Methodenartikel

Toepassing van geavanceerde In Vitro kweken van technologie om te bestuderen van de menselijke darmflora

DOI:

10.3791/59054

⸱

15 februari 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Dairy and Functional Foods Research Unit, Eastern Regional Research Center, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 2ProDigest, 3Division of Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition, Children's Hospital of Philadelphia

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol voor het kweken van de darmflora van de dikke darm in vitro, met behulp van een reeks van bioreactoren die de fysiologische omstandigheden van de gastro-intestinale tractus simuleren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De menselijke darmflora speelt een vitale rol in zowel de menselijke gezondheid en ziekte. Het bestuderen van de darmflora met behulp van een in vivo -model, is moeilijk vanwege de complexe aard, en haar gevarieerd connectie met zoogdieren onderdelen. Het doel van dit protocol is om de cultuur van de darmflora in vitro, die het mogelijk voor de studie van de gut microbiota dynamiek, maakt zonder te hoeven nadenken over de bijdrage van de zoogdieren milieu. Met behulp van in vitro kweken van technologie, worden de fysiologische omstandigheden van de gastro-intestinale tractus gesimuleerd, met inbegrip van parameters zoals pH, temperatuur, anaerobiosis en transittijd. De intestinale oppervlak van de dikke darm wordt gesimuleerd door toevoegen van mucin beklede vervoerders, maken een mucosal fase, en het toevoegen van extra dimensie. De darmflora is geïntroduceerd door het enten met de menselijke fecaal materiaal. Na inoculatie met dit complexe mengsel van bacteriën, specifieke microben zijn verrijkt met de verschillende longitudinale (oplopend, dwars- en aflopende dubbele punten) en transversale (luminal en mucosale) omgevingen van het in vitro model. Het is cruciaal om het systeem te bereiken van een stabiele toestand, waarin de Gemeenschap en de geproduceerde metabolieten stabiel blijven. De experimentele resultaten in dit manuscript aantonen hoe de geënte gut microbiota Gemeenschap zich ontwikkelt tot een stabiele Gemeenschap na verloop van tijd. Zodra stationaire toestand is bereikt, kan het systeem worden gebruikt om bacteriële interacties en gemeenschap functies te analyseren of om te testen van de gevolgen van eventuele toevoegingen voor de darmflora, zoals eten, voedingsbestanddelen of farmaceutische producten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De darmflora is een Gemeenschap van micro-organismen die zich in de menselijke maag-darmkanaal (GIT bevinden).  Deze Gemeenschap bereikt maximale concentratie in de dikke darm, die wordt geschat op 10-10-14 13bacteriën, uit 500-1.000 soorten, die in symbiose met de dikke darm milieu1,2 levente houden. De samenstelling en de functionaliteit van de darmflora veranderen ruimtelijk langs het GIT, vorming van regio specifieke communities, met de meeste diversiteit distally2,3,4,5. Voor iedere anatomische regio, aparte microbiële gemeenschappen bevinden zich in het lumen en over de mucosal voering6. De lumen-Gemeenschap heeft meer directe toegang tot voedingsstoffen zoals substraten de luminal compartiment-7 doorlopen. Ondanks dit, bevinden sommige bacteriën zich bij voorkeur in de laag van slijm, gebruik makend van de mucin geproduceerd door de cellen van de dikke darm als een energie bron1,5,8. Het verschil in microenvironments tussen de luminal en mucosale fasen leidt tot divergentie- en de ontwikkeling van fase specifieke communities. Deze gemeenschappen bieden samen metabole functies, zoals nutriënten metabolisme en de productie van vitaminen, en immunologische functies, zoals het voorkomen van de kolonisatie van menselijke pathogenen1,3, 9. de darmflora werkt ook functioneel in conjugatie met de menselijke Colón cellen3.

