Methodenartikel

Analyseren van zuurstof verbruik tarief in neonatale Cardiomyocytes primaire gekweekte muis met behulp van een extracellulaire Flux-Analyzer

8.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59052

⸱

13 februari 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, University of California San Diego, 2Department of Pharmacology, University of California San Diego, 3Cardiology Section, Department of Medicine, Veterans Administration Healthcare, San Diego

In dit artikel

Samenvatting

Het doel van dit protocol is te illustreren hoe gebruik van muis neonatale cardiomyocytes als een modelsysteem om te onderzoeken hoe de verschillende factoren kunnen wijzigen zuurstofverbruik in het hart.

Samenvatting

Mitochondriën en oxidatieve metabolisme zijn kritisch voor de handhaving van de functie van de hartspier. Onderzoek heeft aangetoond dat mitochondriale dysfunctie is een belangrijke factor die bijdraagt aan verminderde hartfunctie bij hartfalen gevonden. Daarentegen, kan herstel van defecte mitochondriale functie hebben gunstige effecten ter verbetering van de hartfunctie in het falende hart. Dus, de regulerende mechanismen te bestuderen en het identificeren van nieuwe regelgevende instanties voor mitochondriale functie kunnen inzicht geven die kan worden gebruikt voor het ontwikkelen van nieuwe therapeutische doelen voor de behandeling van hart-en vaatziekten. Hier, wordt cardiale myocyte mitochondriale ademhaling geanalyseerd met behulp van een unieke celcultuur. Ten eerste, een protocol is geoptimaliseerd om snel isoleren en hoge levensvatbaarheid neonatale muis cardiomyocytes cultuur. Vervolgens wordt een 96-Wells-indeling extracellulaire flux analyzer gebruikt ter beoordeling van de zuurstof verbruik tarief van deze cardiomyocytes. Voor dit protocol, we geoptimaliseerd zaaien voorwaarden en aangetoond dat pasgeborenen muis cardiomyocytes zuurstof verbruik tarief kan gemakkelijk worden beoordeeld in een extracellulaire flux-analysator. Tot slot, wij stellen vast dat ons protocol kan worden toegepast op een groter formaat van de cultuur en andere studies, zoals de intracellulaire signalering en contractiele functie analyse.

Inleiding

Om een continue contractiele hartfunctie, moeten cardiomyocytes behouden een constante aanvoer van cellulaire energie voornamelijk in de vorm van ATP1. In het hart, wordt ongeveer 95% van ATP gegenereerd door mitochondriën, voornamelijk door middel van oxidatieve fosforylatie, waaruit blijkt dat de mitochondria een sleutelrol in de bio-energetische in hartfunctie2,3 spelen. Het ondersteunen van dit begrip is dat disregulatie van mitochondriale functie kan leiden tot cardiomyopathie en hartfalen4,5. Omgekeerd, herstel van mitochondriale functie is aangetoond dat verbetering van de hartfunctie van het falende hart6,7. Daarom, bestuderen van het mechanisme van de mitochondriale Bioenergetica en het identificeren van nieuwe toezichthouders van mitochondriale functie in cardiomyocytes mechanistische inzichten van cardiale energieproductie alleen niet zal onthullen maar ook kunnen inzicht geven die zal leiden aan de ontwikkeling van nieuwe therapeutische doelen voor de behandeling van hart-en vaatziekten6,8.

Vergeleken met het hele hart, waarin een mengsel van myocytes en niet-myocytes9, cardiomyocyte culturen zijn uiterst zuiver, met minimale besmetting van niet-myocytes vanuit het hart, zoals fibroblasten en endotheliale cellen10. Bovendien, isoleren van cardiomyocytes van neonatale pups kan kweken een groot aantal cellen in een kleine hoeveelheid tijd, in vergelijking met isolerende cellen van volwassen harten10,11. Bovenal primaire gekweekte volwassen muis cardiomyocytes hebben korte overleving tijden (bijv. 24 uur) en bij langere tijd punten-onderscheid maken. Neonatale muis cardiomyocytes kunnen overleven en voor meer dan 7 dagen in de cultuur, waardoor ze ideaal zijn voor het testen van de effecten van de drug compounds en genetische manipulatie op de functie van mitochondriën in cardiomyocytes10worden gemanipuleerd. Natuurlijk, er zijn aanzienlijke biologische verschillen tussen de volwassen en neonatale cellen, maar de langere duur die beschikbaar zijn voor cultuur van neonatale cellen maakt ze geschikt voor vele verschillende types van studies, met inbegrip van die van mitochondriale functie.

