Identificeren van celoppervlak markeringen van primaire neurale stam en voorlopercellen door metabole labeling van Sialoglycan

Samenvatting

Gepresenteerd hier is een protocol dat combineert een in vitro neurale-endotheliale co-cultuur systeem en metabole opname van sialoglycan met bioorthogonal functionele groepen uit te breiden primaire zenuw stam en voorlopercellen en label hun oppervlak sialoglycoproteïnen voorbeeld vorming of massaspectrometrie analyse van celoppervlak markeringen.

Samenvatting

Neurale stam-en voorlopercellen (Nspc's) zijn de cellulaire basis voor de complexe structuren en functies van de hersenen. Ze bevinden zich in gespecialiseerde niches in vivo en kunnen worden geïsoleerd en uitgebreid in vitro, dienen als een belangrijke bron voor celtransplantatie om hersenbeschadiging te herstellen. Nspc's zijn echter heterogene en niet duidelijk gedefinieerd op moleculair niveau of gezuiverd als gevolg van een gebrek aan specifieke celoppervlak markeringen. Het gepresenteerde protocol, dat eerder is gerapporteerd, combineert een neurale-endothelial co-cultuur systeem met een metabole ontwikkelen-etiketterings methode om het oppervlak sialoglycoproteome van primaire nspc's te identificeren. Het NSPC-endotheliale co-cultuur systeem maakt zelf vernieuwing en uitbreiding van primaire Nspc's in vitromogelijk, waardoor een voldoende aantal nspc's worden gegenereerd. Sialoglycans in gekweekte nspc's zijn gelabeld met behulp van een onnatuurlijke sialic acid metabole reporter met bioorthogonale functionele groepen. Door het sialoglycoproteome te vergelijken met zelfverlengde Nspc's die in een endotheliale co-cultuur met differentiërende neurale cultuur zijn uitgebreid, identificeren we een lijst van membraan eiwitten die verrijkt zijn met Nspc's. In detail omvat het Protocol: 1) het opzetten van een NSPC-endotheliale co-cultuur en NSPC-differentiërende cultuur; 2) etikettering met azidosugar per-O-geacetoneerde N-azidoacetylmannosamine (AC₄Mannaz); en 3) Biotine conjugatie aan gemodificeerde sialoglycan voorbeeld vorming na fixatie van neurale cultuur of EiwitExtractie uit neurale cultuur voor massaspectrometrie analyse. Vervolgens worden de NSPC-verrijkte oppervlak marker kandidaten geselecteerd door vergelijkende analyse van massaspectrometrie gegevens uit zowel de uitgebreide NSPC en gedifferentieerde neurale culturen. Dit protocol is zeer gevoelig voor het identificeren van membraan eiwitten van geringe overvloed in de uitgangsmaterialen, en het kan worden toegepast op marker ontdekking in andere systemen met passende modificaties

Inleiding

Neurale stamcellen worden gedefinieerd als een multipotente celpopulatie die zichzelf kan verlengen om een stamcel zwembad te behouden en zich te differentiëren in neuronen en gliacellen. Ze zijn de belangrijkste celtypen in het zenuwstelsel en kunnen een groot therapeutisch potentieel bieden in regeneratieve geneeskunde door middel van celtransplantatie in zieke en gewonde hersenen^1,2. Naarmate de ontwikkeling vordert, wordt de neurale stamcel populatie heterogene^3,4, en het aandeel van neurale stamcellen in de hersenen neemt geleidelijk af⁵. Over het algemeen bevinden embryonale stamcellen en andere neurale voorlopercellen, gezamenlijk neurale stam-en voorlopercellen (Nspc's), zich in de Germinal zones, de ventriculaire zone en de subventriculaire zone bij muizen⁶. In het embryonale brein genereren neurale stamcellen direct of indirect neuronen via tussenliggende voorlopercellen (ipc's), en in sommige soorten door de buitenste subventriculaire zone-voor ouders (orgs)^7,8. De specifieke moleculaire handtekening, morfologie, locatie in de stamcel niche en differentiatie potentieel bepalen allemaal de rol van elk subtype in hersen organogenese en klinische toepassingen⁹. De momenteel beschikbare celoppervlak markeringen kunnen echter niet ondubbelzinnig verschillende subtypen van Nspc's discrimineren en zuiveren, waardoor het begrip en het gebruik van deze subtypen worden beperkt.