Als een belangrijk onderdeel van de menselijke GIT is het niet verwonderlijk dat de darmflora is bekend bij te dragen aan beide host gezondheid en ziekte status3,9,10,11,12. Een verschuiving in de darm microbiële populatie is gekoppeld aan meerdere ziekten bij de mens, met inbegrip van GIT stoornissen zoals intestinale bowel disease (IBD) en intestinale darmsyndroom (IBS), maar ook andere ziekten, zoals zwaarlijvigheid, bloedsomloop ziekte en autisme 3 , 9 , 10 , 11 , 12. metabolieten geproduceerd uit de darmflora hebben een globaal effect, locaties ver van de darm12,13te bereiken. De gut-brain-as is bijvoorbeeld gekoppeld aan mentale stoornissen, zoals angst en depressie14. Dus, het bestuderen van de darmflora is belangrijk voor meerdere velden van onderzoek, en is van toepassing op vele ziekten, zelfs degenen die niet vaak geassocieerd met het GIT.

Terwijl het wordt algemeen erkend dat het bestuderen van de darmflora belangrijk is, is het een ingewikkeld inspanning. Meerdere dierlijke modellen zijn beschikbaar, van kleine dieren zoals zebrafish, ratten en muizen, naar grotere schijven als apen en varkens15-19. Echter, de toepassing van deze dieren in termen van de menselijke darmflora is niet eenvoudig, aangezien deze dieren hebben een unieke bacteriële-Gemeenschap die geëvolueerd gebaseerd op milieu en voeding, en ze zijn anatomisch onderscheiden van mensen20 , 21. het gebruik van menselijke proefpersonen Hiermee verwijdert u de vraag van belang nog introduceert een andere set van uitdagingen. Menselijke studies zijn duur, tijdrovend, en ethisch beperkte11. Bovendien, storende factoren beïnvloeden de darmflora in menselijke studies, met inbegrip van leeftijd of ontwikkelingsstadium, milieu, voeding, medicatie en genetische factoren2,4,22.  Er zijn ook beperkingen op wat kan worden getest bij de mens, en welk type van monsters kan worden geoogst op welke tijden4.

Een kritische nadeel van het gebruik van een in vivo systeem te bestuderen van de darmflora is de aanwezigheid van zoogdieren onderdelen. De darmflora en menselijke cellen communiceren met elkaar, en in een in vivo instelt, is het onmogelijk om te onderscheiden van de twee. De metabolieten geproduceerd door de darmflora worden genomen door de cellen van de dikke darm, zodat de metingen kunnen niet worden berekend met precisie. Daarom moet een mechanistisch onderzoek worden beperkt tot eindpunt metingen11. Een ander groot nadeel voor in vivo onderzoek is het onvermogen om te oogsten van monsters van de verschillende regio's van het GIT lengterichting23. Dit staat niet toe voor de beoordeling van veranderingen die na verloop van tijd12in de microenvironments van de dikke darm kunnen optreden.  Veel in vivo studies, met inbegrip van menselijke studies, vertrouwen op analyse van fecale monsters om wijzigingen aan de gut microbiota12te herkennen. Terwijl dit informatief is, het biedt geen gegevens op de darmflora over de GIT en maakt geen onderscheid tussen de luminal en mucosale gemeenschappen5,6,7,8.

Voor de darmflora moet de toepassing van een in vitro studie van de dynamiek van de bacteriële Gemeenschap, zonder inmenging van de zoogdieren componenten. Met behulp van een in vitro -methode zorgt voor de strakke controle van milieuomstandigheden10, testen van meerdere parameters tegelijk, en de mogelijkheid om te proeven overlangs, en met grote volumes11. Aangezien een in vitro methode maakt gebruik van een mechanisch apparaat en niet een host, zijn geen overwegingen nodig voor leeftijd, milieu, voeding of genetische achtergrond. Deze systemen kunnen worden gebruikt om te testen of de gehele gut microbiota Gemeenschap, alleen geselecteerde organismen, of zelfs enkele stammen. Nog belangrijker is, in vitro resultaten reproduceerbaar zijn, toch behouden een mate van diversiteit vergelijkbaar met in vivo onderzoek11,22.

