Methodenartikel

Single-doorvoer complementaire High-resolution analytische technieken voor het karakteriseren van complexe natuurlijke organische stof mengsels

DOI:

10.3791/59035

⸱

7 januari 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, 2Department of Soil, Water and Environmental Science, University of Arizona, 3Department of Earth Ocean and Atmospheric Sciences, Florida State University, 4Bruker Daltonics Inc., 5Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een interne doorvoer voor aanvullende analytische en omics technieken, culminerend in een volledig gekoppeld karakterisering van natuurlijke organische stof en microbiële proteomics in verschillende ecosystemen. Deze aanpak maakt robuuste vergelijkingen voor het identificeren van de metabolische banen en het transformaties die belangrijk zijn voor het beschrijven van de gasproductie van broeikasgassen en het voorspellen van reacties op veranderingen in het milieu.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Natuurlijke organische stof (NOM) bestaat uit een complex mengsel van duizenden van organische verbindingen, die in het verleden bleek moeilijk te karakteriseren. Echter, om te begrijpen de thermodynamische en kinetische besturingselementen op broeikasgassen (kooldioxide [CO2] en [CH4] methaan) gasproductie als gevolg van de ontbinding van NOM, een karakterisering van moleculaire-niveau gekoppeld aan microbiële Proteoom analyse is noodzakelijk. Verder, klimaat en veranderingen in het milieu naar verwachting erover natuurlijke ecosystemen, mogelijk verstoren complexe interacties die invloed hebben op zowel het aanbod van organisch materiaal substraten en de micro-organismen de transformaties uitvoeren. Een gedetailleerde moleculaire karakterisering van de organische stof, microbiële proteomics, trajecten en transformaties waarbij organische stof wordt ontleed zullen nodig zijn om te voorspellen van de richting en de omvang van de gevolgen van milieuveranderingen. Dit artikel beschrijft een methodologische doorvoer voor uitgebreide metaboliet karakterisering in één sample door directe inspuiting Fourier transform ion cyclotron resonantie massaspectrometrie (FTICR-MS), gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS), nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie, massaspectrometrie vloeistofchromatografie (LC-MS) en proteomics analyse. Deze aanpak resulteert in een volledig gekoppeld dataset die statistische vertrouwen voor afgeleid van de trajecten van de ontleding van organisch materiaal, wordt de resulterende CO2 en CH4 productie tarieven en hun reacties op milieu perturbation verbetert. Hierin presenteren wij de resultaten van de toepassing van deze methode om NOM monsters verzameld van veengebieden; het protocol is echter van toepassing op een monster van de NOM (b.v., turf, beboste bodems, mariene sedimenten, enz.).

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wereldwijd, wetlands zijn naar schatting bevatten 529 Pg van koolstof (C), meestal als organische C begraven in turf deposito's1. Op dit moment fungeren zo'n veengebieden als een netto C wastafel, vastleggen van 29 Tg C y-1 in Noord-Amerika alleen al1. Echter milieu verstoring zoals drainage, branden, droogte en warmere temperaturen deze C-wastafel kan compenseren door het verhogen van de ontleding van organisch materiaal wat resulteert in verhoogde C verliezen via van broeikasgassen (kooldioxide [CO2] en methaan [CH4]) productie1,2. Klimaatverandering kan bijdragen aan C verlies als warmere temperaturen of droger voorwaarden sneller C ontleding door micro-organismen stimuleren. Hogere temperaturen en concentraties in de lucht CO2 kunnen anderzijds primaire productie te sekwestreren meer CO2 als organische koolstof (OC) stimuleren. In welke mate en hoe snel dat OC dan is ontleed in CO2 en CH4 hangt af van de complexe interacties tussen het elektron donor substraten, de beschikbaarheid van elektronen acceptoren en de micro-organismen die bemiddelen de transformatie. In veel gevallen de mechanismen zijn niet goed gekarakteriseerd, dus hun reactie op milieu verstoringen niet goed gebonden en het blijft onduidelijk wat het netto resultaat van de klimaatverandering zullen op de koolstofbalans in veengebieden ecosystemen.

Het complexe karakter van natuurlijke organische stof (NOM) heeft zelfs het identificeren van de organische stoffen aanwezig in de historisch moeilijke NOM-mengsels. Recente vooruitgang verbeterd ons vermogen om verbindingen dat traditioneel karakteriseren en, tot op zekere hoogte nog steeds worden, beschouwd als recalcitrante humus of fulvo verbindingen3,4,5sterk. We begrijpen nu dat veel van deze verbindingen eigenlijk microbially beschikbaar zijn en kunnen worden ontleed als een geschikte terminal elektron acceptor (thee) beschikbaar6,7wordt gemaakt. Berekening van het nominale oxidatiegetal van de koolstof (NOSC) voor een samengestelde biedt een metriek voor het voorspellen van het potentieel voor de ontleding en de energie-opbrengst van de thee vereist. Het vereist echter de karakterisering van een moleculair-niveau van de organische stof-7. NOSC is berekend op basis van de molecuulformule via de volgende vergelijking7: NOSC = − ((−z + 4(#C) + (#H) − 3(#N) − 2(#O) + 5(#P) − 2(#S)) / (#C)) + 4, waar z de netto lading is. NOSC is gecorreleerd met de thermodynamische drijvende kracht8, waarin stoffen met hogere NOSC gemakkelijker zijn te worden afgebroken, terwijl verbindingen met lagere NOSC steeds meer energieke thee nodig in mindering gebracht. Verbindingen met NOSC, minder dan −2 vereisen een hoge energie opbrengst thee zoals O2, nitraat of MnIV, en kan niet worden gedegradeerd door het algemeen voorkomende lagere energie opbrengst thee zoals FeIII of sulfaat7. Dit is een belangrijke overweging in het vastgereden zuurstofvrije omstandigheden gevonden in wetlands waar O2 en andere hoge energie opbrengst theeën schaars9 zijn en daarom de afbraak van de lagere NOSC verbindingen onder deze omstandigheden zijn thermodynamisch beperkt. Milieu perturbation invloed kan uitoefenen op de thermodynamische staat van het ecosysteem door hydrologische veranderingen die van invloed zijn O2 (de meest energieke elektron acceptor), veranderingen in organische substraten en elektronen acceptoren ter beschikking gesteld door primaire productie, en op een kleinere schaal door temperatuur. Een belangrijk voorbeeld van de temperatuureffecten in het wetland systemen optreedt met betrekking tot de trade-off die tussen homoacetogenesis (dat wil zeggen, acetaat productie van CO2 en H2) en hydrogenotrophic () methanogenese plaatsvindt dat wil zeggen, CH4 productie van CO2 en H2). Bij lage temperaturen lijkt het dat homoacetogenesis is licht favoriet, terwijl warmere temperaturen CH4 productie10 gunst. Dit effect van de temperatuur kan belangrijke gevolgen hebben voor de reactie van ecosystemen aan de veranderende klimaat, zoals CH4 een veel sterker broeikasgas dan CO211 en dus toenemende productie van CH,4 ten koste van is CO2 bij warmere temperaturen kan bijdragen aan een positieve feedback met het klimaat opwarming van de aarde.