De identificatie van primaire NSPCs-oppervlak markeringen wordt beperkt door drie grote hindernissen. De eerste is het beperkte celnummer van Nspc's in het weefsel, waardoor het moeilijk is om celoppervlakte proteïne monsters voor te bereiden voor gemeenschappelijke massaspectrometrie analyse. De tweede beperking is de moeilijkheid bij het produceren van zuivere celsubtypen voor het genereren van subtype-specifieke membraan proteïne gegevens. Ten slotte is de derde uitdaging de lage ratio van celoppervlakte eiwitten in hele celeiwitten, wat hun detectie gevoeligheden belemmert door massaspectrometrie analyse.

Om deze problemen te overwinnen, ontwikkelden we een chemoproteomische benadering om celoppervlakte eiwitten in primaire Nspc's selectief te verrijken en te identificeren door de sialoglycoproteïnen¹⁰metabolisch te labelen. Om een voldoende aantal Nspc's te genereren, maakten we gebruik van een vastgesteld protocol om de primaire embryonale Nabc's in ongedifferentieerde toestanden uit te breiden en te handhaven in vitro, door het coculeren van Nspc's met muizen hersen endotheliale cellijnen met behulp van een permeabele ondersteuning matrix insert (bijv. trans well) systeem¹¹. In tegenstelling, npscs gekweekt alleen zonder endotheel cellen genereren gedifferentieerde nageslacht^11,12. Zo kunnen eiwit monsters van deze twee kweeksystemen relatief worden geanalyseerd om eiwitten te identificeren die differentieel uitgedrukt zijn in Nspc's en gedifferentieerde neuronen. Aangezien de meeste celoppervlakte eiwitten worden gemodificeerd door sialic acid¹³, onnatuurlijke sialic acid precursor analoge N-azidoacetylmannosamine-tetraacylated (AC₄Mannaz) werd gebruikt om de intrinsieke metabole route te kapen, zodat endogene, nieuw gesynthetiseerde sialoglycans zijn gelabeld met meer groepen, het genereren van een chemische handvat¹⁴. Via azido-alkyne-gemedieerde bioorthogonale reacties, die biotine aan sialoglycans Conjugeren, kunnen celoppervlakte eiwitten worden gevisualiseerd en verrijkt voor proteomische identificatie door middel van een streptavidine-gekoppelde de of matrix¹⁴.

Hier voeren we kleuring van SDS-PAGE gel analyse van het oppervlak sialoglycoproteome uit Nspc's uitgebreid in een endotheliale co-cultuur en differentiërende cellen in een niet-co-cultuur systeem. We zuiveren ook selectief oppervlak sialoglycoproteome in de twee kweeksystemen voor proteomische vergelijking. Ons protocol, in vergelijking met de traditionele centrifugatie-based cel oppervlakte zuivering protocollen¹⁵, verhoogt de extractie werkzaamheid door het verminderen van de oppervlakte-EiwitExtractie procedures door middel van specifieke tag conjugatie en affiniteit Zuivering. Ondertussen, het verhoogt de extractie zuiverheid van celoppervlakte eiwitten op basis van de veronderstelling dat verminderde gebeurt meestal op het celoppervlak eiwitten. Hoewel endotheliale factoren de differentiatie van uitgebreide Nspc's niet volledig kunnen blokkeren, biedt de vergelijkende studie tussen een co-cultuur en gedifferentieerde cultuur een handige methode om stamcel verrijkte oppervlakte eiwitten te lokaliseren zonder de noodzaak om Analyseer eiwitten uit Npc's gezuiverd door FACS¹⁶. Wij zijn van mening dat deze aanpak kan worden toegepast op onderzoek van oppervlakte eiwitten in andere systemen met de juiste aanpassingen.

Protocol

Alle in deze studie gebruikte dier protocollen zijn goedgekeurd door het IACUC (institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité) van de Tsinghua-Universiteit en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het IACUC. De laboratorium dierenfaciliteit van Tsinghua University is geaccrediteerd door de AAALAC (vereniging voor beoordeling en accreditatie van Laboratory Animal Care International). Voor het klaarzetten van embryo's werd halverwege de dag van de geïdentificeerde vaginale plug berekend als embryonale dag 0,5 (E 0.5).

Opmerking: Alle cellen worden gekweekt in de celincubator onder voorwaarden van 37 °C en 5% CO₂.