Afhankelijk van de hypothese in kwestie en de gewenste resultaten, ikn vitro studies kunnen op verschillende manieren worden uitgevoerd.  Zij kunnen gebruik maken van single-schip systemen en eenvoudige methoden, zoals de incubatie van monsters met fecale homogenaat24 of het uitvoeren van één partij culturen in de loop van de 24-48 h25. Ze kunnen ook worden bereikt met behulp van één-schip systemen en complexere methoden, zoals het gebruik van een chemostat-systeem voor de productie van een stabiele gut microbiële Gemeenschap11. Echter kan het gebruik van een interne reactor overdreven vereenvoudigen de microbiota12 omdat het vertegenwoordigt slechts een deel van de dikke darm, hoewel de dikke darm uit de oplopende, transversale en aflopende regio's bestaat.

Om te kunnen studeren de gut microbiota Gemeenschap dat zich in de verschillende regio's van de dikke darm (de oplopende, aflopende en transversale gebieden ontwikkelt), kan een complex, meerdere fasen systeem worden gebruikt. In deze systemen, worden meerdere schepen ingesteld om na te bootsen van de verschillende regio's van de dikke darm, zodat de darmflora van de oplopende, transversale en aflopende regio's worden geteeld onafhankelijk. Deze vaartuigen zijn verbonden, met behulp van de pompen te verplaatsen van substraten in volgorde, van de oplopend in de dwarse aan de dalende dikke darm-regio's, het nabootsen van de stroom van voedingsstoffen door het GIT.

Het doel van deze studie was om aan te tonen hoe een 5-traps in-vitro cultuur-systeem (Zie Tabel van materialen) kan worden gebruikt om te cultiveren de gut microbiota Gemeenschap, en om aan te tonen van de communautaire dynamiek in termen van stabiliteit en samenstelling. In dit systeem, één vaartuig vertegenwoordigt de maag en een vertegenwoordigen de dunne darm. De dikke darm is onderverdeeld in drie regio's (oplopend, dwarse, aflopend), met één bak elke regio26vertegenwoordigen. In deze experimentele opzet, twee complete systemen werden parallel lopen, met eenheid 1 de mucosal oppervlakte en eenheid 2 met geen mucin vervoerders bevattende mucin luchtvaartmaatschappijen vertegenwoordigt. De Gemeenschappen die in de luminal en mucosale fasen van elke regio ontwikkeld werden vergeleken aan elkaar en aan de fecale entmateriaal na verloop van tijd met behulp van het 16S rRNA gen sequencing en SCFA analyse. De resultaten tonen het soort Gemeenschap, zowel in termen van samenstelling en functionaliteit, die kan worden geproduceerd uit dit soort in vitro systeem.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. stoffen en preparaten

Opmerking: Het beschreven medium wordt gekocht als een poeder (Zie Tabel van materialen). De samenstelling van het beschreven medium in g/L is de volgende: Arabinogalactan (1.2), pectine (2.0), Xylaan (0.5), Glucose (0.4), gistextract (3.0), speciale pepton (1.0), Mucin (2.0), L-cysteïne-HCl (0.2).