Tot op heden, zijn primaire gekweekte neonatale muis en rat cardiomyocytes gebruikt als modellen om te studeren cardiale Bioenergetica12,13. In de afgelopen jaren gebruikt studies een extracellulaire flux analyzer meten van zuurstof verbruik tarief (OCR) en evalueren van oxidatieve capaciteit in muis en rat neonatale cardiomyocytes14,15. Terwijl in vergelijking met ratten, de levensvatbaarheid van de cellen van de neonatale cardiomyocytes muis is lager en heeft grotere variabiliteit16. De mogelijkheid te bestuderen van cellen uit genetisch gemodificeerde Muismodellen maakt de mobiele muismodel ook, heel belangrijk. Gezien het feit dat OCR studies zo gevoelig zijn voor cel nummer en dichtheid te zaaien, is de ontwikkeling van een protocol reproduceerbaar, betrouwbare en eenvoudig te bereiken consistente cel opbrengst en levensvatbaarheid nodig.

Wij rapporteren hier een geoptimaliseerde protocol dat is ontwikkeld die gebruik maakt van de neonatale cardiomyocytes gekweekte muis samen met een 96-goed-formaat extracellulaire flux analyzer voor OCR analyse. Dit protocol verhoogt de reproduceerbaarheid van de test. Bovendien, het protocol biedt niet alleen een roman en reproduceerbare methode voor de analyse van de OCR, maar ook tot een grotere grootte cultuur zou kunnen worden aangepast voor andere experimentele doeleinden, zoals die die wellicht nodig zijn om te studeren van myofibrillar functies en intracellulaire Signaalroutes.

Met name beschrijft dit protocol een eendaagse procedure voor isolatie en cultuur van neonatale muis cardiomyocytes in een 96-Wells cel cultuur plaat. Bovendien, het wordt de procedure beschreven voor het meten van zuurstofverbruik met behulp van een extracellulaire flux-analyzer. Alle oplossingen gebruikt worden steriel of steriele gefilterd. Alle tools zijn gesteriliseerd door 75% ethanol. Wij bieden een Tabel van materialen voor diverse onderdelen van de procedure. Voor het kweken van cardiomyocytes, worden alle procedures en stappen uitgevoerd in een standaard cel cultuur kap. Dit protocol is ontwikkeld voor de isolatie van neonatale muis harten uit één nest (ongeveer 8-10 pups). Het protocol kan echter ook worden aangepast voor het isoleren van cardiomyocytes uit meerdere nesten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Voor werk met neonatale muizen, verwijzen naar lokale universiteit/Instituut richtsnoeren set weer door de dierenverzorgers programma's en zich houden aan iemands institutionele en andere verordeningen. Alle methoden die worden beschreven in dit protocol zijn goedgekeurd door de UC San Diego institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) en voldoen aan de federale en nationale regelgeving.

