Kwantificeren van de heterogene verdeling van een Synaptic proteïne in de hersenen van de muis met immunofluorescentie

Summary

Hier beschrijven we een kwantitatieve benadering bij de vaststelling van de verdeling van een synaptic eiwit ten opzichte van een marker eiwit met immunofluorescentie kleuring, confocal microscopie en computer-gebaseerde analyse.

Abstract

De aanwezigheid, afwezigheid of niveaus van specifieke synaptic eiwitten kunnen ernstige synaptische transmissie beïnvloeden. Naast het ophelderen van de functie van een eiwit, is het belangrijk om ook de verdeling ervan. Hier beschrijven we een protocol met immunofluorescentie, confocal microscopie en computer-gebaseerde analyse om te bepalen van de verdeling van de synaptische proteïne verhuizer (ook wel TPRGL of SVAP30 genoemd). We vergelijken de verdeling van de Mover met die van de synaptische vesikel eiwit synaptophysin, waardoor het bepalen van de verdeling van de Mover op een kwantitatieve manier ten opzichte van de overvloed van synaptische vesikels. Deze methode kan met name mogelijk worden uitgevoerd als u wilt toestaan voor de vergelijking van de verdeling van eiwitten met verschillende antilichamen of microscopen of over verschillende studies. Onze methode omzeilt de inherente variabiliteit van immunefluorescentie technieken door de opbrengst van een verhouding in plaats van absolute fluorescentie niveaus. De methode die we beschrijven, kunnen bovendien de onderzoeker voor het analyseren van de verdeling van een eiwit op verschillende niveaus: van hele hersenen segmenten hersengebieden aan verschillende deelgebieden in één hersenen gebied, zoals de verschillende lagen van de hippocampus of sensorische cortices. Verhuizer is een gewerveld dier-specifieke eiwit dat is gekoppeld aan de synaptische vesikels. Met deze methode, laten we zien dat de Mover is ongelijkmatig verdeeld over de hersengebieden, met hoge niveaus in het ventrale pallidum, de septal kernen en de amygdala en ook binnen één hersengebieden, zoals de verschillende lagen van de hippocampus.

Introduction

Communicatie tussen de neuronen gebeurt op gespecialiseerde contact sites synapsen genaamd. Synapsen bevatten een groot aantal verschillende eiwitten die orkestreren van synaptische transmissie. Sommige van deze eiwitten Toon een heterogene distributie in het zenuwstelsel en zijn niet aanwezig in elke synapse¹. Een voorbeeld van een dergelijke eiwitten is Munc13, die bij het proces van de priming van synaptische vesikels betrokken is. Er zijn verschillende isoforms van Munc13, die zijn ongelijkmatig verdeeld in de hersenen², en de aanwezigheid of de afwezigheid van specifieke isoforms kunt beïnvloeden op korte termijn sy....

Protocol

Dit protocol geen experimenten op levende dieren. Experimenten met euthanizing van dieren naar het verkrijgen van de hersenen monsters werden goedgekeurd door de bescherming van de dieren van de lokale autoriteiten (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) onder het goedkeuringsnummer T 10/30.

Opmerking: Voor dit protocol, 3 volwassen mannelijke C57BL/6 muizen werden gebruikt.

1. de monstervoorbereiding

1. Bereiden fixeer en 0,1 M fosfaatbuffer (PB; Zie tabel 1).
2. Monteren van het dier door transcardial perfusie, zoals beschreven in Gage et al.

Results

Vertegenwoordiger kleuring patronen van verschillende markers te zien in Figuur 1. Het patroon is afhankelijk van de verdeling van het eiwit. Voorbeelden van vijf rostro-caudal niveaus worden weergegeven in kolommen (A)-(E). Een representatieve DAPI kleuring wordt weergegeven in de eerste rij: DAPI houdt vast aan het DNA van een cel en dus kernen zijn gekleurd. Dit resulteert in een punctate patroon. Regio's met een hoge celd.......

Discussion

De methode hier beoogt het kwantificeren van de distributie van een proteïne van belang ten opzichte van de overvloed van een marker eiwit met een bekende verdeling gepresenteerd. Immunofluorescentie kleuring prima overweg met een hoge variabiliteit van kleuring intensiteiten tussen verschillende segmenten. De hier beschreven aanpak van de kwantificering omzeilt dit probleem door het bepalen van de verhouding van de proteïne van belang zijn voor het gemiddelde over het halfrond. Daarom verschillende kleuring intensiteite.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL reaction tubes	Eppendorf	30120094
50 mL reaction tubes	Greiner Bio-One	227261
multiwell 24 well	Fisher Scientific	087721H
plastic pipette (disposable)	Sarstedt	861,176
1000 mL pipette	Rainin	17014382
2 ml pipette	Eppendorf	3123000012
Vortex Genius 3	IKA	3340001
Menzel microscope slides	Fisher Scientific	10144633CF
Stereoscope	Leica
LSM800	Zeiss		Confocal microscope
freezing microtome	Leica
PBS (10X)	Roche	11666789001
PFA	Sigma	P6148-1kg
NaCl	BioFroxx	1394KG001
sucrose	neoFroxx	1104KG001
Tissue Tek	Sakura	4583	OCT
Na2HPO4	BioFroxx	5155KG001
NaH2PO4	Merck	1,063,460,500
normal goat serum	Merck Millipore	S26-100ML
normal donkey serum	Merck	S30-100ML
Triton X-100	Merck	1,086,031,000
rabbit anti-Mover	Synaptic Systems	RRID: AB_10804285
guinea pig anti-Synaptophysin	Synaptic Systems	RRID: AB_1210382
donkey anti-rabbit AF647	Jackson ImmunoResearch	RRID: AB_2492288
goat anti-mouse AF488	Jackson ImmunoResearch	RRID: AB_2337438
Mowiol4-88	Calbiochem	475904
ZEN2 blue software	Zeiss		Microscopy software
FIJI	ImageJ		Analysis software
Microsoft Excel	Microsoft