  1. Voorbereiden van de beschreven medium
    1. Vul een 4 L-kolf met 2 L dubbel gedestilleerd, gedeïoniseerd water.
    2. 29.2 g gedefinieerde middellange poeder toevoegen aan het water en meng eenheid volledig gehomogeniseerd.
    3. Voeg een magneetroerder en losjes schroef op de deksel.
    4. Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 30 minuten.
    5. Na afkoeling de bereid beschreven medium worden opgeslagen in een koelkast bij 4 ° C, met constante agitatie (magneetroerder).
  2. Bereiden van pancreassap
    1. Autoclaaf 2L gedestilleerd, gedeïoniseerd water in de ketel van een 5L met een roerder bar toegevoegd, bij 121 ° C gedurende 30 minuten.
    2. Daarna autoclaaf, maken het water afkoelen tot kamertemperatuur.
    3. 12,5 g NaHCO3, 6 g gal en 0.9 g Pancreatine toevoegen. Plaats op de magneetroerder te mengen.
      Opmerking: Het Pancreassap moet vers bereid elke 2-3 dagen en gekoeld met agitatie na het maakte.
  3. Fosfaatbuffer
    1. Plaats een maatkolf van 1 L met een magneetroerder bar op een magneetroerder. 0.5 L gedestilleerd, gedeïoniseerd water toevoegen en inschakelen van agitatie.
    2. Voeg vervolgens 6,8 g KH2PO4, 8.8 g K2HPO4en 0,1 g natrium thioglycolaat. Top af met water tot een eindvolume van 1 L.
    3. Nadat de onderdelen zijn volledig is opgelost, breng de pH op 7.0 gebruik van NaOH.
    4. Giet de buffer in een 2 L ketel met een schroefdop deksel en autoclaaf bij 121 ° C gedurende 30 min. Zorg ervoor dat het deksel is geschroefd op losjes en niet goed gesloten.
    5. Na het verwijderen van de autoclaaf, laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur. Bewaar de buffer bij kamertemperatuur voor tot 2 weken.
  4. Bereiden Mucin agar dragers
    1. Autoclaaf kunststof mucin dragers (Zie Tabel of Materials), pincet, netwave (tubulaire vorm) en treksluiters bij 131 ° C gedurende 30 minuten.
    2. Autoclaaf 300 mL dubbel gedistilleerd, -geïoniseerd water bij 131 ° C gedurende 30 min. winkel bij kamertemperatuur tot gebruik.
    3. Vul in een kabinet met de laminaire flow bioveiligheid, steriele petrischalen met de vervoerders van de kunststof mucin steriel pincet gebruiken.
      Opmerking: De mucin dragers zijn hol kunststof cirkels die zijn gevuld met mucin agar. Eenmaal gevuld, het deksel kan worden geplaatst op de top, en deze kunnen worden gereserveerd.
    4. Voeg 3 g van bacteriële agar en 15 g van varkens mucin aan de 300 mL gesteriliseerde met autoclaaf water om te bereiden mucin agar.
    5. In een zuurkast, kook deze oplossing, verwijder vervolgens van de warmtebron en laat afkoelen voor 1 min. Herhaal het kook en koeling voor een totaal van 3 keer.
    6. Zodra het schip van de glazen met de mucin agar oplossing is koel genoeg om te raken, verplaatsen naar de bioveiligheid kast met laminaire stroming.
    7. Giet het vloeibare mucin agar over de kunststof mucin dragers die werden geplaatst in de petrischaal in de kast met de laminaire flow bioveiligheid. Zorg ervoor dat alle vervoerders volledig zijn gevuld met mucin agar.
    8. Plaats het deksel terug op de petrischaal en laat ze afkoelen onder laminaire flow.
    9. Monteren van de mucin dragers, nemen de gesteriliseerde met autoclaaf kunststof verrekening en invoegen van mucin dragers met het gestolde mucin agar van de petrischaal met steriel pincet.
    10. Treksluiters gebruiken om af te sluiten van de uiteinden van de Maas. Op deze manier de netto functies te bevatten van de mucin vervoerders gevuld met mucin agar. Bewaren bij 4 ° C tot gebruik.