1. bereiding van reagentia

  1. Bereiden van 25 mL pre vergisting oplossing: HBSS (zonder Ca2 + en Mg2 +) aangevuld met trypsine (0,5 mg/mL). De oplossing om met een 0,22 µm filter steriliseren en houd op ijs tot gebruik. Pre vergisting oplossing maken op de dag van het experiment.
    Opmerking: Het is essentieel voor het gebruiken van HBSS zonder Ca2 + en Mg2 +, als Ca2 + en Mg2 + myocyte contractie en latere celdood tijdens isolatie zal veroorzaken.
  2. Bereiden van 30 mL collagenase spijsvertering buffer: collagenase (0,8 mg/mL, ongeveer 350 U/mL) opgelost in HBSS (zonder Ca2 + en Mg2 +) buffer. De oplossing om met een 0,22 µm filter steriliseren en houd op ijs tot gebruik. Maak collagenase spijsvertering oplossing op de dag van het experiment.
  3. 500 mL cardiomyocyte voedingsbodems (groei media)bereiden: Meng 375 mL DMEM, 125 mL M-199, 25 mL serum van paard en 12,5 mL FBS. Te vullen met 1% penicilline en streptomycine 1%-oplossing.
  4. Mitochondriale stress testmediumbereiden: Maak 200 mL van DMEM gebaseerd stress testmedium (DMEM zonder NaHCO3, Zie Tabel van materialen) aangevuld met natrium pyruvaat van 1 mM, 2 mM L-glutamine, en 10 mM glucose en 2 mM Hepes.
    Opmerking: 1 L medium met DMEM zonder natrium pyruvaat, L-glutamine, glucose en Hepes, filer steriele, maken en opslaan in 4 ° C. Bereid het testmedium van stress op de dag van de bepaling door de toevoeging van andere reagentia. Met behulp van DMEM is medium zonder NaHCO3 van cruciaal belang.
  5. Breng de pH van mitochondriale stresstest media aan 7.4 op de dag van gebruik. Warme media tot 37 ° C vóór gebruik.
  6. Oligomycinbereiden: bereiden van 5 mL van de stockoplossing van een 5 mM in DMSO, 250 µL aliquots maken en opslaan bij-20 ° C.
  7. FCCPbereiden: bereiden van 5 mL van de stockoplossing van een 5 mM in DMSO, 250 µL aliquots maken en opslaan bij-20 ° C.
  8. Antimycin Abereiden: bereiden van 5 mL van de stockoplossing van een 5 mM in DMSO, 250 µL aliquots maken en opslaan bij-20 ° C.
  9. Rotenonbereiden: bereiden van 5 mL van de stockoplossing van een 5 mM in DMSO, 250 µL aliquots maken en opslaan bij-20 ° C.
    Opmerking: Alle reagentia en oplossingen gebruikt in dit protocol zijn vermeld in tabel 1.

2. oogsten en pre vergisting van harten van neonatale muizen (dag 1)

  1. Autoclaaf schaar, pincet en een Moria lepel te steriliseren.
  2. Voer alle stappen in de cel cultuur kap voor steriliteit.
  3. Aliquot 5 mL HBSS (zonder Ca2 +, Mg2 +) aan elk putje van de plaat van een 6-well cel cultuur; plaats op het ijs. Aliquot 10 mL HBSS in een 10 cm schotel voor de cultuur van de cel.
  4. Bereiden 20 mL trypsine pre vergisting oplossing in een 50 mL steriele conische buis. Houd alle oplossingen op het ijs.
  5. Snel duik pasgeborene (dag 0) muizen in 70% ethanol oplossing voor sterilisatie.
  6. Decapitate pups met behulp van steriele schaar (recht) zonder verdoving, en open vervolgens de borst langs het borstbeen toegang te verlenen tot de borstholte en het hart. (Figuur 1A)
    Opmerking: 1) is het essentieel te gebruiken P0 neonatale muizen om de levensvatbaarheid van de hoge cellen. 2) deze methode euthanasie is toegestaan voor pasgeborenen overeenkomstig NIH en Amerikaanse veterinaire medische vereniging richtsnoeren 17.
  7. Harten uittreksel uit het lichaam met een goede schaar en overdracht onmiddellijk in de steriele cel cultuur schotel met HBSS (zonder Ca2 +, Mg2 +) (figuur 1B).
  8. Verwijder eventuele resterende longweefsel, grotere schepen, etc. (en atria, indien gewenst). Wassen harten in de HBSS oplossing met behulp van zachte agitatie.
  9. Elk hart met een fijne schaar in 8 stukken gesneden en breng het alle hartweefsel met een tang in een putje van een 6-well cel cultuur plaat met HBSS (Figuur 1 c en 1 D).
  10. Het wassen van het hart door de overdracht van de harten van goed tot goed in de 6-well plaat gevuld met HBSS, met behulp van een lepel Moria (Figuur 1 d).
    Opmerking: Overdracht van de harten van goed tot goed is genoeg om het bloed wassen. Aangezien bloed met enzymatische spijsvertering interfereert is het belangrijk te wassen de harten met HBSS en verwijderen van bloed.
  11. Pipetteer van het hart met een lepel Moria in een conische buis met 20 mL trypsine (0,5 mg/mL) en incubeer met zachte agitatie bij 4° C voor 4 h (figuur 1E).

