfrond en elk gebied van belang afzonderlijk.
3. Verdeel de verhouding voor een interessegebied verkregen door de verhouding tussen de verkregen voor het overeenkomstige halfrond (oranje in tabel 3) om te bepalen van de verhouding van het gebied van belang zijn voor het halfrond.
4. Om te bepalen van de relatieve Mover overvloed, vertalen de verhouding tussen de verkregen in 5.2 in een percentage door haar afwijking van 1 (rood in tabel 3). Een ratio van 1,25 zou daarom een relatieve Mover overvloed van 25% boven het gemiddelde, en een verhouding van 0,75 een relatieve Mover overvloed van 25% onder het gemiddelde zou opleveren.

Results

Vertegenwoordiger kleuring patronen van verschillende markers te zien in Figuur 1. Het patroon is afhankelijk van de verdeling van het eiwit. Voorbeelden van vijf rostro-caudal niveaus worden weergegeven in kolommen (A)-(E). Een representatieve DAPI kleuring wordt weergegeven in de eerste rij: DAPI houdt vast aan het DNA van een cel en dus kernen zijn gekleurd. Dit resulteert in een punctate patroon. Regio's met een hoge celd...

Discussion

De methode hier beoogt het kwantificeren van de distributie van een proteïne van belang ten opzichte van de overvloed van een marker eiwit met een bekende verdeling gepresenteerd. Immunofluorescentie kleuring prima overweg met een hoge variabiliteit van kleuring intensiteiten tussen verschillende segmenten. De hier beschreven aanpak van de kwantificering omzeilt dit probleem door het bepalen van de verhouding van de proteïne van belang zijn voor het gemiddelde over het halfrond. Daarom verschillende kleuring intensiteite...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL reactiebuisjes	Eppendorf	30120094
50 mL reactiebuisjes	Greiner Bio-One	227261
multiwell 24 well	Fisher Scientific