2. instellen, inenting, en het functioneren van het systeem

  1. Het instellen van het kweken systeem
    Opmerking:     de Twin-Simulator van het menselijke intestinale microbiële ecosysteem werd gebruikt voor deze studie.
    1. 10 bioreactoren met roerder bars op Magneetroerders plaatsen en inschakelen van agitatie.
      Opmerking: Elke eenheid bestaat uit 5 bioreactoren, dus 2 eenheden 10 bioreactoren vergt.
    2. Verbinden met 5 bioreactoren elkaar met behulp van silicium buis in volgorde door middel van de peristaltische pomp (Figuur 1). Gebruik de pompen aan dwarse de vloeibare inhoud van een bioreactor naar de volgende.
    3. Label de bioreactoren in de volgende volgorde: maag, dunne darm, opgaande dikke darm, transverse colon, aflopend van de dikke darm te vertegenwoordigen de volgorde van het maag-darmkanaal.
      Opmerking: De bioreactoren kunnen alle identieke, of de maag en dunne darm bioreactoren kunnen worden kleiner in vergelijking met de dikke darm bioreactoren aangezien ze minder volume zal houden. Instellen van de bioreactoren op deze manier betekent dat de opgaande dikke darm regio voedingsstoffen uit de dunne darm ontvangt, de transverse colon regio voedingsstoffen uit de oplopende regio van de dikke darm ontvangt en de dalende dikke darm regio ontvangt nutriënten uit de transversale regio. Op deze manier, het systeem is het nabootsen van de sequentiële verkeer van voedingsstoffen via het maag-darmkanaal.
    4. Plaats de beschreven medium en Pancreassap in een koelkast bij 4 ° C met constante agitatie Magneetroerders gebruiken. Met siliconen slang, sluit het beschreven medium aan de maag bioreactor via een peristaltische pomp en het Pancreassap aan de dunne darm via een peristaltische pomp.
    5. Stollen-agent toevoegen aan een urine afvoer tas. De dalende dikke darm verbinden met de urine afvoer zak door middel van de peristaltische pomp. Beschikken over de gestolde als biologisch afval tijdens het experiment.
    6. Met behulp van Siliconen slang, sluit de water jas voor elk vaartuig in volgorde en sluit elk uiteinde aan het circulerende waterbad. Het circulerende waterbad vullen met gedestilleerd water (dit bedrag is afhankelijk van het type van de circulerende waterbad gebruikt) en ingesteld op 37 ° C.
    7. Met behulp van Siliconen slang, het zuur en de base verbinding te maken met het deksel van elk vaartuig dat door middel van peristaltische pompen. De aanbevolen concentraties zijn 0.5 M HCl en 0,5 M NaOH.
    8. De pH-sondes voor elk vaartuig via de aangewezen haven invoegen in het deksel. Deze poort is ontworpen om te houden van de sonde van de pH en de schroef in het deksel (Figuur 1). De pH-waarde voor elke regio als volgt instellen: maag, pH = 2; Dunne darm, pH = 6,7-6,9; Opgaande dikke darm, pH = 5.6-5,9; Transverse colon, pH = 6.15-6.4; Dalende dikke darm, pH = 6,6-6,9.
      Opmerking: Tijdens de eerste fase, de Gemeenschap zal een onderscheid maken op basis van het verschil in regio pH-waarden. Echter, zodra de voeding cycli begint, de Gemeenschappen zal verder vervallen op basis van de verschillen in nutriënten input.
    9. Sluit een stikstof-lijn met behulp van silicium buis om het deksel van elk vaartuig met behulp van de aangewezen haven. De lijn van de stikstof moet stromen in de volgende volgorde: maag, dunne darm, opgaande dikke darm, transverse colon, colon aflopend. Zorgen voor dat elke unit heeft een eigen flush te voorkomen van kruisbesmetting.
      Opmerking: Stikstof wordt uit het systeem verwijderd zuurstof en onderhoudt anaerobiosis tijdens het experiment.
    10. Invoegen van een metalen monsterbuisje door het deksel van elke bioreactor met behulp van de aangewezen haven. De metalen buis doorloopt naar beneden in de bioreactor en vloeistof monsters te verzamelen wordt gebruikt.
    11. Een klein stukje silicium buis aan de bovenkant van het monsterbuisje toevoegen en sluit een Luer-Lock te voorzien in het gebruik van een spuit gedurende de bemonstering.
  2. Inoculatie van het systeem
    1. Vul de dubbelpunt regio's met het beschreven medium met behulp van de volgende volumes: 500 mL in de oplopende dikke darm, 800 mL in de transverse colon en 600 mL in de dalende dikke darm.