3. het opstellen van een cultuur van de 96-wells-plaat (dag 1)

  1. Bereiden van 5 mL van de oplossing van de coating: PBS met 0,5% gelatine (autoclaaf vóór gebruik) en 1% fibronectine oplossing. (bijv. 5 mL gelatine oplossing plus 50 µL van fibronectine oplossing)
  2. Aliquot 50 µL van coating oplossing in elk putje van de 96-Wells cel cultuur plaat (Zie Tabel van materialen). Als bubbels aanwezig zijn, kunt u ze verwijderen met behulp van een pipet 20 µL te bellen uit te zuigen.
    Opmerking: Het is belangrijk ter dekking van de oppervlakte van elk putje met coating oplossing.
  3. Incubeer de plaat in een 37 ° C cel cultuur incubator voor 1 uur of meer te laten drogen van de coating van de matrix.
  4. Elke resterende coating oplossing vóór het zaaien van cardiomyocytes gecombineerd.

4. enzymatische spijsvertering en beplating van cellen (dag 1)

  1. Vooraf warm collagenase spijsvertering oplossing in een waterbad 37 ° C.
    Opmerking: Dit is stap is belangrijk voor het bereiken van efficiënte enzymatische spijsvertering.
  2. Verplaats de conische buis met harten en pre vergisting oplossing van 4 ° C voor een cel cultuur kap. (Figuur 1F)
  3. Laat de harten zinken naar de bodem van de buis en de pre vergisting oplossing verwijderen met behulp van serologische Pipetteer 10 mL (1 tot 2 mL van het medium van de isolatie kan blijven in de buis).
  4. Voeg 10 mL van HBSS in de buis. Resuspendeer de harten met HBSS 2 - 3 keer te wassen met behulp van serologische Pipetteer 10 mL trypsine. HBSS gecombineerd (1 tot 2 mL kan blijven in de buis).
  5. Voeg 10 mL van voorverwarmde collagenase spijsvertering oplossing in de buis met hart. (Figuur 1G)
  6. Incubeer de buis met hart in een waterbad 37 ° C gedurende 10 minuten zonder agitatie (1ste spijsvertering).
  7. Na 1e spijsvertering, door de buis naar de cel cultuur kap te verplaatsen. Zachtjes triturate harten door opnieuw de schorsing van het hart in de buis zachtjes 10 keer met behulp van serologische Pipetteer 10 mL. Hierdoor zal harten te verspreiden en cellen die moeten worden vrijgesteld van hartweefsel. (Figuur 1 H)
    Opmerking: Aangezien cardiomyocytes kwetsbaar zijn, is zachte verpulvering belangrijk om te bereiken hoog levensvatbaarheid.
  8. Laat het onverteerd weefsel zinken, breng verteerd oplossing verrijkt in cardiomyocytes (ongeveer 9-10 mL) aan een nieuwe conische buis en onmiddellijk toevoegen een gelijke hoeveelheid van cel cultuur media om te stoppen met de vertering van collagenase.
  9. Voeg 10 mL van collagenase spijsvertering oplossing in de buis met de resterende onverteerd hartweefsel.
  10. Incubeer de buis met hartweefsel van het in een waterbad 37 ° C gedurende 10 minuten (2de spijsvertering).
  11. Herhaal de procedure 4.7 en 4.8.
    Opmerking: Als er nog steeds veel onverteerd weefsel, spijsvertering nog een keer herhalen In de meeste gevallen zijn twee spijsvertering echter genoeg om te dispergeren allermeest naar de cellen van het hartweefsel.
  12. Plaats een steriele cel-zeef (100 µm nylon gaas) in een nieuwe steriele 50 mL conische buis. Vooraf nat de cel zeef met 2-3 mL cel cultuurmedia en doorgeven van cellen door de cel-zeef. Spoel de cel-zeef met 2-3 mL cel voedingsbodems. (Figuur 1I)
  13. Centrifugeer conische buis met cardiomyocytes gedurende 5 min. op 180 x g (figuur 1J). Gecombineerd het supernatant (Figuur 1 K), die zal bevatten cel weefsel puin en resuspendeer de pellet cel in cel voedingsbodems (Figuur 1 L) 10 mL.
  14. Zachtjes resuspendeer de cellen en de plaat cellen op een 10 cm cel cultuur schotel (kunststof zonder enige vorm van coating) en incubeer gedurende 1 uur in een cel cultuur incubator (1e pre beplating) (Figuur 1 M). Deze pre plating stap staat niet-cardiomyocytes, zoals fibroblasten en endotheliale cellen, zich te houden aan de schotel niet gestreken cel-cultuur.
    Opmerking: Op dit punt cardiomyocytes zijn doorgaans een ronde vorm en verschijnen glanzende onder de Microscoop. (Figuur 1N).
  15. Na de incubatie 1 h zachtjes doorroeren van de plaat, niet-aanhanger cellen (verrijkt in cardiomyocytes) uit de 10 cm cultuur schotel wassen en resuspendeer de cellen door herhaaldelijk pipetteren het kweekmedium cel over de schotel met behulp van serologische Pipetteer 10 mL. Vervolgens breng niet-aanhanger cellen (verrijkt in cardiomyocytes) in een nieuwe 10 cm cel cultuur schotel (kunststof zonder enige coating) en incubeer gedurende een extra 1 uur in een cel cultuur incubator (2e pre beplating).
    Opmerking: Cellen die aan de niet-gecoate plaat hechten zijn dominant niet-cardiomyocytes: fibroblasten en endotheliale cellen, die onder een microscoop (figuur 1O) kunnen worden gevisualiseerd.
  16. Na 2e pre beplating, zachtjes doorroeren van de plaat, wassen niet-aanhanger cellen (cardiomyocytes) uit de 10 cm cultuur schotel en breng de cardiomyocytes in een nieuwe conische tube van 50 mL.