1. bereiding van de muis endotheliale cultuur in permeabele ondersteuning inserts

Opmerking: BEND3 cellen worden bijgehouden volgens de instructies van de fabrikant.

1. Bereid BEND3 cel medium (BM) voor door toevoeging van 50 mL FBS en 5 mL penicilinestreptomycine in 500 mL DMEM en meng goed.
2. Aspireren het medium uit de schaal en was de BEND3 Cells-cultuur met 1 mL PBS eenmaal. Voeg 1 mL 0,25% trypsine-EDTA toe aan de cellen en inincuberen de cellen gedurende 4 minuten bij 37 °C.
3. Voeg 1 mL BM toe aan de cellen om trypsine-EDTA te neutraliseren en zachtjes op en neer te pipetteren om de cellen volledig te ontkoppelen. Breng de celsuspensie in een nieuwe conische buis en pellet van 15 mL door centrifugeren bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 min bij 400 x g.
4. Aspireren de supernatant uit de buis en rediëren van de cellen met 9 mL verse BM, voeg vervolgens 1 mL celsuspensie in één permeabele steun invoegen. Voeg nog eens 2 mL verse BM per put toe aan de onderste kamer van de matrix. Blijf de cellen voor één dag cultuur.

2. bereiding van de primaire corticale NSPCs-cultuur van de muis

1. Bereiding van cultuur plaat, papaïne vergistings medium en corticale hecht kweekmedium (AM)
   1. Jas 6-well platen met poly-L-lysine (PLL) door toevoeging van 1 mL PLL oplossing per put in 6-well platen. Inbroed de platen vervolgens gedurende 30 minuten bij RT.
   2. Breng de PLL-oplossing over in een conische buis van 15 mL. Was de platen 3 keer met dubbel gedestilleerd water. Lucht drogen de platen en leg ze opzij tot gebruik.
   3. Bereid het gistings medium van papaïne voor door toevoeging van 50 U papaïne, 50 μL L-glutamine en 50 μL van 100 mg/mL acetyl-L-cysteïne in 5 mL DMEM. Meng het medium kort en verwarm het tot 37 °C gedurende 30 minuten voor enzymactivering.
   4. Bereid de corticale cel aanhandig kweekmedium (AM): Voeg 500 μL L-glutamine, 500 μL natrium pyruvate, 500 μL van 100 mg/mL N-acetyl-L-cysteïne, 500 μL N2, 1 mL B27 en 5 μL van 100 μg/mL bFGF in 50 mL van de DMEM. Meng het medium goed en verwarm het tot 37 °C voor gebruik.
2. Bereiding van primaire cerebrale corticale cellen en daaropvolgende plating
   1. Offer een E 10.5 getimede zwangere muis door cervicale dislocatie.
      Opmerking: Bij E 10.5 zijn de meeste cellen prolifererende Nspc's in de hersenschors, wat leidt tot grote klonen van nakomelingen in vitro.
   2. Steriliseren de buik met 75% ethanol. Gebruik een fijne schaar en een micro-geserrated tang om de buik te openen door de huid en de onderliggende spier aan de rechterkant van de middelste lijn te snijden. Verwijder de baarmoeder voorzichtig uit de buikholte met geserreerde Tang en snijd deze uit de buikholte met een fijne schaar.
   3. Was de baarmoeder met 40 mL voorgekoelde HBSS in 10 cm Petri schaaltje. Breng vervolgens de baarmoeder over in een nieuwe 10 cm Petri schaaltje en was het opnieuw met 40 mL voorgekoelde HBSS.
   4. Breng de baarmoeder over in een nieuwe 10 cm Petri schaal met 40 mL voorgekoelde HBSS. Verwijder de embryo's uit de baarmoeder en het vrucht vlies, snijd vervolgens de hoofden van de embryo's af van de boomstammen met juweliers microforceps.
   5. Was de koppen met 40 mL voorgekoelde HBSS en breng de koppen over naar een nieuwe 10 cm Petri schaal met 40 mL voorgekoelde HBSS. Gebruik juweliers microforceps om huid en kraakbeen die de hersenen bedekken weg te pellen, snijd vervolgens de cerebrale cortices af en Verzamel ze in een conische buis van 15 mL met voorgekoelde HBSS.
   6. Pellet de cortices door centrifugeren gedurende 3 min bij 4 °C en 300 x g. Aspireren de supernatant uit de buis, vervolgens toe te voegen geactiveerde papaïne digestie medium en 15 μL 4 mg/mL DNase I in de weefsel pellet.
   7. Rebreng de weefsel pellet kort door met zachte vortexing. Inincuberen van het weefsel bij 37 °C gedurende 30 minuten. Gedurende deze tijd, maak het weefsel met een korte grondig elke 10 min.
      Opmerking: Aan het einde van de spijsvertering, mogen er geen zichtbare weefsel stukken in de buis.
   8. Pellet de corticale cellen door centrifugeren gedurende 10 min bij 4 °C en 450 x g. Aspireren de supernatant uit de buis en was de celpellet met voorgekoelde DMEM. Herhaal deze stap één keer.
      Opmerking: Let er tijdens de spijsvertering en het wassen op dat u de weefsels en de celpellet niet ruwweg pipetteren om beschadiging van de cellen met een sterke Afschuifkracht te voorkomen.
   9. Zuig de supernatant uit de buis en voeg vervolgens 1,5 mL voorgekoelde HBSS toe aan de buis. Dissocieren de corticale celpellet in afzonderlijke cellen met zachte pipetteren. Tel het celnummer met een hemocytometer.
   10. Voeg 2 mL AM en 2 x 10⁴ corticale cellen per put toe aan 6-well platen. Incuberen de plaat bij 37 °C en 5% CO₂ voor 3 uur om de cellen aan de plaat te laten hechten.

