Identificeren van celoppervlak markeringen van primaire neurale stam en voorlopercellen door metabole labeling van Sialoglycan

Summary

Gepresenteerd hier is een protocol dat combineert een in vitro neurale-endotheliale co-cultuur systeem en metabole opname van sialoglycan met bioorthogonal functionele groepen uit te breiden primaire zenuw stam en voorlopercellen en label hun oppervlak sialoglycoproteïnen voorbeeld vorming of massaspectrometrie analyse van celoppervlak markeringen.

Abstract

Neurale stam-en voorlopercellen (Nspc's) zijn de cellulaire basis voor de complexe structuren en functies van de hersenen. Ze bevinden zich in gespecialiseerde niches in vivo en kunnen worden geïsoleerd en uitgebreid in vitro, dienen als een belangrijke bron voor celtransplantatie om hersenbeschadiging te herstellen. Nspc's zijn echter heterogene en niet duidelijk gedefinieerd op moleculair niveau of gezuiverd als gevolg van een gebrek aan specifieke celoppervlak markeringen. Het gepresenteerde protocol, dat eerder is gerapporteerd, combineert een neurale-endothelial co-cultuur systeem met een metabole ontwikkelen-etiketterings methode om het oppervlak sialoglycoproteome van primaire nspc's te identificeren. Het NSPC-endotheliale co-cultuur systeem maakt zelf vernieuwing en uitbreiding van primaire Nspc's in vitromogelijk, waardoor een voldoende aantal nspc's worden gegenereerd. Sialoglycans in gekweekte nspc's zijn gelabeld met behulp van een onnatuurlijke sialic acid metabole reporter met bioorthogonale functionele groepen. Door het sialoglycoproteome te vergelijken met zelfverlengde Nspc's die in een endotheliale co-cultuur met differentiërende neurale cultuur zijn uitgebreid, identificeren we een lijst van membraan eiwitten die verrijkt zijn met Nspc's. In detail omvat het Protocol: 1) het opzetten van een NSPC-endotheliale co-cultuur en NSPC-differentiërende cultuur; 2) etikettering met azidosugar per-O-geacetoneerde N-azidoacetylmannosamine (AC₄Mannaz); en 3) Biotine conjugatie aan gemodificeerde sialoglycan voorbeeld vorming na fixatie van neurale cultuur of EiwitExtractie uit neurale cultuur voor massaspectrometrie analyse. Vervolgens worden de NSPC-verrijkte oppervlak marker kandidaten geselecteerd door vergelijkende analyse van massaspectrometrie gegevens uit zowel de uitgebreide NSPC en gedifferentieerde neurale culturen. Dit protocol is zeer gevoelig voor het identificeren van membraan eiwitten van geringe overvloed in de uitgangsmaterialen, en het kan worden toegepast op marker ontdekking in andere systemen met passende modificaties

Introduction

Neurale stamcellen worden gedefinieerd als een multipotente celpopulatie die zichzelf kan verlengen om een stamcel zwembad te behouden en zich te differentiëren in neuronen en gliacellen. Ze zijn de belangrijkste celtypen in het zenuwstelsel en kunnen een groot therapeutisch potentieel bieden in regeneratieve geneeskunde door middel van celtransplantatie in zieke en gewonde hersenen^1,2. Naarmate de ontwikkeling vordert, wordt de neurale stamcel populatie heterogene^3,4, en het aandeel van neurale stamcellen in de hersenen neemt geleidelijk af

Protocol

Alle in deze studie gebruikte dier protocollen zijn goedgekeurd door het IACUC (institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité) van de Tsinghua-Universiteit en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het IACUC. De laboratorium dierenfaciliteit van Tsinghua University is geaccrediteerd door de AAALAC (vereniging voor beoordeling en accreditatie van Laboratory Animal Care International). Voor het klaarzetten van embryo's werd halverwege de dag van de geïdentificeerde vaginale plug berekend als embryonale dag 0,5 (E 0.5).

Opmerking: Alle cellen worden gekweekt in de celincubator onder voorwaarden van 37 °C en 5% CO<....

Results

De hele procedure voor in-vitro expansie en metabole labeling van primaire embryonale Nspc's duurt 6 dagen (Figuur 1a). Kwaliteit van de BEND3 cellijn en vers geïsoleerde primaire Nspc's zijn essentieel voor een succesvol experiment. BEND3 cellen zijn de bron van oplosbare factoren die zelf vernieuwing en proliferatie van Nspc's stimuleren. Er moet voor worden gezorgd dat de BEND3 cellen vrij zijn van verontreiniging en actief worden gesplitst met minimale ce.......

Discussion

Oppervlakte markeringen worden vaak gebruikt om specifieke celtypen in vitro en in vivo^17,18te labelen en te zuiveren. De ontdekking van oppervlakte markers levert een grote bijdrage aan regeneratieve geneeskunde en onderzoek door stamcel door moleculaire hulpmiddelen te bieden om een stamcel populatie selectief te verrijken van normale of pathologische weefsels en cultuur gerechten, met een gezuiverde cel bron voor klinisch gebruik of studie van biologische eige.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BEND3	ATCC	CRL-229
DMEM	Gibco	11960044
L-glutamine	Gibco	25030081	1%
Sodium pyruvate	Sigma	P5280	1%
N2 supplement	Gibco	17502048	1 to 100
N-acetyl-L-cysteine	Sigma	A7250	1 mM
Papain	Worthington	LS003726	10 U/mL
B27 supplement	Gibco	17504044	1 to 50
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Basic Fibroblast growth factor	Gibco	PHG0261	10 ng/mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	1%
Fetal bovine serum	Gibco	10099141	10%
HBSS	Gibco	14175095
Tripsin-EDTA, 0.25%	Gibco	25200056
DPBS	Gibco	14190094
Transwell	Corning	3450
Paraformaldehyde	Sigma	158127	4%
Sucrose	Sangon	A100335
DAPI	Gibco	62248
RIPA buffer	Thermo Scientific	89900
SDS-PAGE loading buffer 2x	Solarbio	P1018
6-well plate	Corning	3335
Tris-Glycine protein gel	invitrogen	xp00100box
Mouse monoclonal anti-Nestin	Developmental Study Hybridoma Bank	Rat-401	1 to 20
Mouse monoclonal anti-beta-tubulin III	Sigma	T8860	1 to 1,000
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1	invitrogen	A-21121	1 to 1,000
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG2b	invitrogen	A-21143	1 to 1,000
Albumin Bovine V	Amresco	0332
Triton X-100	Amresco	0694
BCA assay kit	Thermo Scientific	23225
Dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
Brij97	Aladdin	B129088
CuSO4	Sigma	209198
Alkyne-biotin	Click Chemistry Tools	TA105
BTTAA	Click Chemistry Tools	1236
Ac4ManNAz	Click Chemistry Tools	1084	100 µM
9AzSia	synthesized in lab
Sodium ascorbate	Sigma	A4034
Methanol	Sigma	34860
EDTA	Sangon	A100322
NaCl	Sangon	A100241
SDS	Sangon	A100227
Alexa Flour 647-conjugated streptavidin	invitrogen	S21374	1 to 1,000
Triethanolamine	Sigma	V900257
Dynabeads M-280 Streptavidin	invitrogen	60210
Ammonium bicarbonate	Sigma	9830
Coomassie Brilliant Blue R-250	Thermo Scientific	20278
Isoflurane	RWD Life Science Co.	970-00026-00
DNase I	Sigma	DN25	12 µg/mL
Urea	Sigma	U5378