5. tellen cellen en Plating cellen in een cel van de 96-Wells cultuur plaat (dag 1)

  1. Met behulp van een hemocytometer cellen tellen.
  2. Plaat van de cellen in een extracellulaire matrix gecoat 96-Wells cel cultuur plaat duikt met een dichtheid tussen 10-30 x 103 cellen per putje met behulp van een pipet meerkanaals in een eindvolume van 200 µL (Figuur 1 P). Wells A1, A12, H1 en H12 gebruiken voor achtergrond: 200 µL cultuurmedium toevoegen als andere putten in deze putten (geen cellen). Incubeer de plaat in een 37 ° C incubator voor de cultuur van de cel.
    Opmerking: In deze studie, werd zuurstofverbruik getest met behulp van verschillende cel dichtheden zoals 10 x 10320 x 10-3en 30 x 103 cellen per putje. (Figuur 2A). Ook, zoals hierboven, cardiomyocytes onmiddellijk na isolatie zijn doorgaans een ronde vorm en verschijnen glanzende onder de Microscoop. Levensvatbare cellen zal afvlakken uit binnen 16-24 uur van cultuur.

6. zuurstof verbruik Assay met behulp van een 96-goed-formaat extracellulaire Flux Analyzer (dag 2)

Opmerking: Zuurstof verbruik bepaling kan worden uitgevoerd in één dag na de cellen plating of hoger. Neonatale cardiomyocytes gekweekt met behulp van dit protocol tot 7 dagen kan overleven post isolatie.