3. set-up van neurale-endotheliale co-cultuur en AC₄Mannaz labeling systeem

1. Een dag na het bekleden BEND3 cellen in de inserts, zachtjes aspireren het medium in de onderste kamer eerst, dan de inserts. Was de enface van de inserts 3 keer met vooraf opgewarmd DMEM. Was het buitenoppervlak van de wisselplaten doorspoelen met voorverwarmde DMEM.
2. Voeg 1 mL voorverwarmde AM in één wisselplaat toe en breng de wisselplaten vervolgens over in de putjes met primaire corticale cellen. Incuberen de co-cultuur bij 37 °C en 5% CO₂ voor 12 uur.
3. Los AC₄Mannaz op in DMSO om een voorraad concentratie van 200 mm te bereiken. 12 h na het opzetten van de neurale-endotheliale co-cultuur, voeg 1 μL AC₄Mannaz-kolf per onderste kamer en 0,5 μL voorraad per wisselplaat toe aan de co-cultuur. Schud de platen onmiddellijk en zachtjes om het medium goed te mengen. Voor de controle cellen, voeg gelijk volume van DMSO.
4. Kweek de cellen nog eens 5 dagen bij 37 °C en 5% CO₂. Bereid de AM met 10x bFGF als refeeding medium (RM). Gedurende deze tijd voegt u 100 μL RM per INSERT en 200 μL RM per onderste kamer toe om de endotheliale en neurale cellen om de andere dag opnieuw te voeden. Tijdens het opnieuw voeden, niet AC₄Mannaz of DMSO in de cultuur te leveren.

4. immunofluorescentie kleuring van Sialoglycoproteïnen in uitgebreide primaire Nspc's en gedifferentieerde neuronen

