Methodenartikel

Een inductie systeem voor geclusterde stoma door suiker oplossing onderdompeling behandeling in Arabidopsis thaliana zaailingen

DOI:

10.3791/58951

⸱

15 februari 2019

 , 
1Department of Integrated Frontier Sciences, The University of Tokyo, 2International Research Organization for Advanced Science and Technology, Kumamoto University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van dit protocol is om aan te tonen hoe voor het opwekken van geclusterde stoma in zaadlobben van Arabidopsis thaliana zaailingen door onderdompeling behandeling met een suiker-bevattende middellange oplossing en hoe waarnemen van intracellulaire structuren zoals chloroplasten en microtubuli in de geclusterde guard cellen met behulp van confocale laser microscopie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stomatal verkeer bemiddelt de gasuitwisseling plant, die essentieel is voor de fotosynthese en transpiratie. Stomatal te openen en te sluiten zijn bereikt door een aanzienlijke toename en afname guard cel volume, respectievelijk. Omdat shuttle vervoer van ionen en water tussen guard cellen en grotere naburige epidermale cellen tijdens stomatal beweging plaatsvindt, hebben de verdeelde verdeling van plant stoma wordt beschouwd als een optimale verdeling voor stomatal verkeer. Experimentele systemen voor storing veroorzaakt het verdeelde patroon van stoma zijn handig voor het onderzoeken van de spatiëring patroon van betekenis. Verschillende belangrijke genen die samenhangt met de verdeelde stomatal verdeling zijn geïdentificeerd en geclusterde stoma experimenteel kunnen worden opgewekt door een wijziging van deze genen. Als alternatief, geclusterde stoma kunnen ook worden veroorzaakt door exogene behandelingen zonder genetische modificatie. In dit artikel beschrijven we een eenvoudige induktie systeem voor geclusterde stoma in Arabidopsis thaliana zaailingen door onderdompeling worden behandeld als een sacharose-bevattende middellange oplossing. Onze methode is makkelijk en is rechtstreeks toepasselijk in transgene of mutant lijnen. Grotere chloroplasten worden gepresenteerd als een cel biologische keurmerk van sacharose-geïnduceerde geclusterde guard cellen. Bovendien, wordt een vertegenwoordiger van de confocal microscopische opname van corticale microtubuli weergegeven als een voorbeeld van intracellulaire observatie van geclusterde guard cellen. De radiale richting van corticale microtubuli is in geclusterde guard cellen zoals in verdeelde guard cellen in controlevoorwaarden gehandhaafd.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De plant stoma is een essentieel orgaan voor gasuitwisseling voor fotosynthese en transpiratie en stomatal verkeer wordt bereikt door ingrijpende veranderingen in de guard cellen tot ion-gedreven opname- en release van water. Onder een Microscoop, kunnen we zien een patroon van de verdeelde distributie van stoma op de oppervlakken van bladeren en stengels. Deze verdeelde verdeling van stoma wordt beschouwd als om te helpen stomatal beweging, die wordt geregeld door ion en water uitwisseling tussen guard cellen en naburige epidermale cellen1,2. Experimentele inductie systemen voor geclusterde stoma zijn nuttig voor het onderzoek naar het belang van de verdeelde verdeling van stoma.

Er werd gemeld dat de ruimtelijke clustering van stoma kan worden opgewekt door genetische modificatie van essentiële genen voor guard cel differentiatie3,4 of behandeling met een chemisch samengestelde5. We ook gemeld dat onderdompeling behandeling met een middellange oplossing aangevuld met inbegrip van sacharose, glucose, suikers en fructose veroorzaakt stomatal clusters in de zaadlobben van Arabidopsis thaliana zaailingen6. Verminderde callose in nieuwe celwanden scheiden meristemoids en epidermale cellen in de epidermis van sacharose-behandelde zaadlob, suggereren dat sacharose oplossing onderdompeling behandeling negatief beïnvloedt de celwand, waardoor de lekkage werd waargenomen en ectopische actie van belangrijke genproducten voor guard celdifferentiatie (bijvoorbeeld transcriptiefactoren) naar aangrenzende epidermale cellen6. Een soortgelijk mechanisme werd voorgesteld van studies over gsl8/chor mutanten7,8. Onze experimenteel systeem voor reproduceerbare inductie van geclusterde stoma met behulp van sacharose-bevattende middellange oplossing is vrij eenvoudig en goedkoop. Het kan ook worden gebruikt om te onderzoeken van intracellulaire structuren zoals organellen en het cytoskelet in de geclusterde guard cellen wanneer toegepast op transgene lijnen uiten fluorescente markeringen dat etiket intracellulaire structuren9, 10.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. voorbereiding van 3% Sucrose-bevattende 1/2 Murashige-Skoog middellange-oplossing

