Method Article

Identificatie van nieuwe CK2 Kinase substraten met behulp van een veelzijdige benadering van de biochemische

DOI:

10.3791/59037

⸱

February 21st, 2019

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Drexel University College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De doelstelling van dit protocol is label, verrijken en identificeren van substraten voor proteïne kinase CK2 uit een complexe biologische monster zoals een cel lysate of weefsel homogenaat. Deze methode maakt gebruik van unieke aspecten van CK2 biologie voor dit doel.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De studie van kinase-substraat relaties is essentieel voor een compleet begrip van de functies van deze enzymen en hun downstream doelen in zowel fysiologische en pathologische staten krijgen. CK2 is een evolutionair geconserveerde serine/threonine kinase met een groeiende lijst van honderden substraten die betrokken zijn bij meerdere cellulaire processen. Wegens zijn pleiotropic eigenschappen, is identificatie en karakterisering van een uitgebreide set van CK2 substraten bijzonder uitdagende en blijft een hindernis in de studie van dit belangrijke enzym. Om aan deze uitdaging, hebben we een veelzijdige experimentele strategie waarmee de gerichte verrijking en identificatie van vermeende CK2 substraten bedacht. Dit protocol maakt gebruik van de specificiteit van de unieke dual co substraat van CK2 rekening houdend met de specifieke thiophosphorylation van de substraten in een cel of een weefsel lysate. Vervolgens worden deze eiwitten substraat Gealkyleerde, immunoprecipitated, en geïdentificeerd door vloeibare chromatografie/tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS). Wij hebben vroeger deze aanpak succesvol identificeren CK2 substraten van Drosophila eierstokken en hier verlengen we de toepassing van dit protocol aan menselijke glioblastoma cellen, ter illustratie van het aanpassingsvermogen van deze methode te onderzoeken de Biologische rol van deze kinase in verscheidene modelorganismen en experimentele systemen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eiwit kinases zijn belangrijke componenten voor signaaltransductie cascades. Fosforylering van substraat eiwitten door deze enzymen lokt biologische reacties die kritieke gebeurtenissen controleren celdeling, metabolisme en differentiatie, o.a. regelen. CK2 is een acidophilic, overal die zich uiten serine/threonine kinase dat is geconserveerd uit gist bij de mens en dat speelt belangrijke rol in veel cellulaire processen variërend van transcriptionele verordening tot celcyclus aan apoptosis1 ,2,3. Het enzym is een heterotetramer samengesteld uit twee katalytische α (of α') subeenheden en twee regelgevende β-subunits4. Naast het feit dat zeer pleiotropic, vertoont CK2 twee andere ongebruikelijke kenmerken die haar analyse bemoeilijken, namelijk constitutieve activiteit5 en dubbele co substraat specificiteit6. Deze laatste eigenschap schenkt CK2 met de mogelijkheid om gebruik van GTP evenals ATP voor fosforylering van eiwitten van het substraat.

Genetische schrapping van de katalytische of regelgevende subeenheden van CK2 in muizen resulteert in embryonale letaliteit die aangeeft dat het een cruciale rol tijdens het ontwikkelen en organogenese7,8 speelt. CK2 is ook overexpressie in verschillende soorten kanker en vormt aldus een veelbelovend therapeutisch doel9,10,11. Inderdaad, specifieke remmers dat doel CK2 kinaseactiviteit momenteel onderzochte voor dit doel12,13,14. Terwijl remming van CK2 een haalbare optie is, gezien het pleiotropic karakter, een alternatief en misschien meer rationele benadering zou moeten richten op kritische CK2 substraten die ten grondslag liggen aan de voortgang van bepaalde kankers. Daarom zou de uitvoerige identificatie en karakterisering van CK2 substraat eiwitten aanzienlijk voordeel voor het ophelderen van de specifieke functie (s) van deze kinase binnen een bepaald weefsel of tumor type.

Hier beschrijven we een veelzijdige biochemische methode voor het identificeren van CK2 substraten uit een complexe biologische monster zoals een cel of een weefsel lysate. Dit protocol maakt gebruik van de specificiteit van de dubbele co substraat van CK2 door gebruik van de GTP analoge GTPγS (calciumguanosine 5'-[γ-thio]triphosphate) die andere endogene kinases niet kunnen gebruiken. Hierdoor kunnen effectief de kinase "label" haar substraten binnen dit voorbeeld voor latere isolatie en identificatie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opmerking: Zorg ervoor dat de benodigde materialen beschikbaar en goed voorbereid zijn (Zie Tabel van materialen).