Veengebieden produceren wereldwijd aanzienlijke hoeveelheden van CO2 en CH46via microbiële ademhaling van natuurlijk voorkomende biologische materie. De NOSC van de organische koolstof substraten bepaalt het relatieve aandeel van CO2: CH4 geproduceerd die een kritieke parameter is vanwege de hogere radiatieve dwingen van CH,4 vergeleken met CO211, maar ook omdat modellering inspanningen hebben deze verhouding geïdentificeerd als een kritieke parameter voor het schatten van C flux in veengebieden12. Bij gebrek aan terminal elektronen acceptoren dan CO2, kan worden aangetoond door elektron evenwicht dat biologische C substraten met NOSC > 0 wil CO2 produceren: CH4 > 1, organische C met NOSC = 0, treedt er CO2 en CH4 in mengsel verhouding en organische C met NOSC < 1 CO2zal produceren: CH4 < 113. Ontleding van OC in natuurlijke ecosystemen wordt gemedieerd door micro-organismen, zodat zelfs bij afbraak van een specifieke stof thermodynamisch haalbaar is, het kinetisch wordt beperkt door de activiteit van de microbiële enzymen en onder zuurstofvrije omstandigheden, door de thermodynamische motor (d.w.z.NOSC)7. Tot op heden heeft het is uitdagend te volledig karakteriseren de organisch materiaal, aangezien de verscheidenheid van verbindingen aanwezig verschillende complementaire technieken voor hun karakterisering vereist. Recente vooruitgang hebben gesloten de kloof; met behulp van een suite van analytische technieken kunnen wij een groot bereik van organische verbindingen verstrekken van karakterisering van moleculaire-niveau en in sommige gevallen kwantificering, van kleine primaire metabolieten zoals glucose tot 800 Da poly-heterocycles analyseren. Eerder zou dergelijke grote complexe moleculen hebben gekenmerkt gewoon zo lignine-achtige of tannine-achtige en veronderstelde te zijn geweest recalcitrant. De karakterisering van moleculaire-niveau, echter, kan de berekening van de NOSC van zelfs deze grote complexe moleculen. Deze NOSC-waarden zijn lineair gecorreleerd met de thermodynamische drijvende kracht, waardoor voor een beoordeling van de kwaliteit van organisch materiaal beschikbaar voor ontleding, die in veel gevallen blijkt dat deze complexe moleculen kan microbially afbreekbaar zelfs onder de zuurstofvrije omstandigheden die in waterrijke gebieden heersen.

Sinds invoering van O2 organisch materiaal van bijna alle natuurlijk waargenomen NOSC waarden toelaat te worden ontleed, hierin richten we ons op veranderingen in de organische stof en microbiële proteomics die dreigen te worden van de primaire bestuurders in wetland (dat wil zeggen, beperkte O2)-systemen. Alle technieken die we zullen bespreken, kunnen echter van een ecosysteem aan organisch materiaal te worden toegepast. Algemeen, bulk metingen gebaseerd op optische en fluorescentie analyses zijn gebruikt voor het beoordelen van de organische stof kwaliteit3,14. Bij het gebruik van bulk metingen zoals deze, zijn fijne details echter verloren als grote aantallen van moleculen samen zijn gecategoriseerd onder generieke termen zoals humics of fulvics. De definities van deze categorieën zijn niet goed gebonden en, in feite, kunnen variëren van studie tot studie maken vergelijkingen niet onmogelijk. Verder, bulk metingen niet geven van de moleculair detail nodig voor de berekening van de thermodynamica van de regeling en daarom achterblijven echt beoordelen organische stof kwaliteit15.

Individuele technieken zoals Fourier transform ion cyclotron resonantie massaspectrometrie (FTICR-MS), nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie, gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) en massaspectrometrie vloeistofchromatografie (LC-MS) doen bieden van dergelijke moleculair-niveau detail. Terwijl elk van deze technieken eigen beperkingen presenteert, brengen ze ook hun eigen sterke punten, die kunnen zijn leveraged in een geïntegreerde aanpak om de fijne moleculair detail nodig voor het kwantificeren van de kwaliteit van de organische stof in een rigoureuze thermodynamische zin . GC-MS is handig voor het identificeren van de kritische kleine metabolieten, die zouden kunnen proximale invloed hebben op CO2 en CH4 productie (bijvoorbeeld, glucose, acetaat, enz.); echter, GC-MS tegen een standaard verificatie vereist en is daardoor beperkt tot reeds bekende stoffen aanwezig in de database voorkomen identificatie van nieuwe verbindingen. GC-MS is bovendien een semi-kwalitatieve techniek waardoor gevolgtrekking over de wijzigingen in de relatieve concentraties, maar niet het verstrekken van feitelijke concentratie informatie die nodig is voor de berekening van de Gibb vrije energie bijvoorbeeld. Ten slotte, GC-MS vereist bewerking van moleculen vóór de analyse die resolutie verbindingen kleiner dan ~ 400 Da beperkt en vluchtige alcoholen verloren tijdens het drogen stap.