    2. Mucin agar vervoerders toevoegen aan de dikke darm-regio's, in een bedrag evenredig aan de omvang van de reactor. Voor dit experiment, werden 60 luchtvaartmaatschappijen per reactor gebruikt.
    3. Verwijder alle overtollige beschreven medium met behulp van het monsterbuisje en een spuit, aangezien het toevoegen van de vervoerders het niveau van de vloeistof in de bioreactor verhoogt.
    4. De pH-sondes aan te passen van de pH in elke reactor met behulp van de computer inschakelen.
    5. Inschakelen van de stikstof-flush voor 20 min.
      Opmerking: De fecale homogenaat gebruikt voor inenting wordt gekocht als 10% ontlasting gehomogeniseerd in 10% glycerol-oplossing (Zie Tabel van materialen). De fecale monster willekeurig uit een pool van donors met de volgende criteria geselecteerd: An American consumeren een typische westerse dieet (niet veganistisch of vegetarisch), tussen 21-45 jaar, antibiotica gratis gedurende ten minste 1 jaar, met een gemiddelde Body Mass Index (18,5-24,9) . Voor dit protocol, wordt slechts een enkele donor gebruikt. Dit kan echter worden gewijzigd als gevolg van de proefopzet.
    6. Voordat de inenting, Ontdooi de fecale homogenaat volgens de richtlijnen van de fabrikant.
    7. Inoculeer elke reactor van de dikke darm door toevoeging van de fecale homogenaat in een bedrag dat gelijk is aan 5% van het volume van de reactor via de poort van de steekproef, met behulp van een injectiespuit 60 mL (25 mL voor de oplopende dikke darm, 40 mL voor de transverse colon, 30 mL voor de dalende dikke darm).
    8. Het groeien van de culturen in de bioreactoren overnachting met pH-control.
    9. Na de overnachting groei, de oogst monsters van de luminal vloeistof uit elke regio van de dikke darm zoals hieronder beschreven in punt 3. Nadat bemonstering is voltooid, schakelt u op het computerprogramma om te beginnen met het voederen.
  3. Dagelijks feeding cycli
    Opmerking:     de dagelijkse voeding cycli zijn computer geautomatiseerd.
    1. Drie keer per dag, 140 mL van het beschreven medium pompen in de maag bioreactor en mogen Incubeer gedurende 1 uur.
    2. Pomp na een incubatieperiode van 1 h, de inhoud van de maag in de dunne darm. Op hetzelfde moment, pomp 60 mL Pancreassap naar de dunne darm.
    3. In de dunne darm, pH-waarde tot pH 6.7-6,9, inschakelen en laat mengsel Incubeer gedurende 90 minuten. Inschakelen tijdens de incubatie, de stikstof-flush voor elk systeem voor een totaal van 10 minuten elk.
    4. Na de incubatie 90 min inschakelen de pompen uit de dunne darm aan de opgaande dikke darm, de oplopende dubbele punt de transverse colon, de transverse colon naar de dalende dikke darm, en de dalende dikke darm aan het afval tegelijk.
  4. Experimentele tijdlijn
    Opmerking:     de in vitro systeem hier gebruikt wordt bediend op een continue wijze voor ongeveer 8 weken lang. Hieronder vindt u een aanbevolen experimentele tijdlijn, echter dit kan worden aangepast afhankelijk van de vereisten en de doelstelling van het experiment.
    1. Volgende stappen vermeld in stap 2.1 systeem opgezet.
    2. De monsters van de oogst van overnachting groei volgens de onderstaande protocol. Begin de dagelijkse cycli, voederen van drie keer per dag volgens de bovenstaande protocol.
    3. Voer het experiment voor een totaal van 2 weken om de bacteriën te stabiliseren.
      Opmerking: Draait het systeem betekent dat de pH wordt gehandhaafd, de dagelijkse voeding cycli, drie keer per dag worden gevolgd en de mucosal dragers zijn 2 - 3 keer veranderd elke week.
    4. Na stabilisatie, het experiment voor 2 weken worden uitgevoerd als de periode van de controle.
    5. Na de periode van controle door het systeem te gebruiken voor het testen van verschillende componenten of variabelen, bekend als de behandelingsperiode.
    6. Na de behandelingsperiode, stoppen met het toevoegen van de onderdelen of de variabelen en de voorwaarden weer normaal. Dit wordt beschouwd als de wash-out periode en wordt gebruikt om te bepalen of de wijzigingen naar de Gemeenschap permanent zijn.