1. voorbereiding

  1. Mechanisch lyse weefsel monster (1-2 mg van weefsel in 100 µL van lysis buffer, tabel 1) of gekweekte cellen (10 cm plaat die is 80-90% heuvels in 350 µL van lysis-buffermengsel), met als doel om te verzamelen van een totaal van 900 µL van monster voor het experiment. Merk op dat dit volume in lichte overmaat is van wat vereist voor het experiment is hieronder beschreven.
  2. Spin down de monsters door centrifugeren bij 17.500 x g gedurende 3 minuten bij 4 ° C. Na voltooiing, breng 270 µL van het supernatans dat aan elk van de drie nieuwe 1,7 mL microcentrifuge buizen. Er zullen ongeveer 90 µL resterende. Verwijder 40 µL moet worden gebruikt als een "invoercontrole" en breng dit in een nieuwe buis. Leg alle monsters op het ijs.

2. kinase assay: thiophosphorylation en alkylatie

  1. Label de drie buizen met 270 µL elke als volgt: "kinase rxn", "GTPγS", en "PNBM (p-nitrobezyl mesylaat) alleen". De kinase reacties voor te bereiden.
    1. Aan de "kinase rxn" buis, 2.7 µL (equivalent aan 1.350 U) CK2 toevoegen, voeg dan 2,7 µL van 2,5 mM GTPγS.
    2. Aan de "GTPγS alleen" buis, voegt toe 2.7 µL van 2.5 mM GTPγS, en vervolgens 2.7 µL van lysis buffer.
    3. Voeg aan de "PNBM alleen" buis, 5.4 µL van lysis buffer. Flick alle buizen om te mengen en vervolgens onmiddellijk plaats op ijs.
  2. Alle drie buizen voor 1 min in een waterbad van 30 ° C te incuberen. Na incubatie, aan alle drie buizen met toevoegen van 13,5 µL van 12 mg/mL PNBM. Omkeren te mengen van monsters. Incubeer deze monsters bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
  3. Na het starten van de incubatie in stap 2.2, bereiden de demineralisatie kolommen zo spoedig mogelijk als het proces duurt ongeveer 45 min.

3. voorbereiding voor het ontzouten van kolommen

  1. In eerste instantie bereid kolommen (3 voor dit voorbeeld experiment) door het omkeren van elke kolom meerdere malen naar hars resuspendeer de Sephadex G-25 in de opslag-buffer. Laat de hars te regelen door elke kolom vast te hechten aan een standaard klem en te laten zitten ongestoord gedurende ongeveer 5 minuten.
  2. Na afwikkeling van de Sephadex G-25 hars, de doppen verwijderen uit zowel de boven- en onderkant van de kolom om de buffer van de opslag te afvoer door de zwaartekracht en een buis geplaatst onder de onderste opening voor het verzamelen van de doorstroming voor negeren.
  3. Zodra opslag buffer is uitgeput, toevoegen ongeveer 2,7 mL lysisbuffermengsel om equilibreer de kolommen. Verzamel de doorstroming en negeren. Herhaal dit 3 keer. Na de definitieve equilibratietijd zijn de kolommen klaar voor stap 4.1.

4. de verwijdering van PNBM

  1. Nadat de 1U incubatie (stap 2.2) en de kolom voorbereiding (stap 3) voltooid zijn, gelden de monsters voor de kolommen. Label elke kolom als volgt: "kinase rxn", "Alleen GTPγS" en "Alleen PNBM". Laad alle van elk monster op de betreffende kolom. Verzamelen en gooi de doorstroming.
  2. Wassen monsters door 420 µL van lysis buffer toe te voegen aan elke kolom. Lysis-buffermengsel verzamelen de doorstroming voor teruggooi te filteren door de kolom toestaan. Na deze wassen stap, buizen in positie voor het verzamelen van monsters te plaatsen.
  3. Elueer monsters door 500 µL van lysis buffer toe te voegen aan elke kolom. Verzamel de doorstroming dat nu thiophosphorylated en Gealkyleerde CK2 substraten bevat.

5. Immunoprecipitation: Deel I

  1. Voorbereiding van monsters voor immunoprecipitation door eerste verwijderen 80 µL voor een "elutie input controle" monster uit elk van de respectieve elutions ("kinase rxn", "Alleen GTPγS" en "PNBM alleen") verzameld in stap 4.3. Na verwijdering van 80 µL van elk monster, zal er ongeveer 420 µL resterende per monster.
    1. Elk monster worden gesplitst in 2 buizen met elke 200 µL. Label elke respectieve buis: "kinase rxn anti-thiophosphate ester", "kinase rxn IgG", "GTPγS anti-thiophosphate ester", "GTPγS IgG", "PNBM anti-thiophosphate ester" en "PNBM IgG".
  2. Voeg 2.8 µg van anti-thiophosphate ester antilichaam aan elk van de anti-thiophosphate ester-geëtiketteerden buizen en 2.8 µg isotype controle antilichaam aan elk van de IgG-geëtiketteerden buizen. Plaats de buizen op een rotator bij 4 ° C gedurende 2 uur.
  3. Voorbereiding van eiwit A/G parel tijdens de laatste 15 min van de incubatie 2 h in stap 5.2 beginnen.

