Single-doorvoer complementaire High-resolution analytische technieken voor het karakteriseren van complexe natuurlijke organische stof mengsels

Summary

Dit protocol beschrijft een interne doorvoer voor aanvullende analytische en omics technieken, culminerend in een volledig gekoppeld karakterisering van natuurlijke organische stof en microbiële proteomics in verschillende ecosystemen. Deze aanpak maakt robuuste vergelijkingen voor het identificeren van de metabolische banen en het transformaties die belangrijk zijn voor het beschrijven van de gasproductie van broeikasgassen en het voorspellen van reacties op veranderingen in het milieu.

Abstract

Natuurlijke organische stof (NOM) bestaat uit een complex mengsel van duizenden van organische verbindingen, die in het verleden bleek moeilijk te karakteriseren. Echter, om te begrijpen de thermodynamische en kinetische besturingselementen op broeikasgassen (kooldioxide [CO₂] en [CH₄] methaan) gasproductie als gevolg van de ontbinding van NOM, een karakterisering van moleculaire-niveau gekoppeld aan microbiële Proteoom analyse is noodzakelijk. Verder, klimaat en veranderingen in het milieu naar verwachting erover natuurlijke ecosystemen, mogelijk verstoren complexe interacties die invloed hebben op zowel het aanbod van organisch materiaal substraten en de micro-organismen de transformaties uitvoeren. Een gedetailleerde moleculaire karakterisering van de organische stof, microbiële proteomics, trajecten en transformaties waarbij organische stof wordt ontleed zullen nodig zijn om te voorspellen van de richting en de omvang van de gevolgen van milieuveranderingen. Dit artikel beschrijft een methodologische doorvoer voor uitgebreide metaboliet karakterisering in één sample door directe inspuiting Fourier transform ion cyclotron resonantie massaspectrometrie (FTICR-MS), gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS), nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie, massaspectrometrie vloeistofchromatografie (LC-MS) en proteomics analyse. Deze aanpak resulteert in een volledig gekoppeld dataset die statistische vertrouwen voor afgeleid van de trajecten van de ontleding van organisch materiaal, wordt de resulterende CO₂ en CH₄ productie tarieven en hun reacties op milieu perturbation verbetert. Hierin presenteren wij de resultaten van de toepassing van deze methode om NOM monsters verzameld van veengebieden; het protocol is echter van toepassing op een monster van de NOM (b.v., turf, beboste bodems, mariene sedimenten, enz.).

Introduction

Wereldwijd, wetlands zijn naar schatting bevatten 529 Pg van koolstof (C), meestal als organische C begraven in turf deposito's¹. Op dit moment fungeren zo'n veengebieden als een netto C wastafel, vastleggen van 29 Tg C y^-1 in Noord-Amerika alleen al¹. Echter milieu verstoring zoals drainage, branden, droogte en warmere temperaturen deze C-wastafel kan compenseren door het verhogen van de ontleding van organisch materiaal wat resulteert in verhoogde C verliezen via van broeikasgassen (kooldioxide [CO₂] en methaan [CH₄]) productie^1,

Protocol

1. sequentiële winning van organisch materiaal uit de bodem, sedimenten of turf

1. Bodem, sedimenten of turf via ontkernen verzameld en verdeel kernen volgens de hypothese wordt getest (bijv., diepte). Winkel monsters in polytetrafluorethyleen gecoat containers en bevriezen bij-80 ° C voor de opslag vóór de analyse.
   Opmerking: Ongeveer 25 mg C is nodig voor dit protocol. Voor turf (gewoonlijk 45% C) is 50 mg gedroogde turf vereist. Grotere hoeveelheden van het monster kunnen nodig zijn voor lage biologische monsters zoals minerale of beboste hooglanden bodems afhankelijk van het C-gehalte (maximaal 5 g). Omdat de extractie met organische op....

Results

We het protocol beschreven aanvullende analyse uitgevoerd en ten opzichte van turf met diepte in het moeras van de S1 in de Spar en de veengebieden reactie onder veranderende omgevingen (spar) site in Minnesota, Verenigde Staten. Deze resultaten worden vergeleken met die van een permafrost Veen en moeras van Noord-Zweden om te laten zien hoe sites kunnen variëren in metaboliet en enzym activiteiten. We geïdentificeerd 3,312 enzymen in de analyse van proteomics. Een analyse van de activiteiten van de enzymen met diepte bl.......

Discussion

De single-doorvoer, volledig-coupled analyse stream gebruikt voor het karakteriseren van de metabolieten en de Proteoom biedt inzichten in de trajecten door welke C fietsen in een complex ecosysteem plaatsvindt. Bodem en turf zijn heterogene matrices, en daarom één van de essentiële stappen van deze methode in de vroegste stappen om ervoor te zorgen dat de startende turf of het materiaal van de bodem zeer homogene optreedt. Het is beter om het slijpen van het monster, evenals de aggregaten extractie-efficiëntie kunnen ve.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
methoxyamine hydrochloride	Sigma Aldrich	226904	derivitization agent
5 mm triple resonance salt-tolerant cold probe	Bruker		instrumentation
capillary GC column HP-5MS column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)	Agilent	AG19091S-433	instrumentation
reversed phase charged surface hybrid column (3.0 mm × 150 mm × 1.7 μm particle size)	ThermoFisher		instrumentation
2 mL glass vials	VWR International	46610-722	sample vials
autosampler vials	VWR International	97055-324; 9467671	sample vials
Chloroform	VWR International	JT9174-3	solvent
Ethanol	VWR International	BDH67002.400	solvent
methanol	VWR International	BDH85681.400	solvent
pyridine	VWR International	BDH67007.400	solvent
2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6	Sigma Aldrich	178837	standard
C8-C24 fatty acid methyl ester	Sigma Aldrich	CRM18918	standard
N-methyl-N- (trimethylsilyl)trifluoroacetamide	Sigma Aldrich	24589-78-4	standard
Suwanee River Fulvic Acid standard	International Humic Substances Society	2S101F	standard
trimethylchlorosilane	Sigma Aldrich	89595	standard
Tuning Solution	Agilent
FTICR-MS analysis software	Bruker	Compass DataAnalysis 4.1
Formularity Software	Pacific Northwest National Laboratory	Formularity	available for download at: https://omics.pnl.gov/software/formularity
GC-MS	Agilent	Agilent GC 7890A with MSD 5975C
silica-based sorbent	Phenomenex (Torrance, CA)	Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK)
NMR TUBE 3MM 8 150 CS5	VWR International	KT897820-0008	NMR tube
Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer	Varian Inova	Varian Direct Drive 600-MHz	NMR spectrometer
Chenomx NMR Suite 8.3	Chenomx	Chenomx NMR Suite	NMR software
ultra-performance liquid chromatograph	waters	Aquity UPLC H	liquid chromatograph
Velos-ETD Orbitrap mass spectrometer	ThermoFisher	Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos	mass spectrometer