Eendimensionale (1D) 1H vloeibare toestand NMR maakt zeer kwantitatieve karakterisering van kleine metabolieten (inclusief primaire kleine molecuulgewicht metabolieten en vluchtige stoffen als alcoholen, vinylacetaat, aceton, formate, pyruvaat, succinaat, korte-chained vetzuren, evenals een scala aan koolhydraten notoir afwezig of gecompromitteerde uit op basis van MS methoden) en de concentraties ervan zijn vooral nuttig voor de berekening van de thermodynamische parameters. Nog, net als GC-MS, 1D NMR van complexe mengsels normalisatie ten opzichte van een database vereist en daarom alleen kan geen gemakkelijke identificatie van nieuwe verbindingen die dreigen te worden overvloedig in complexe natuurlijke en veranderende ecosystemen. Bovendien, NMR is minder gevoelig dan de op basis van MS-technieken verwezenlijkt en derhalve, kwantitatieve metaboliet profilering is alleen boven 1 µM met behulp van NMR systemen uitgerust met helium gekoelde koude-sondes. Niet op grote schaal gewaardeerd, sommige NMR koude-sondes zijn zout-tolerante en milieu mengsel analyse in aanwezigheid van millimolar zout concentraties wanneer gebruikt in kleinere diameter (< 3 mm buitendiameter) monster-buizen16toestaan. Een verdere complicatie van de NMR is echter, dat grote hoeveelheden paramagnetisch metalen en mineralen (bv, Fe en Mn boven 1-3 wt %), die kan zijn overvloedig in hooggelegen bodems, kan verbreden spectrale kenmerken en compliceren interpretatie van de NMR-spectra . Met behulp van vaste fase extractie (SPE) kunt aide in de interpretatie van de NMR zowel metabolomica op basis van MS methoden door het verminderen van de minerale zouten en spectrale kwaliteit verhogen.

FTICR-MS door directe injectie is een uiterst gevoelige techniek voor het opsporen van tienduizenden van metabolieten van één sample van, maar het doet niet vangen de kritische kleine metabolieten zoals acetaat, pyruvaat en succinaat en is notoir moeilijk te gebruiken voor suikers en andere koolhydraten17, noch verstrekt het kwantitatieve informatie. Echter, in tegenstelling tot de andere technieken, FTICR-MS blinkt uit op te sporen en moleculaire formule toewijzen aan nieuwe verbindingen en daarom geeft het grootste aantal verbindingen meer moleculaire voorlichting dan een van de andere beschreven technieken. Dit is handig, omdat de moleculaire informatie verstrekt door FTICR-MS (en andere technieken) kan worden gebruikt voor het berekenen van NOSC dat verwant is aan de thermodynamische drijvende kracht inzake de waarschijnlijkheid van bepaalde reacties-8 en hun tarieven onder bepaalde voorwaarden7. Bovendien, door de koppeling van FTICR-MS met scheidingstechnieken, zoals LC samen met tandem MS, kwantitatieve structurele informatie kan worden bereikt, verrekening enkele nadelen van deze techniek. LC-MS is handig voor het identificeren van lipide-achtige verbindingen en andere metabolieten die niet goed gekarakteriseerd door een van de andere methoden. Koppeling LC FTICR-MS of LC-MS met een breuk verzamelaar en verzamelen van breuken van specifieke onbekenden van belang voor structurele opheldering van tweedimensionale (2D) vloeibare toestand die NMR de ideale situatie is voor het identificeren en kwantificeren van onbekende verbindingen18 ,19. Dit is echter een zeer tijdrovende stap die kan worden gebruikt als en wanneer dat nodig is. Afzonderlijk genomen, elk van deze technieken bieden een verschillende momentopname van het organisch materiaal, en door hen te integreren, kunnen wij een vollediger inzicht dan het gebruik van een van de technieken in isolatie.

Terwijl de thermodynamische overwegingen stelt u de ultieme beperkingen op welke transformaties mogelijk in een systeem zijn, is decompositie van organisch materiaal bemiddeld door micro-organismen waarvan enzym activiteiten reactiesnelheden controleren. Dus volledig inzicht in de besturingselementen op de ontleding van organisch materiaal en uiteindelijk greenhouse gas (CO2 en CH4) productie van wetlands vraagt om een geïntegreerde omics benadering te karakteriseren van de microbiële enzym-activiteiten, alsmede de metabolieten. In dit artikel beschrijven we een methode voor het bereiken van dergelijke een uitgebreide analyse van een monster met behulp van een sequentiële aanpak die in een volledig gepaarde analyse resulteert. Deze aanpak wordt nader ingegaan op de metaboliet, eiwit en lipide-extractie (MPLex) protocol waarin proteomics ging gepaard met GC-MS en LC-MS20 kleine metabolieten, eiwitten en lipiden identificeren door het opnemen van kwantitatieve metaboliet informatie via NMR en identificatie van grotere secundaire metabolieten via FTICR-MS. iets anders dan MPLex, we beginnen met het protocol met een water extractie en vervolgens gebruik sequentiële extractie met steeds meer niet-polaire oplosmiddelen. Alle extracties worden gedaan op een enkele monster dat monster bespaart wanneer volumes zijn beperkt of moeilijk te verkrijgen en vermindert van experimentele fout ingevoerd via variatie onder aliquots van heterogene monster matrices (b.v., bodem en turf) of verschillen in opslagomstandigheden en duur.