6. eiwit A/G agarose kraal voorbereiding

  1. Kort vortex de opslag buis om kralen zijn volledig opnieuw geschorst. Het einde van een P200 afgesneden pipette uiteinde met behulp van een schone scheermesje teneinde gauge grootte. Pipetteer 100 µL van de kraal drijfmest per immunoprecipitation in een nieuwe 1,7 mL microcentrifuge buis. Voor dit voorbeeld, een totaal van 6 buizen nodig zijn.
  2. Centrifugeer de buizen bij 17.500 x g gedurende 1 minuut bij 4 ° C. De bovendrijvende vloeistof verwijderen en weggooien. Resuspendeer de kralen in 200 µL van lysis-buffermengsel en kort vortex. Herhaal de spin en wassen stappen 3 keer.
  3. Na de definitieve wash, plaatst u de kralen op ijs totdat de incubatie in stap 5.2 voltooid is.

7. Immunoprecipitation: Deel II

  1. Na de incubatie 2 h vanaf stap 5.2 spin down de monsters bij 17.500 x g gedurende 3 min bij 4 ° C. Na centrifugeren Voeg toe 200 µL van elk monster aan de buizen met de gewassen kralen. Plaats de buizen op een rotator bij 4 ° C gedurende 1 uur.
  2. Na de incubatie van 1 h, centrifugeer de buizen bij 17.500 x g gedurende 1 minuut bij 4 ° C. Volgende 40 µL van supernatant van elk monster verwijderen en opslaan als een "uitputting control" (totaal 6 buizen). Verwijder de rest van de bovendrijvende substantie en negeren. Wees voorzichtig niet te storen van de kralen.
  3. Het wassen van de monsters door toevoeging van 200 µL van lysis buffer en vortexing kort. Vervolgens Centrifugeer bij 17.500 x g voor 1 min bij 4 ° C. De bovendrijvende vloeistof verwijderen en weggooien. Herhaal het wassen en spin stappen 3 keer. Wees voorzichtig niet te verstoren de kralen tijdens deze stappen.
  4. Na het voltooien van de stappen wassen, voeg toe 50 µL van 2 x monster buffer aan elk monster met kralen. Voor alle andere monsters, voeg 8 µL van 6 x monster buffer: "invoercontrole", "elutie input besturingselementen" en "uitputting controls".
  5. Zodra de buffer wordt toegevoegd aan de buizen, Pipetteer omhoog en omlaag te mengen, en verwarmen van alle monsters bij 95 ° C gedurende 5 minuten voordat u verdergaat met SDS-pagina.