  1. 1.1 g Murashige-Skoog middellange zouten en 15 g van sacharose toevoegen aan een bekerglas.
  2. Voeg 490 mL gedestilleerd water toe en meng goed met een roer-bar.
  3. Breng de pH op 5.8 met behulp van KOH.
  4. Verdun met gedestilleerd water tot 500 mL en breng de oplossing kwantitatief over in een middelgrote fles.
  5. De oplossing steriliseren in autoclaaf (121 ° C, 20 min). Indien niet onmiddellijk wordt gebruikt, kan deze oplossing na sterilisatie bij 4 ° C worden bewaard.

2. de inductie van geclusterde stoma door Sucrose-bevattende middellange oplossing onderdompeling behandeling

  1. Het steriliseren van de zaden.
    1. Bereid de sterilisatie-oplossing door het toevoegen van 500 µL van 5% actief chloor NaClO oplossing en 1 µL van 10% Triton X-100 tot 500 µL steriel water.
    2. Plaats ca. 50 transgene A. thaliana zaden uitvoering een fluorescerende marker zoals CT-GFP11 of GFP-TUB612 in een 1.5-mL-buis.
    3. Voeg 1 mL oplossing van 70% ethanol en meng goed door vijf keer omkeren. Verlof voor 1 min.
    4. De zaden zullen zinken naar de bodem van de buis. Op een schone bankje, zachtjes verwijderen van de 70%-ethanol met behulp van een micropipet, en voeg 1 mL van sterilisatie oplossing. Meng goed door het omkeren van de vijf keer en laat gedurende 5 min.
    5. Wassen van de zaden. Nog steeds werken onder aseptische condities op een schone bankje, zachtjes verwijderen de oplossing om met een micropipet en voeg 1 mL steriel water. Herhaal deze stap vijf keer.
  2. Voeg 1,5 mL van gesteriliseerde 3% sucrose-bevattende 1/2 Murashige-Skoog middellange-oplossing aan elk putje van de plaat van een 24-well op een schone bankje.
  3. Voeg twee gesteriliseerde zaden in elk putje. Tape de deksel op het bord van de 24-well met behulp van twee lagen van parafilm.
  4. De 24-well plaat overbrengen in een groei kamer set bij 23.5 ° C met een 12-h/12-h licht-donker cyclus met gebruikmaking van 100 µmol m−2 s−1 wit licht en incubeer gedurende 14 dagen.

3. de microscopische observatie van geclusterde stoma

  1. Plaats 30 µL van 3% sucrose-bevattende 1/2 Murashige-Skoog middellange-oplossing van een putje van de plaat 24-well in het midden van een glasplaatje (grootte: 76 × 26 mm, dikte: 1.0-1.2 mm).
  2. Verwijder een zaadlob uit een zaailing van de 14-dagen oude met behulp van ontleden schaar. De zaadlob drijven met de waarneming zijde naar boven op de daling van de oplossing.
  3. Bereiden de zaadlob specimen volgens onze vorige methode13. In wezen, het plaatsen van 30 µL van de oplossing in het midden van een glas cover (grootte: 18 × 18 mm, dikte: 0.12-0.17 mm). De glazen deksel ondersteboven en plaats deze op de zaadlob zachtjes. Veeg overtollige buffer met behulp van een pluisvrije weefsel.
  4. Stel een specimen op het podium van een Microscoop confocale laser en selecteer van geclusterde guard cellen voor observatie met behulp van lichte veld verlichting.
  5. Confocale beelden van fluorescently geëtiketteerde intracellulaire structuren volgens de instructies van de fabrikant van de Microscoop te verwerven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier, heeft het protocol voor een eenvoudige methode van inducerende stomatal clustering met sacharose-bevattende middellange oplossing in A. thaliana zaailingen voorgelegd. De geclusterde guard cellen gekweekt in sacharose-bevattende middellange oplossing (Figuur 1B) hebben grotere chloroplasten dan guard cellen gekweekt in sacharose-vrije controlevoorwaarden(Figuur 1). De uitbreiding v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protocollen voor inductie van geclusterde stoma hebben in A. thaliana zaailingen wij gepresenteerd door onderdompeling worden behandeld als een sacharose-bevattende middellange oplossing. Zoals u hier ziet, deze methode is zeer eenvoudig en vereist geen speciale vaardigheid maar efficiënt geclusterde stoma kan veroorzaken. Meer dan 45 gewichtspercenten guard cellen zijn geclusterd met 3% sucrose-bevattende middellange oplossing (gemiddelde waarden van meer dan 20 onafhankelijke waarnemingen)6