Tot slot, door de koppeling van de analyses OM met proteomics analyses van de microbiële Gemeenschap, kunnen we bouwen metabole netwerken die de trajecten en de transformatie van de ontleding van organisch materiaal beschrijven. Dit laat ons toe om specifieke hypothesen over hoe verstoringen op het systeem ultieme CO2 en CH4 productie door middel van wijziging van de beschikbare organische substraten, elektronen acceptoren en de microbiële gemeenschappen beïnvloeden zal testen bemiddelen de reacties via de activiteit van enzymen katalysatoren.

Het algemene doel van deze methode is bedoeld als een interne doorvoer-protocol voor het analyseren van de metabolieten, lipiden en microbiële eiwitten uit één sample waardoor een volledig gepaarde dataset voor het bouwen van metabole netwerken terwijl analytische fouten beperken .

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. sequentiële winning van organisch materiaal uit de bodem, sedimenten of turf

  1. Bodem, sedimenten of turf via ontkernen verzameld en verdeel kernen volgens de hypothese wordt getest (bijv., diepte). Winkel monsters in polytetrafluorethyleen gecoat containers en bevriezen bij-80 ° C voor de opslag vóór de analyse.
    Opmerking: Ongeveer 25 mg C is nodig voor dit protocol. Voor turf (gewoonlijk 45% C) is 50 mg gedroogde turf vereist. Grotere hoeveelheden van het monster kunnen nodig zijn voor lage biologische monsters zoals minerale of beboste hooglanden bodems afhankelijk van het C-gehalte (maximaal 5 g). Omdat de extractie met organische oplosmiddelen polyethyleenglycol (PEG) zal trekken in de extracten, die ionisatie tijdens stap 2.4 negatief beïnvloeden zal, is het belangrijk om te voorkomen waardoor monsters Neem contact op met kunststof op elk gewenst moment tijdens de verzameling, opslag of extractie.
  2. Als u klaar bent voor het analyseren van de monsters, bevriezen droog tot constant gewicht en vervolgens vermalen van de monsters in een snelle bal molen gebruik van RVS slijpen ballen voor meng en breken alle aggregaten.
    Opmerking: Het protocol op dit punt kan worden onderbroken en het materiaal opgeslagen bij-80 ° C.
  3. Met behulp van een roestvrijstalen gebruiksvoorwerp ethanol-gewassen, aliquoot 50 mg van elk van de gedroogde monsters in individuele 2 mL glazen flesjes. Deze monsters worden opeenvolgend uitgepakt uitpakken met een reeks van oplosmiddelen opeenvolgend steeds apolaire metabolieten van elk monster. Voeg 1 mL gedestilleerd, ontgaste water (H2O) toe aan elk monster, cap de flesjes en schud gedurende 2 uur op een shaker tafel.
  4. Na schudden toestaan de oplossingen staan bij kamertemperatuur (RT) 20 min en centrifugeer bij 15.000 x g gedurende 30 min, decanteren en sla het supernatant uit elk.
    Opmerking: Deze oplossingen zullen in de FTICR-MS door directe injectie worden ingespoten.
  5. Gedrag een Folch extractie21 (ook bekend als MPLEx20) op de nu water geëxtraheerd residuen herhaalt u stap 1.3 en 1.4 vervangen door 1 mL van een-20 ° C 4:3 chloroform: methanol mengsel voor het water in stap 1.3.
    Let op: Chloroform en methanol zijn zowel zeer brandbaar en giftig. Gebruik van passende persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) te vermijden van contact met de huid en het voorkomen van open vuur.
  6. Zorgvuldig scheiden de twee als gevolg van oplosmiddel lagen, die visueel te onderscheiden, voor afzonderlijke analyse door FTICR-MS worden zal met behulp van een scheiding trechter of gewoon verwijderen van de bovenste laag door zorgvuldige pipetteren.
    Opmerking: De chloroform-bevattende breuk worden onderaan terwijl de methanol-bevattende breuk minder dichte is en op de top zullen.
  7. Verdun het extract chloroform (stap 1.6) 1:1 in methanol en het water extract (stap 1.4) 2:1 in methanol efficiënter electrospray ionisatie (ESI) voor FTICR-MS door directe inspuiting.
    Opmerking: De methanol-bevattende breuk in stap 1.7 hoeft niet te worden verdund verder in methanol. De methanol-laag zal worden uitgevoerd door directe injectie op de FTICR-MS.

2.FTICR-MS-analyse

  1. Kalibreren van de spectrometer FTICR door het rechtstreeks injecteren 100 µL van een tuning oplossing (Zie Tabel van materialen) een massale bereik van ongeveer 100-1.300 Da spanning in de FTICR-MS.
  2. Bereid de Suwannee River fulvo zuur (Zie Tabel van materialen) door een oplossing van 1 mg mL-1 te maken in ultrazuiver gefilterd water en vervolgens het verdunnen van de resulterende oplossing voor 20 µg mL-1 in methanol.
  3. Direct injecteren 23 µL van deze laatste oplossing naar de bron van de ESI gekoppeld aan de FTICR spectrometer via een spuitpomp ingesteld op een debiet van 3.0 μL min-1. Naald spanning ingesteld op +4.4 kV, Q1 150 m/z en glazen capillaire bij 180 ° C. Inspecteren van de resulterende spectra met behulp van de software van de analyse (Zie Tabel van materialen) om te bevestigen de kwaliteit van de gegevens.
  4. Het gebruik van methanol van HPLC rang voor voorbeelden uitvoeren en gedurende de bemonstering om te controleren overdracht. Introduceren 23 μL van elk uittreksel via directe inspuiting naar de bron van de ESI gekoppeld aan de FTICR spectrometer via een spuitpomp ingesteld op een debiet van 3.0 μL min-1. Naald spanning ingesteld op +4.4 kV, Q1 150 m/z en glazen capillaire bij 180 ° C.
  5. Ion accumulatie tijd (IAT) aanpassen voor elke steekproef of groep van monsters voor variatie in C concentratie. Typische waarden zijn tussen 0,1 en 0,3 s. verzamelen 144 scans voor elk monster, gemiddelde de scans en vervolgens voeren een interne kalibratie met behulp van homologe CH2 (dat wil zeggen, 14 Da scheiding) serie.
    Opmerking: Na FTICR-MS-analyse, het besluit kan worden genomen om te combineren of het water en methanol geëxtraheerd breuken om te stroomlijnen de resterende stappen of de breuken kunnen worden gescheiden in opeenvolgende stappen. De voor- en nadelen van elke benadering worden uitvoerig beschreven in de discussie. Als daarbij combineren het water en het methanol-geëxtraheerde breuken.
  6. Drogen met behulp van een concentrator extracten en sla de rest van de extracten (~ 1 mL) voor latere GC-MS (water, methanol of water + methanol), LC-MS (chloroform) en analyse van de NMR (water + methanol).
    Opmerking: Het protocol op dit punt kan worden onderbroken en het materiaal opgeslagen bij-20 ° C.