1. Bereid BTTAA-CuSO₄ complex 1 30x kolf met 1,5 mm CuSO₄ en 9 mm bttaa in dubbel gedestilleerd water. Bereid vers Biotine-geconjugeerde buffer 1 met 50 μM Biotine-alkyne, 2,5 mM natrium ascorbaat en 1x BTTAA-CuSO₄ complex in PBS.
2. Verwijder de inserts van de co-cultuur platen. Aspireren het kweekmedium van de bodemputten en was de neurale cellen één keer met pre-warmed PBS.
3. Zuig de PBS uit de putjes. Voeg 1 mL voorgekoelde 4% Paraformaldehyde PBS oplossing per put in de cellen toe en fixeer de cellen bij RT gedurende 10 minuten. Was vervolgens 3 keer de cellen met voorgekoelde PBS.
4. Aspirate PBS uit de putjes en voeg 1 mL vers bereide Biotine-geconjugeerde buffer 1 per put in de cellen toe. Incuberen de cellen op RT gedurende 10 minuten.
5. Zuig de reactiebuffer van de putjes op. Was de cellen 3 keer met PBS. Bereid de kleurings buffer met 1% FBS en 1 μg/mL Alexa Fluor 647-streptavidin. Voeg 1 mL kleurings buffer per put in de cellen toe en inincuberen de cellen op RT gedurende 30 minuten.
6. Aspireren de kleurings buffer uit de putten en gewassen cellen 3 keer met voorgekoelde PBS. Bereid de blokkerende buffer met 5% BSA en 0,3% niet-ionische reinigingsmiddel-100 in PBS. Voeg 1 mL blokkerende buffer per put in de cellen toe en inincuberen op RT gedurende 10 minuten.
7. Bereid een primaire antilichaam oplossing door de anti-nestin-en anti-β-tubulineiii-antilichamen samen in de blokkerende buffer in verhoudingen van respectievelijk 1:20 en 1:1000 te verdunen. Verwijder de blokkerende buffer uit de putjes en voeg per put 1 mL primaire antilichaam oplossing toe aan de cellen. Incuberen de cellen bij 4 °C 's nachts.
8. Verwijder de primaire antilichaam oplossing uit de putjes. Was de cellen 3 keer met voorgekoelde PBS. Bereid een secundaire antilichaam oplossing voor door het verdunnen van Alexa Fluor 488 Goat anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 546 Goat anti-Mouse IgG2b en DAPI samen in blokkerende buffer bij een verdunning van 1:1000. Aspireren van de PBS uit de putten en voeg 1 mL secundaire antilichaam oplossing per put in cellen. Incuberen de cellen op RT gedurende 2 uur.
9. Aspireren de antilichaam oplossing uit de putjes en was de cellen 3 keer met voorgekoelde PBS. Daarna zijn de cellen klaar voor het vastleggen van foto's.

5. zuivering van Sialoglycoproteïnen van uitgebreide primaire Nspc's en gedifferentieerde neuronen

1. Bereid BTTAA-CuSO₄ complex 2 15x voorraad met 1,5 mm CuSO₄ en 3 mm bttaa in dubbel gedestilleerd water. Bereid de proteïne resuspensie buffer A met 4% SDS en 10 mM EDTA in dubbel gedestilleerd water; proteïne resuspensie buffer B met 150 mM NaCl, 50 mM Triethanolamine, en 1% polyoxyethyleenoleyl ether (bijv. Brij97) in dubbel gedestilleerd water met pH 7,4. Meng buffer A:buffer B = 1:8 (vol/vol) voor gebruik, om de volledige proteïne-resuspensie buffer voor te bereiden. Bereid de proteïne-wasbuffer 1 met 2% SDS in PBS; proteïne-wasbuffer 2 met 8 M ureum in 250 mM Ammoniumbicarbonaat (ABC); en proteïne washing buffer 3 met 2,5 M NaCl in PBS.
2. Verwijder de inserts van de co-cultuur platen. Aspireren het kweekmedium van de bodemputten en was de neurale cellen eenmaal met voorgekoelde PBS.
3. Zuig de PBS uit de putjes en voeg 200 μL vooraf gekoelde RIPA-Buffer per put in de platen toe. Inbroed de platen op ijs gedurende 5 min. Verzamel de eiwit lysis in 1,5 mL tubes. Pellet het celpuin door centrifugeren gedurende 10 min bij 4 °C en 12.000 x g.
4. Breng het supernatant over in nieuwe 1,5 mL tubes. Bepaal de eiwitconcentratie met de BCA-Kit volgens de instructies van de fabrikant. Stel de eiwitconcentratie in op 1 mg/mL.
5. Voeg 100 μM alkyne-biotine, 2,5 mM Natriumascorbaat en 1x BTTAA-CuSO₄ complex 2 tot 1 ml eiwit lysis toe en meng de oplossing goed. Incuberen de mix bij RT gedurende 1 uur.
6. Breng de reactie oplossing over in 20 mL voorgekoelde methanol in een conische buis van 50 mL. Meng goed en incuberen bij-30 °C 's nachts om de eiwitten neer te slaan.
7. Pellet het eiwit precipiteert door centrifugeren voor 15 min bij 4 °C en 4.500 x g. Was de proteïne pellet tweemaal met 20 mL voorgekoelde methanol. Aspireren de supernatant uit de buis. Hervat de proteïne pellet met 4 mL proteïne resuspensie buffer en breng de proteïne resuspensie over in een nieuwe 15 mL conische buis.
8. Neem 50 μL streptavidine kralen en was ze 3 keer met PBS. Voeg de gewassen kralen toe aan de proteïne resuspensie. Inincuberen de oplossing bij 4 °C gedurende 3 uur op een verticale Rotator bij een rotatiesnelheid van 20 rpm.
9. Was de kralen opeenvolgend met 6 soorten buffers: proteïne washing buffer 1, proteïne washing buffer 2, proteïne washing buffer 3, 0,5 M ABC, 0,25 M ABC en 0,05 M ABC.
10. Na het wassen, hervat de kralen met 20 μL PBS en breng de kralen over in een nieuwe 1,5 mL Tube. Voeg 20 μL van 2x eiwit laad buffer toe aan de kralen en behandel bij 95 °C gedurende 10 minuten. De eiwit monsters moeten dan worden onderworpen aan SDS-PAGE en gekleurd met Coomassie Brilliant Blue R-250 volgens de instructies van de fabrikant. Snijd de eiwitten in de gel zoals aangegeven door Coomassie Brilliant Blue R-250 voor massaspectrometrie analyse.