3. het verzamelen van monsters uit het systeem

Opmerking: Tijdens het experiment monsters kunnen worden geoogst vanaf de fase van het luminal of mucosal van elke regio op elk gewenst moment, na de onderstaande richtsnoeren.

  1. Oogsten van luminal monsters
    1. Oogst luminal vloeistof monsters via de monster-poort die zich in het midden van de cultuur-vloeistof uitstrekt. Beginnen met het schoonmaken van de Luer-Lock op de poort van het monster met 70% ethanol of de kleine alcohol pad en laten drogen.
    2. Zorgen dat alle lucht is verwijderd uit een 30 mL spuit en sluit het aan op de poort van de steekproef. 3 - 5 keer op en neer te vestigen op zorgen goed mengen van de componenten van het vaartuig. Na, tekent u een totaal van 30 mL van de cultuur.
    3. Aliquot de luminal monsters als nodig in steriele falcon buizen en winkel op ijs. Nadat bemonstering is voltooid overbrengen deze naar een vriezer-80 ° C.
    4. P.a. van SCFA, is 15 mL van het monster luminal gesponnen bij 4 ° C, 5000 x g gedurende 10 minuten. De bovendrijvende substantie is spuit gefilterd met behulp van een filter PES 0.2 micrometer. Winkel de gefilterde supernatant bij-80 ° C.
      1. Voor DNA-analyse, spin 1 mL van de luminal vloeistof bij 4 ° C, 5000 x g voor 10 min. Verwijder het supernatant en opslaan van de pellet bij-80 ° C.
      2. Opslaan als een back-up, 10 mL van de luminal vloeistof bij-80 ° C voor de meeste experimenten.
  2. Oogsten van mucosal monsters
    Opmerking:     mucosal vervoerders elke 2-3 dagen wijzigen.
    1. Verwijderen en brengen de bereid mucin vervoerders uit de koelkast.
    2. Zet de stikstof-flush en snel openen van het deksel van de reactor. 50% van de dragers van de mucin verwijderen en nieuwe toevoegen.
    3. Afdichting van de deksel snel en houden de stikstof flush op voor een andere 20 min.
    4. Voor DNA-extractie, aliquoot 0,25-0,5 g agar in een tube 2 mL en opgeslagen bij-80 ° C totdat het nodig is.

4. DNA-extractie, Sequencing en analyse

Opmerking: DNA wordt geëxtraheerd met behulp van de CTAB DNA-extractiemethode met fysieke homogenisering in een fume hood29. Na extractie, een spectrofotometer wordt gebruikt voor het meten van de hoeveelheid DNA in elk monster.