3. FTICR-MS gegevensverwerking

  1. Mede Hiermee lijnt u alle lijsten van de piek van de steekproef voor de gehele dataset te verminderen van de massale verschuivingen en standaardiseren piek toewijzingen met behulp van de Formularity software22 vooruit formule toewijzing.
  2. Gebruik van de Formularity software22 toewijzen van moleculaire formule met een signaal / ruisverhouding groter dan 7, massa meting fout < 1 ppm, en het toestaan van C, H, O, N, S en P met uitsluiting van alle andere elementen.
  3. Als er meerdere kandidaat-formules worden geretourneerd voor een bepaalde massa (frequent boven 500 Da) leggen beperkingen consistent met het materiaal wordt bemonsterd. Bijvoorbeeld, in turf, typische beperkingen omvatten: laagste massa fout, het laagste aantal heteroatomen (N, S, P), en indien aanwezig, P in geoxideerde vorm moet worden (dat wil zeggen, moet er minstens 4 O-atomen voor elk P-atoom in de formule).

4. chemische bewerking voor GC-MS

  1. Blanco-controlemonsters van HPLC-grade hexaan in GC-MS autosampler flesjes23voor te bereiden. Los 100 mg methylvetzuren (FAMEs: C8 - C28) mengsel retentietijd standaard in 200 µL van hexaan.
  2. Ter bescherming van carbonyl groepen, toevoegen 20 μL van 30 mg mL-1 methoxyamine hydrochloride in pyridine aan elk van de methanol extracten en water extracten (of gecombineerde methanol/water extracten gebruikt) vanuit stap 2.6, spaties en FAME kalibratie monsters23. Verzegelen flesjes met doppen.
    Let op: Pyridine is zowel zeer giftig en brandbaar. Draag passende PPE ter voorkoming van huid- of oogcontact en vermijden van open vuur. Bovendien, volatilizes pyridine op RT schadelijke luchtverontreiniging veroorzaken. Werkt alleen in goed geventileerde ruimten onder een zuurkast.
  3. Vortex extracten voor 20 s. Sonicate extracten voor 60 s. Vervolgens, incubeer extracten in een centrifuge bij 37 ° C gedurende 90 minuten bij 100 x g.
    Opmerking: Een bovenmatige hoeveelheid koolhydraten of zouten kan leiden tot metabolieten te kristalliseren na beneden wordt gedroogd. Sonicating van de monsters zal bijdragen tot het reconstrueren van de crystalized metabolieten in de derivatizing reagens.
  4. Na incubatie, Voeg 80 l N-methyl - N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide met 1% trimethylchlorosilane aan elk monster, vortex extracten voor 20 s. Sonicate extracten voor 60 s en extracten opnieuw in een centrifuge bij 37 ° C gedurende 30 minuten bij 100 x g uit te broeden.
  5. Cool extracten aan RT (20-24 ° C), breng in GC-MS autosampler flesjes.

5. GC-MS-analyse

  1. Tune en MS kalibreren volgens de aanbevelingen van de leverancier (Zie Tabel van materialen) vóór de analyse om te controleren of de machine correct MS gegevens lezen. Controleer of helium gasdruk binnen de opgegeven tolerantie is.
  2. Aparte polar metabolieten op een GC kolom (30 m × 0,25 mm × 0.25 μm). De oven temperatuur protocol als volgt instellen: (1) de aanvankelijke temperatuur van 60 ° C gedurende 1 min, (2) helling tot 325 ° C met een snelheid van 10 ° C min-1, en (3) wachtruimte tegelijk 325 ° C gedurende 5 minuten.
  3. Analyseren van extracten met behulp van een GC gekoppeld aan een enkele vierpolige MS. Set injectie poort temperatuur tot een constante 250 ° C. Injecteren 1 μL van elk derivatized uittreksel in de splitless modus.

6. GC-MS gegevensverwerking

  1. Inspecteer alle gegevensbestanden om ervoor te zorgen dat ze correct zijn opgenomen. Aandacht besteden aan mogelijke verschuivingen met betrekking tot de interne standaard retentietijden en intensiteiten te bevestigen dat waarop de gegevens consequent is opgenomen in de analyse.
  2. De leverancier specifieke MS gegevens-formaat converteren naar een algemene MS indeling indien nodig. Proces ruwe data bestanden met behulp van MetaboliteDetector24 kalibreren retentie indexen op basis van de interne standaarden van roem. Na aanpassing van de retentietijden van alle gegevensbestanden, voortzetten deconvolutie en tenslotte metaboliet identificatie congruente retentie indices en GC-MS spectra tegen de FiehnLib polar metaboliet bibliotheek25.
  3. Toetsing resterende niet-geïdentificeerde metabolieten tegen de NIST14 GC-MS-bibliotheek met behulp van spectrale matching. Valideren identificaties individueel te elimineren valse identificaties deconvolutie fouten verminderen.