Resultaten

De hele procedure voor in-vitro expansie en metabole labeling van primaire embryonale Nspc's duurt 6 dagen (Figuur 1a). Kwaliteit van de BEND3 cellijn en vers geïsoleerde primaire Nspc's zijn essentieel voor een succesvol experiment. BEND3 cellen zijn de bron van oplosbare factoren die zelf vernieuwing en proliferatie van Nspc's stimuleren. Er moet voor worden gezorgd dat de BEND3 cellen vrij zijn van verontreiniging en actief worden gesplitst met minimale ce...

Discussie

Oppervlakte markeringen worden vaak gebruikt om specifieke celtypen in vitro en in vivo^17,18te labelen en te zuiveren. De ontdekking van oppervlakte markers levert een grote bijdrage aan regeneratieve geneeskunde en onderzoek door stamcel door moleculaire hulpmiddelen te bieden om een stamcel populatie selectief te verrijken van normale of pathologische weefsels en cultuur gerechten, met een gezuiverde cel bron voor klinisch gebruik of studie van biologische eige...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
BEND3	ATCC	CRL-229
DMEM	Gibco	11960044
L-glutamine	Gibco	25030081	1%
Sodium pyruvate	Sigma	P5280	1%
N2 supplement	Gibco	17502048	1 tot 100
N-acetyl-L-cysteine	Sigma	A7250	1 mM
Papain	Worthington	LS003726	10 U/mL
B27 supplement	Gibco	17504044	1 tot 50
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Basic Fibroblast growth factor	Gibco	PHG0261	10 ng/mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	1%
Fetal bovine serum	Gibco	10099141	10%
HBSS	Gibco	14175095
Tripsin-EDTA, 0.25%	Gibco	25200056
DPBS	Gibco	14190094
Transwell	Corning	3450
Paraformaldehyde	Sigma	158127	4%
Sucrose	Sangon	A100335
DAPI	Gibco	62248
RIPA buffer	Thermo Scientific	89900
SDS-PAGE loading buffer 2x	Solarbio	P1018
6-well plate	Corning	3335
Tris-Glycine protein gel	invitrogen	xp00100box
Mouse monoclonal anti-Nestin	Developmental Study Hybridoma Bank	Rat-401	1 tot 20
Mouse monoclonal anti-beta-tubulin III	Sigma	T8860	1 tot 1.000
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1	invitrogen	A-21121	1 tot 1.000
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG2b	invitrogen	A-21143	1 tot 1.000
Albumin Bovine V	Amresco	0332
Triton X-100	Amresco	0694
BCA assay kit	Thermo Scientific	23225
Dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
Brij97	Aladdin	B129088
CuSO4	Sigma	209198
Alkyne-biotin	Click Chemistry Tools	TA105
BTTAA	Click Chemistry Tools	1236
Ac4ManNAz	Click Chemistry Tools	1084	100 µM
9AzSia	gesynthetiseerd in lab
Sodium ascorbate	Sigma	A4034
Methanol	Sigma	34860
EDTA	Sangon	A100322
NaCl	Sangon	A100241
SDS	Sangon	A100227
Alexa Flour 647-conjugated streptavidin	invitrogen	S21374	1 tot 1.000
Triethanolamine	Sigma	V900257
Dynabeads M-280 Streptavidin	invitrogen	60210
Ammonium bicarbonate	Sigma	9830
Coomassie Brilliant Blue R-250	Thermo Scientific	20278
Isoflurane	RWD Life Science Co.	970-00026-00
DNase I	Sigma	DN25	12 µg/mL
Urea	Sigma	U5378