  1. Hydrateer een flux analyzer sensor cartridge (Zie Tabel van materialen) gedurende ten minste 3 uur, maar ideaal voor een volledige dag, voor de bepaling. Voeg 200 µL van kalibrant oplossing (Zie Tabel van materialen) in de elk putje van de plaat utility, zet de sensor cartridge terug op het bord van nut, en broeden in een incubator 37 ° C zonder CO2 of O2 suppletie.
  2. Wijzigen in cel voedingsbodems mitochondriën stresstest gemiddeld één uur voorafgaand aan de test. Cardiomyocytes zijn kwetsbaar. Daarom voorzichtig de voedingsbodems cel verwijderen door met behulp van een precisiepipet multi-kanaals en wassen van de cellen met 200 µL voorverwarmde mitochondriale stresstest media tweemaal. Na tweede wash, voeg 175 µL voorverwarmde mitochondriën stress test media en cultuur van de cellen in een incubator 37 ° C zonder CO2 of O2 suppletie.
  3. Geconcentreerde test verbindingen voor te bereiden. Voorbereiden voor stresstest mitochondriën, 3,0 mL elke 16 µM oligomycin, 9 µM FCCP en een mengsel van 20 µM rotenon en 20 µM antimycin A, alle in mitochondriale stress testmedium.
    Opmerking: Elke verbinding in de concentratie beschreven is getest. Titrating van de concentratie van elke stof in iemands eigen laboratorium is echter noodzakelijk.
  4. 25 µL van elke stof in de havens van de injector van de patroon van de sensor met een meerkanaalspipet (figuur 1T) laden. Het volume en de eindconcentratie worden beschreven in tabel 2.
  5. Extracellulaire flux assay protocol instellen. Het programma wordt beschreven tabel 3.
  6. Start het programma. Eerst, zet de sensor-cartridge in de machine voor kalibratie (figuur 1R). Vervang de kalibrant voor de plaat assay zodra de kalibratie stap is gedaan.
    Opmerking: Met behulp van de software die wordt geleverd door fabrikant, geven groepen van putten en elke compound en poort.
  7. Indien gewenst, na de assay, zorgvuldig negeren alle assay medium door met behulp van een precisiepipet meerkanaals en opslaan van de cel cultuur microplate bij-20 ° C voor toekomstige cel normalisatie met behulp van eiwit bepaling.
  8. Gehalte aan andere melkeiwitten meten. Voeg 50 µL van RIPA cellysis van de standaardoplossing (Zie Tabel van materialen). Incubeer de plaat op het ijs gedurende 30 minuten volledig lyse cellen. Alle materiaal overbrengen in een nieuwe duidelijk platte 96 goed assay bodemplaat.
  9. Meten eiwitconcentratie door BCA assay volgens protocol van de fabrikant.
    Opmerking: De put met de extracellulaire matrix coating resulteert in een eiwitrijk-concentratie in elk putje. Daarom afgetrokken het bedrag van de well(s) (geen cellen) van de achtergrond te krijgen van de werkelijke cel eiwitconcentratie. De eiwitconcentratie afgeleid van cellen is laag in een cultuur van de 96-wells-plaat. Bovendien kan de eiwitconcentratie variëren van goed-te-goed als gevolg van de extracellulaire matrix coating. Daarom is met behulp van mobiele nummer te normaliseren van de OCR aanbevolen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Met behulp van het protocol beschreven, werden harten geïsoleerd van de neonatale pups dag 0. 5 x 105 cellen/pup zijn verkregen, en cardiomyocytes waren agarvoedingsbodem op dichtheid van 10 x 10,3, 20 x 103of 30 x 103 cellen/well, in 96 goed platen (figuur 2A). Na overnachting cultuur, cardiomyocytes bleken goed verbonden met het plastic gecoate oppervlak en er waren weinig niet-vastgemaakte cellen (de niet-vastgem...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In deze studie hebben we een eenvoudig protocol om te isoleren en kweken van muis neonatale cardiomyocytes opgericht. Met behulp van deze cardiomyocytes, we ook de voorwaarden voor het meten van zuurstof verbruik tarief met behulp van een systeem van extracellulaire flux analyzer geoptimaliseerd. Het protocol maakt het mogelijk om het gebruik van muis neonatale cardiomyocytes als een modelsysteem om te onderzoeken hoe verschillende factoren zuurstofverbruik in de belangrijkste werkende cellen van het hart, verwant aan wa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