7. vloeistof staat NMR analyse

  1. Verdun de rest van de water extracten (~ 300 µL) met 10% (vol/vol) met een 5 mM 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6 interne standaard. U kunt ook combineren water en methanol geëxtraheerd uit stap 1 vervolgens resubstitute in water. Door dit te doen echter, sommige van de vluchtige stoffen mogelijk verloren tijdens de freeze-drying stap. Typische eindmonster volumes zijn in het bereik van 180-300 µL.
  2. Breng het mengsel in de buis van een kwalitatief hoogwaardige 3 mm buitendiameter (OD) borosilicaatglas NMR.
  3. Verzamelen van spectra met behulp van een NMR spectrometer (ideaal ten minste beschikbaar 600 het MHz) uitgerust met een 5 mm triple resonantie zout-tolerante koude sonde en een koude-koolstof-voorversterker.
  4. 1D 1H spectra met behulp van een 1 D Nucleair Overhauser effect spectroscopie (NOESY) presaturation experiment op 298 K met een 4 s-Acquisitietijd, 1.5 s recycle vertraging, 65.536 complexe punten en 512 scans te verzamelen.
  5. Verzamelen 2D 1H -13C heteronucleaire single-quantum correlatie (HSQC) en 1H -1H totale correlatie (TOCSY) spectra om te helpen bij het toewijzen van metabolieten en validatie.
  6. Verwerken, toewijzen en analyseren van alle spectra met behulp van de software van de analyse van de NMR (Zie Tabel van materialen) te kwantificeren intensiteiten ten opzichte van de interne standaard. Het identificeren van metabolieten congruente chemische shift, J-koppeling en intensiteit informatie in de monsters tegen de bibliotheek.
    Opmerking: De bibliotheek is verder verbeterd door aangepaste gerichte metaboliet standards and metaboliet toevoegingen gemaakt op een regelmatige basis. Het protocol kan worden onderbroken op dit punt en het materiaal opgeslagen bij-20 ° C.

8. LC-MS jachtgeweerlipidomics analyse

  1. Rewet het extract van de gedroogde chloroform gegenereerd tijdens stap 2.5 met 200 μL van methanol.
  2. 10 μL van elk uittreksel te injecteren in een ultra-performance liquid chromatograaf gekoppeld aan een Orbitrap-massaspectrometer met behulp van een reversed-phase oppervlakte hybride kolom (3,0 mm × 150 mm × 1.7 micrometer deeltjesgrootte) in rekening gebracht. Een 34-min-verloop (mobiele fase A: acetonitril/H2O (40:60) met 10 mM ammoniumacetaat; mobiele fase B: acetonitril/isopropanol (10:90) met 10 mM ammoniumacetaat) vastgesteldop met een debiet van 250 µL/min. gebruik, zowel negatieve als positieve ionisatie-modi met hogere energie botsing dissociatie en botsing veroorzaakte dissociatie.
    Let op: Acetonitril is een oog, huid en luchtwegen irriterend. Draag passende PPE. Daarnaast is acetonitril brandbaar. Laat geen contact opnemen met oxiderende stoffen, giftige dampen kunnen worden geproduceerd tijdens het branden.
  3. Upload de raw data-bestanden van LC-MS/MS in vloeistof samen met het doelbestand (d.w.z., lijst > 25.000 lipide soorten) voor de respectieve ionisatie-modus (positief of negatief). Het verwerken van de raw-bestand. Handmatig valideren de resulterende identificaties door het onderzoek van de MS/MS-spectra op aanwezigheid van diagnostische ionen, als toepasselijk, bijpassende fragment ionen (bijvoorbeeld vette acylketens), isotopenscheiding, massa ppm fout van de precursoren, en de retentietijd. Resulterende lijst van vertrouwen geïdentificeerde lipiden als een .tsv-bestand exporteren.
    Opmerking: Het protocol op dit punt kan worden onderbroken en opslaan van het materiaal bij-20 ° C.

9. Proteomics analyse

  1. Pak eiwitten volgens de MPLEx protocol van20 uit de rest van de methanol-fase als gevolg van stap 2.4, van het extract met 20 maal het volume van het extract van methanol extra koude (-20 ° C) wassen.
  2. Gebruik een 1 mL/50 mg silica gebaseerde sorptiemiddel (Zie Tabel van materialen) aan voorwaarde C18 SPE kolommen met 3 mL methanol, 2 mL 0,1% trifluorazijnzuur (TFA) in water, gevolgd door de toevoeging van het uittreksel uit stap 9.1 bij een snelheid van niet meer dan 1 mL/min.
  3. Na de toevoeging van het monster, wassen van de kolom met 4 mL water: acetonitrile:TFA 95:4.9:0.1, en vervolgens laten drogen. Plaats een buis 1,5 mL collectie onder de kolom van de SPE en elueer de steekproef met 1 mL 80:19.9:0.1 methanol: water: TFA.
  4. Concentraat de uittreksels aan 100 µL onder vacuüm-bijgewoonde bevriezen droger, meet vervolgens de eiwitconcentratie door bicinchoninic zuur (BCA) colorimetrische bepaling26 bij een golflengte van 562 nm.
  5. Centrifuge extracten bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. De resulterende vloeistof wordt weggeworpen en de resterende pellet onder vacuüm droog voor 5 min. resuspendeer de pellet eiwit in water met een eindconcentratie van 0,1 µg peptide per µL.
  6. Dithiothreitol toevoegen aan een eindconcentratie van 5 mM en Incubeer bij 60 ° C gedurende 30 min. Dilute 10-fold met ureumoplossing van 100 mM NH4HCO38 M en Incubeer bij 37 ° C gedurende 3 uur in aanwezigheid van 1 mM CaCl2 en varkens trypsine bij een 1:50 enzym aan proteïne verhouding.
    Opmerking: Protocol kan op dit moment worden gepauzeerd materiaal en opslaan bij-20 ° C.
  7. Aparte extracten via vloeibare chromatografie met een exponentiële verloop van een 0,1% mierenzuur water mobiele fase (A) en een 0,1% mierenzuur in de mobiele fase acetonitril (B) op 10 kpsi en 500 nL min-1.
  8. Resulterende eluens in een ESI-coupled massaspectrometer verzamelen van spectra van 400-2.000 m/z met 100.000 resolutie m/z 400 in een lineaire ion trap (LTQ) Orbitrap-massaspectrometer introduceren.
  9. RAW spectra bestanden converteren naar de indeling van de mzML met behulp van msConvert of ProteoWizard aanvaarden alle standaardparameters. Gebruik de zoekmachine van de database met universele MSGFPlus zoeken resulterende proteomes tegen een gerichte eiwit database van proteïne sequenties voorspeld op grond van relevante metagenome geassembleerd genomen.
  10. Gemeenschappelijke verontreinigingen (bijvoorbeeldtrypsine, keratine, albumine) toevoegen en verwijderen van alle precies gedupliceerde proteïne sequenties ter verbetering van de peptide-naar-massa-spectrum wedstrijd statistieken. De resulterende MSGF spectrale waarschijnlijkheid scores om te bepalen welke peptide-naar-massa-spectrum-wedstrijd is het beste te evalueren. Gebruik de Q-waarde van MSGFPlus voor het filteren van de stapel van de volledige gegevens te valse ontdekking van 1% tarief (FDR).