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij zijn dankbaar aan Prof. Seiichiro Hasezawa voor zijn vriendelijke ondersteuning van ons werk. Dit werk werd gesteund door subsidies van de Society van Japan voor de promotie van wetenschap (JSPS) KAKENHgrant nummers 17K 19380 en 18 H 05492, van The Sumitomo Foundation een subsidie ontvangen voor elementaire wetenschap onderzoeksprojecten nummer 160146, en de Canon Stichting T.H. toekennen Dit experimenteel systeem werd ontwikkeld onder een financiële steun van de JSPS KAKENHgrant nummer 26891006 naar K. A. Wij danken Robbie Lewis, MSc, uit Edanz groep (www.edanzediting.com/ac) voor het bewerken van een ontwerp voor van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
24-well plateSumitomo BakeliteMS-0824R
488 nm laserFurukawa DenkoHPU-50101-PFS2
488 nm laserOlympusSapphire488-20/O
510 nm long-pass filterOlympusBA510IF
524 - 546 nm band-pass filterSemrockFF01-535/22-25
530 nm short-pass filterOlympusBA530RIF
561 nm laserCVI Melles Griot85-YCA-025-040
604 - 644 nm band-pass filterSemrockFF01-624/40-25
Confocal laser scanning headYokogawaCSU10
Confocal laser scanning headOlympusFV300
Cooled CCD cameraPhotometricsCoolSNAP HQ2
Image acquisition softwareMolecular DevicesMetaMorph version 7.8.2.0
Image acquisition softwareOlympusFLUOVIEW v5.0
Immersion oilOlympusImmersion Oil Type-Fne = 1.518 (23 graden)
Inverted microscopeOlympusIX-70
Inverted microscopeOlympusIX-71
Murashige and Skoog Plant Salt MixtureFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation392-00591Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497.
Objective lens OlympusUPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35NA = 1.35
Objective lens OlympusUPlanAPO 40x / 0.85 NANA = 0.85
SucroseFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation196-00015

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Raschke, K., Fellows, M. P. Stomatal movement in Zea mays: shuttle of potassium and chloride between guard cells and subsidiary cells. Planta. 101 (4), 296-316 (1971).
  2. Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant and Cell Physiology. 55 (4), 773-780 (2013).
  3. Bergmann, D. C., Sack, F. D. Stomatal development. Annual Review of Plant Biology. 58, 163-181 (2007).
  4. Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Mechanisms of stomatal development. Annual Review of Plant Biology. 63, 591-614 (2012).
  5. Sakai, Y., et al. The chemical compound bubblin induces stomatal mispatterning in Arabidopsis by disrupting the intrinsic polarity of stomatal lineage cells. Development. 144 (3), 499-506 (2017).
  6. Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Breaking of plant stomatal one-cell-spacing rule by sugar solution immersion. PLOS One. 8 (9), 72456(2013).
  7. Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiology. 150 (1), 105-113 (2009).
  8. Guseman, J. M., et al. Dysregulation of cell-to-cell connectivity and stomatal patterning by loss-of-function mutation in Arabidopsis chorus (glucan synthase-like 8). Development. 137 (10), 1731-1741 (2010).
  9. Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Cortical microtubules and fusicoccin response in clustered stomatal guard cells induced by sucrose solution immersion. Plant Signaling and Behavior. 13 (4), 1454815(2018).
  10. Akita, K., Hasezawa, S. Sugar solution induces clustered lips. Cytologia. 79 (2), 125-126 (2014).
  11. Holzinger, A., Buchner, O., Lütz, C., Hanson, M. R. Temperature-sensitive formation of chloroplast protrusions and stromules in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana. Protoplasma. 230 (1-2), 23-30 (2007).
  12. Abe, T., Hashimoto, T. Altered microtubule dynamics by expression of modified α-tubulin protein causes right-handed helical growth in transgenic Arabidopsis plants. The Plant Journal. 43 (2), 191-204 (2005).
  13. Higaki, T. Real-time imaging of plant cell surface dynamics with variable-angle epifluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (106), 53437(2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Sucrosebehandelingvolume van sluitcellenchloroplastvergrotingcorticale microtubuliconfocale microscopieMurashige Skoog mediumstomatale clusteringincubatie van zaailingen

Gerelateerde artikelen