We zouden graag bedanken alle Ross lab en Murphy lab leden. Dit werk wordt ondersteund door de American Heart Association (14SDG17790005) Y.C. NIH (HL115933, HL127806) en VA verdienste (BX003260) aan R.S.R.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Antimycine ASIGMAA8674Remt complex III van de mitochondriën
Cel zeef 100 μm poriënFALCON352360Om onverteerd weefsel op te vangen
Collagenase type IIWorthingtonLS004176Om collagenase-verteringsoplossing te maken
D-GlucoseSIGMA75351Om mitochondriale stresstestmedium te maken
DMEM met hoge glucoseLife technologies11965-092Om celkweekmedium te maken
DMEM zonder NaHCO3, Glucose, pyruvaat, glumanine en HepesSIGMAD5030-10X1LOm mitochondriale stresstestmedium te maken
FCCP (Carbonylcyanide 4-(trifluormethoxy)fenylhydrazon)SIGMAC2920Ontkoppelt mitochondriale ademhaling
Foetaal runder serum (FBS)Life technologies26140-079Om celkweekmedium te maken
Fibronectine uit runderplasmaSIGMAF1141-5MGOm coatingoplossing voor weefselkweekplaten te maken
Fijne schaarFine Sciences Tools14060-10Voor dissectie van harten
Gelatine uit varkenshuidSIGMAG-1890Om coatingoplossing voor weefselkweekplaten te maken
HBSS (Hanks' balanced salt solution, zonder Ca2+, Mg2+)Cellgro21-022-CVOm harten te wassen en oplossing voor pre-vertering en collagenase-vertering te maken
HEPES (1 M)Fisher scientific15630080Om mitochondriale stresstestmedium te maken
Paarden serumLife technologies26050-088Om celkweekmedium te maken
L-GlutamineSIGMAG-3126Om mitochondriale stresstestmedium te maken
M-199Cellgro10-060-CVOm celkweekmedium te maken
Moria lepelFisher scientificNC9190356Om harten te wassen
OligomycineSIGMA75351-5MGRemt mitochondriale ATP-synthase
RIPA bufferFisher scientific89900Om de cellen te lyseren voor eiwitanalyse
RotenoneSIGMAR8875Remt complex I van de mitochondriën
Seahorse XFe96 Extracellulaire Flux
Analyzer		AgilentApparaat gebruikt om de zuurstofconsumptiesnelheid te analyseren
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent102601-100Pakket met fluxanalysator kweekplaten, sensorcartridges en calibratiemiddel
NatriumpyruvaatSIGMAP2256Om mitochondriale stresstestmedium te maken
Rechte schaarFine Sciences Tools91401-12Voor dissectie van harten
Spuitfilter 0,2 μm grootteVoor steriele filtratie van verdunningsmedium
TrypsineUSB Corporation22715 25GMOm oplossing voor pre-vertering te maken

Referenties

  1. Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
  2. Wang, K., et al. Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms. Free Radical Research. , 1-10 (2018).
  3. Kolwicz, S. C. Jr, Purohit, S., Tian, R. Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes. Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).
  4. Rosca, M. G., Hoppel, C. L. Mitochondrial dysfunction in heart failure. Heart Failure Reviews. 18 (5), 607-622 (2013).
  5. Wai, T., et al. Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice. Science. 350 (6265), aad0116(2015).
  6. Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. Mitochondria as a therapeutic target in heart failure. Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).
  7. Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury. Frontiers in Physiology. 2, 13(2011).
  8. Brown, D. A., et al. Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure. Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).
  9. Zhou, P., Pu, W. T. Recounting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 368-370 (2016).
  10. Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. Cardiomyocyte culture - an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).
  11. Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).
  12. Gibbs, C. L., Loiselle, D. S. Cardiac basal metabolism. Japanese Journal of Physiology. 51 (4), 399-426 (2001).
  13. Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses. PLoS One. 11 (2), e0149002(2016).
  14. Neary, M. T., et al. Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).
  15. Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal. Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).
  16. Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).
  17. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013).
  18. Manso, A. M., et al. Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload. Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).
  19. Wang, G. W., Kang, Y. J. Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).
  20. Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
  21. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), e21746(2011).
  22. Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation. Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).
  23. Sharp, W. W., et al. Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission. FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).
  24. Tigchelaar, W., et al. Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).
  25. Graham, B. H., et al. A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator. Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).
  26. Zhao, Y. Y., et al. Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).
  27. Vander Heiden, M. G., et al. Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism. Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).
  28. Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium. Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).
  29. Wang, R., et al. The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function. Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).
  30. Dai, D. F., et al. Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria. Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).
  31. Ritterhoff, J., Tian, R. Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters. Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).
  32. Uosaki, H., Taguchi, Y. H. Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Mitochondriale respiratiecelisolatie96 wellplaatcollagenaasdigestietellen met hemocytometermitochondriale stresstestFCCP ontkoppelaar

Gerelateerde artikelen