10. metabolomica analyse en metabolische netwerk gebouw

  1. Compileer alle metaboliet molecuulformule geïdentificeerd in stap 3, 6, 7 en 8 in een enkele database van metabolieten aanwezig zijn in de monsters. Deze metabolieten te combineren met het enzym Commissie (EC) of KEGGEN Orthology (KO) aantal enzymen die geïdentificeerd in stap 9. Zoek deze gecombineerde dataset tegen de KEGGEN27 database, stofwisselingsroutes sectie.
  2. Handmatig resultaten te identificeren van de meest waarschijnlijke trajecten en integreren in een metabole model te evalueren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We het protocol beschreven aanvullende analyse uitgevoerd en ten opzichte van turf met diepte in het moeras van de S1 in de Spar en de veengebieden reactie onder veranderende omgevingen (spar) site in Minnesota, Verenigde Staten. Deze resultaten worden vergeleken met die van een permafrost Veen en moeras van Noord-Zweden om te laten zien hoe sites kunnen variëren in metaboliet en enzym activiteiten. We geïdentificeerd 3,312 enzymen in de analyse van proteomics. Een analyse van de activiteiten van de enzymen met diepte bl...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De single-doorvoer, volledig-coupled analyse stream gebruikt voor het karakteriseren van de metabolieten en de Proteoom biedt inzichten in de trajecten door welke C fietsen in een complex ecosysteem plaatsvindt. Bodem en turf zijn heterogene matrices, en daarom één van de essentiële stappen van deze methode in de vroegste stappen om ervoor te zorgen dat de startende turf of het materiaal van de bodem zeer homogene optreedt. Het is beter om het slijpen van het monster, evenals de aggregaten extractie-efficiëntie kunnen ve...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We zouden graag bedanken J.P. Chanton, J.E. Kostka en M.M. Kolton voor hulp bij het verzamelen van monsters van de veen. Delen van dit werk werden uitgevoerd bij de moleculaire wetenschappen milieulaboratorium, een DOE Office van wetenschap gebruiker faciliteit gesponsord door het Office van biologische en milieuonderzoek. PNNL wordt beheerd door Battelle voor het DOE onder Contract DE-AC05-76RL01830. Dit werk werd gesteund door de Amerikaanse Department of Energy, Office of Science en Office van biologische en milieu onderzoek (verleent: DE-AC05-00OR22725, DE-SC0004632, DESC0010580, DE-SC0012088 en DE-SC0014416).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
methoxyamine hydrochlorideSigma Aldrich226904derivatiseringsmiddel
5 mm triple resonance salt-tolerant cold probe Brukerinstrumentatie
capillary GC column HP-5MS column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)AgilentAG19091S-433instrumentatie
reversed phase charged surface hybrid column (3.0 mm × 150 mm × 1.7 μm deeltjesgrootte)ThermoFisherinstrumentatie
2 mL glazen vialsVWR International46610-722monstervial
autosampler vialsVWR International97055-324; 9467671monstervial
ChloroformVWR InternationalJT9174-3oplosmiddel
EthanolVWR InternationalBDH67002.400oplosmiddel
methanolVWR InternationalBDH85681.400oplosmiddel
pyridineVWR InternationalBDH67007.400oplosmiddel
2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6Sigma Aldrich178837standaard
C8-C24 vetzuurmethylesterSigma AldrichCRM18918standaard
N-methyl-N- (trimethylsilyl)trifluoraceetamideSigma Aldrich24589-78-4standaard
Suwanee River Fulvic Acid standaardInternational Humic Substances Society2S101Fstandaard
trimethylchlorosilaneSigma Aldrich89595standaard
Tuning SolutionAgilent
FTICR-MS analysesoftwareBrukerCompass DataAnalysis 4.1
Formularity SoftwarePacific Northwest National LaboratoryFormularitybeschikbaar om te downloaden op: https://omics.pnl.gov/software/formularity
GC-MSAgilentAgilent GC 7890A met MSD 5975C
silica-based sorbentPhenomenex (Torrance, CA)Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK)
NMR TUBE 3MM 8 150 CS5VWR InternationalKT897820-0008NMR buis
Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer Varian InovaVarian Direct Drive 600-MHzNMR spectrometer
Chenomx NMR Suite 8.3ChenomxChenomx NMR SuiteNMR software
ultra-performance vloeistofchromatograaf watersAquity UPLC H vloeistofchromatograaf 
Velos-ETD Orbitrap massaspectrometer ThermoFisherThermo Scientific LTQ Orbitrap Velosmassaspectrometer 
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bridgham, S. D., Megonigal, P. J., Keller, J. K., Bliss, N. B., Trettin, C. The carbon balance of North American wetlands. Wetlands. 26 (4), 889-916 (2006).
  2. Wilson, R. M., et al. Greenhouse gas balance over thaw-freeze cycles in discontinuous zone permafrost. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 122 (2), 387-404 (2017).
  3. Broder, T., Knorr, K. H., Biester, H. Changes in dissolved organic matter quality in a peatland and forest headwater stream as a function of seasonality and hydrologic conditions. Hydrology and Earth System Sciences. 21 (4), 2035-2051 (2017).
  4. Ejarque, E., et al. Quality and reactivity of dissolved organic matter in a Mediterranean river across hydrological and spatial gradients. Science of The Total Environment. 599, 1802-1812 (2017).