8. analyse/validatie van resultaten

  1. Valideren van succesvolle CK2-afhankelijke thiophosphorylation en alkylatie.
    1. Uitvoeren om te bepalen van de werkzaamheid van CK2-gemedieerde thiophosphorylation in stap 2.2, SDS-pagina en het westelijke bevlekken door 15-20 µL van de "elutie input controles" verzameld in stap 5.1 op een 12,5% polyacrylamide-gel uit te voeren.
    2. Sonde membranen met de volgende antistoffen: anti-thiophosphate ester, anti-CK2α, en anti-GAPDH (of andere passende laden controle). Als deze stap succesvol was, is een verbeterde anti-thiophosphate ester signaal moet herkenbaar in de baan van de "kinase rxn" in vergelijking met de andere twee rijstroken (Figuur 2).
  2. Visualiseer verrijkt putatief substraten voor CK2 en eiwit identiteit te bepalen.
    1. Uitvoeren om te beoordelen als de immunoprecipitation stappen succesvol waren, 25-30 µL van de monsters van de kralen in stap 7.4 op een aparte polyacrylamidegel van 12,5% geëlueerd. Ervoor zorgen dat alle apparatuur schone is en draag handschoenen te allen tijde tijdens deze stap naar het minimaliseren van verontreiniging.
    2. Vlek de gel met Coomassie blue te visualiseren verrijkt eiwitten uit verschillende stadia van het experimentele protocol (Figuur 3). Met behulp van nieuwe scheermesjes, presenteren zorgvuldig accijnzen unieke bands in de "kinase rxn anti-thiophosphate ester IP" lane, vaststellend van hun geschatte molecuulgewicht.
    3. Deze bands voor eiwit identificatie uiterlijk vloeibare chromatografie/tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) (Figuur 4). Als antistoffen gericht tegen de geïdentificeerde eiwitten beschikbaar zijn, bevestigen de resultaten van de Spectrometrie van de massa door SDS-PAGE en immunoblotting van input, uitgeput, en IP-breuken verzameld in de loop van het protocol (Figuur 4).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een schematisch diagram van de experimentele procedure wordt gegeven in Figuur 1. De onderliggende basis van de techniek is het ongebruikelijk vermogen van CK2 GTP eigenschappenstijl gebondenkleurstof groep overdracht. Toevoeging van exogene CK2 holoenzyme samen met de GTP analoge, GTPγS, naar een cel lysate resulteert in thiophosphorylation van endogene CK2 substraten. Latere behandeling van de lysate met de alkylerend reagens p- nitrobenzyl mesylaa...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een relatief eenvoudige biochemische methode voor het identificeren van substraten voor proteïne kinase CK2 uit een complexe biologische monster. De kritische stappen van dit protocol zijn gebaseerd op de ongewone enzymatische eigenschappen van CK2 en bevatten CK2-afhankelijke thiophosphorylation van specifieke substraat eiwitten met behulp van GTPγS en hun latere immunoprecipitation en identificatie. Met deze resultaten hebben wij het nut en de veelzijdigheid van deze aanpak aangetoond zoals...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gedeeltelijk gesteund door een subsidie van de Commonwealth universele onderzoek verbetering van het ministerie van volksgezondheid van Pennsylvania naar T.I.S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12 mg/mL PNBMAbcamab13891040.5 µL
2.5 mM GTPγSSigma-AldrichG8634-1MG5.4 µL
Anti-CK2α (E-7) muis monoclonale antilichaamSanta Cruz Biotechnologysc-3738941:1000 voor Western blotting
Anti-GAPDH (6C5) muis monoclonale antilichaamSanta Cruz Biotechnologysc-322331:1000 voor Western blotting
Anti-nucleolin konijn polyklonaal antilichaamAbcamab227581:1000 voor Western blotting
Anti-thiofosfaatester [51-8] konijn monoklonaal antilichaamAbcamab92570Varies (finale concentratie 2,8 µg voor elk monster)
Centrifuge vooraf ingesteld op 4ºCThermoScientificSorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 
cOmplete Mini EDTA-Free Protease InhibitorRoche11836170001
Lysis BufferZie recept hieronderZie recept hieronder30 mL
Normaal konijn IgG antilichaam (isotype controle)Cell Signaling Technology2729S Varies (finale concentratie 2,8 µg voor elk monster)
PD MiniTrap KolomGE Healthcare28-9180-103 kolommen
Protein A/G Plus Agarose BeadsSanta Cruz Biotechnologysc-2003600 µL
Recombinant menselijk CK2 holo-enzymNew England BiolabsP6010S2,7 µL
RotatorLabnet: Mini LabrollerMini Labroller SKU# H5500
T98G menselijke glioblastoom cellenATCCCRL-1690
Waterbad vooraf ingesteld op 30ºCShel LabH20 Bath Series Model# SWB15

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Litchfield, D. W. Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death. Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).
  2. Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2). Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).
  3. Meggio, F., Pinna, L. A. One-thousand-and-one substrates of protein kinase CK2. The FASEB Journal. 17 (3), 349-368 (2003).
  4. Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme. The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).
  5. Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme. Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).
  6. Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2. Nature Structural & Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).
  7. Lou, D. Y., et al. The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development. Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).
  8. Buchou, T., et al. Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality. Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).
  9. Chua, M. M., et al. CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target. Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).
  10. Tawfic, S., et al. Protein kinase CK2 signal in neoplasia. Histology and Histopathology. 16 (2), 573-582 (2001).
  11. Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).
  12. Siddiqui-Jain, A., et al. CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy. Cancer Research. 70 (24), 10288-10298 (2010).
  13. Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies. Frontiers in Pharmacology. 6, 70(2015).
  14. Perea, S. E., et al. CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).
  15. Xiao, S., et al. Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation. PLoS One. 9 (10), e109858(2014).
  16. Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).
  17. Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity. Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).
  18. McMillan, E. A., et al. The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis. Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).
  19. Turowec, J. P., et al. Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells. Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).
  20. Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics. Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97(2017).
  21. Bian, Y., et al. Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow. Scientific Reports. 3, 3460(2013).
  22. Franchin, C., et al. Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).
  23. Franchin, C., et al. Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CK2 SubstratesKinase AssayThiophosphorylationLC MS MSImmunoprecipitationGTPgammaS LabelingSephadex G 25Anti Thiophosphate EsterProtein IdentificationWestern Blot

Related Articles