  5. Valenzuela, E. I., et al. Anaerobic methane oxidation driven by microbial reduction of natural organic matter in a tropical wetland. Applied and Environmental Microbiology. 83 (11), e00645-e00617 (2017).
  6. Lehmann, J., Kleber, M. The contentious nature of soil organic matter. Nature. 528 (7580), 60-68 (2015).
  7. Keiluweit, M., Nico, P. S., Kleber, M., Fendorf, S. Are oxygen limitations under recognized regulators of organic carbon turnover in upland soils? Biogeochemistry. 127 (2-3), 157-171 (2016).
  8. LaRowe, D. E., Van Cappellen, P. Degradation of natural organic matter: A thermodynamic analysis. Geochimica et Cosmochimica Acta. 75 (8), 2030-2042 (2011).
  9. Wilson, R. M., et al. Hydrogenation of organic matter as a terminal electron sink sustains high CO2: CH4 production ratios during anaerobic decomposition. Organic Geochemistry. 112, 22-32 (2017).
  10. Ye, R., Jin, Q., Bohannan, B., Keller, J. K., Bridgham, S. D. Homoacetogenesis: A potentially underappreciated carbon pathway in peatlands. Soil Biology and Biochemistry. 68, 385-391 (2014).
  11. Neubauer, S. C., Megonigal, J. P. Moving beyond global warming potentials to quantify the climatic role of ecosystems. Ecosystems. 18 (6), 1000-1013 (2015).
  12. Ma, S., et al. Data-Constrained Projections of Methane Fluxes in a Northern Minnesota Peatland in Response to Elevated CO2 and Warming. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 122 (11), 2841-2861 (2017).
  13. Conrad, R. Contribution of hydrogen to methane production and control of hydrogen concentrations in methanogenic soils and sediments. Federation of European Microbiological Societies Microbiology Ecology. 28 (3), 193-202 (1999).
  14. Cunada, C. L., Lesack, L. F. W., Tank, S. E. Seasonal dynamics of dissolved methane in lakes of the Mackenzie Delta and the role of carbon substrate quality. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 123 (2), 591-609 (2018).
  15. Wilson, R. M., Tfaily, M. M. Advanced molecular techniques provide new rigorous tools for characterizing organic matter quality in complex systems. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 123 (6), 1790-1795 (2018).
  16. Borton, M. A., et al. Coupled laboratory and field investigations resolve microbial interactions that underpin persistence in hydraulically fractured shales. Proceedingsof the National Academy of Sciences. 115 (28), E6585-E6659 (2018).
  17. Tang, K., Page, J. S., Smith, R. D. Charge competition and the linear dynamic range of detection in electrospray ionization mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 15 (10), 1416-1423 (2004).
  18. Boiteau, R. M., et al. Structure Elucidation of Unknown Metabolites in Metabolomics by Combined NMR and MS/MS Prediction. Metabolites. 8 (1), 8(2018).
  19. Walker, L. R., et al. Unambiguous Metabolite Identification in High-throughput Metabolomics by Hybrid 1DNMR/ESI MS Approach. Magnetic Resonance in Chemistry. 54 (12), 998-1003 (2016).
  20. Nicora, C. D., Burnum-Johnson, K. E., Nakayasu, E. S., Casey, C. P., White III, R. A., Roy Chowdhury, T., Kyle, J. E., Kim, Y. M., Smith, R. D., Metz, T. O., Jansson, J. K., Baker, E. S. The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples. J. Vis. Exp. (135), e57343(2018).
  21. Folch, J., Lees, M., Sloane-Stanley, G. H. Extraction of fatty acid. Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).
  22. Tolic, N., et al. Formularity: software for automated formula assignment of natural and other organic matter from ultrahigh-resolution mass spectra. Analytical Chemistry. 89 (23), 12659-12665 (2017).
  23. Kim, Y. M., et al. Diel metabolomics analysis of a hot spring chlorophototrophic microbial mat leads to new hypotheses of community member metabolisms. Frontiers in microbiology. 6, 209(2015).
  24. Hiller, K., et al. MetaboliteDetector: comprehensive analysis tool for targeted and nontargeted GC/MS based metabolome analysis. Analytical Chemistry. 81 (9), 3429-3439 (2009).
  25. Kind, T., et al. FiehnLib: mass spectral and retention index libraries for metabolomics based on quadrupole and time-of-flight gas chromatography/mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (24), 10038-10048 (2009).
  26. Kyle, J. E., et al. LIQUID: an-open source software for identifying lipids in LC-MS/MS-based lipidomics data. Bioinformatics. 33 (11), 1744-1746 (2017).
  27. Kanehisa, M. Enzyme annotation and metabolic reconstruction using KEGG. Protein Function Prediction: Methods and Protocols. 1611, 135-145 (2017).
  28. Van Krevelen, D. W. Graphical-statistical method for the study of structure and reaction processes of coal. Fuel. 29, 269-284 (1950).
  29. Hodgkins, S. B., et al. Changes in peat chemistry associated with permafrost thaw increase greenhouse gas production. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (16), 5819-5824 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Natural Organic MatterFTICR MS AnalysisGC MS AnalysisNMR SpectroscopyLC MS AnalysisProteomics AnalysisSequential ExtractionMPLEx ExtractionMetabolite CharacterizationPeatland Samples

Gerelateerde artikelen