  1. Bereiden CTAB buffer
    1. Los 4,2 g K2HPO4 en 4.09 g NaCl in 200 mL gedeïoniseerd water en gedestilleerd water, dan autoclaaf bij 121 ° C gedurende 30 minuten.
    2. Laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur.
    3. Voeg 10 g Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) en warmte tot 60 ° C met agitatie.
    4. Nadat alle de CTAB is ontbonden, verwijdert u de oplossing uit warmte en afkoelen tot kamertemperatuur.
  2. Bereid PEG-6000-oplossing
    1. Los 300 g polyethyleenglycol 6.000 en 93,5 g NaCl in 1 L gedeïoniseerd, gedestilleerd water.
    2. Na alle deeltjes zijn ontbonden, autoclaaf de oplossing bij 121 ° C gedurende 30 minuten.
    3. Koel de oplossing op kamertemperatuur vóór gebruik na autoclaaf.
  3. Uitvoeren van DNA-extractie
    1. 500 μL van CTAB buffer en 500 μL van fenol-Chloroform-Isoamylalcohol toevoegen aan de 2 mL monsterbuisje en vortex te homogeniseren.
    2. De gehele inhoud van het monsterbuisje overbrengen in een 0.1 mm fysieke homogenisatie tube (Zie Tabel van materialen).
    3. Meng de buizen voor 20 s bij de hoogste instelling tweemaal, met een 20 s pauze tussen, met behulp van een fysieke homogenizer (Zie Tabel van materialen).
    4. Centrifugeer het gehomogeniseerde buizen bij 3000 x g gedurende 5 minuten.
    5. 300 μL van de bovendrijvende substantie overbrengen in een schone, 1,7 mL-buis en 500 μL van CTAB buffer toe te voegen aan de originele buis.
    6. Meng deze buis opnieuw met behulp van de methoden in stappen 4.3.2-4.3.3 en centrifuge bij 3000 x g voor 5 min.
    7. Na het centrifugeren, door een andere 300 μL van de bovendrijvende substantie te overbrengen in de nieuwe buis waarin nu 600 μL.
    8. Een totaal van 600 μL Chloroform-Isoamylalcohol toevoegen aan de buis met 600 μL van de bovendrijvende substantie.
    9. Omkeren van de buizen te mengen, vervolgens kort centrifugeren. 500 μL van de bovenste fase overbrengen in een schone 1,7 mL-buis. Zorg ervoor om alleen de bovenste fase.
    10. Vervolgens 1000 μL van Peg-6000-oplossing toevoegen, omkeren van de buizen te mengen, en vervolgens uit te broeden bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
    11. Na incubatie, centrifugeer de buizen 18,200 x g4 ° C, gedurende 10 minuten.
    12. Verwijder het supernatant en reinigen van de pellet met ijs koud 70% ethanol.
    13. Centrifugeer de buizen weer bij 18,200 x g, 4 ° C, voor 10 min. Verwijder het supernatant en toestaan dat de pellet te drogen in het kabinet van de bioveiligheid onder laminaire flow.
    14. Nadat de pellet droog is, voeg 75 l RNAse Vrije DNAse gratis, steriel water aan elke buis.
    15. Kwantificeren van de geresuspendeerde DNA door een spectrofotometer en vervolgens stuur het voor 16S rRNA gen sequencing.

5. korte keten vetzuren (SCFA) detectie- en analysemethoden

  1. Ontdooi de bevroren monsters bij 40° C gedurende 30 minuten en uitpakken van korte keten vetzuren diethylether met een verhouding van 2:1 (v: v).
  2. Breng de organische fase aan een GC/MS (Zie Tabel van materialen) voorzien van een kolom, 30 m, 0,25 mm ID, 0,25 µm, (Zie Tabel van materialen) waar 10 µL wordt geïnjecteerd.
  3. Stel de injectie poort temperatuur en de aanvankelijke kolomtemperatuur tot 260 ° C en 125 ° C respectievelijk. Houd de aanvankelijke temperatuur voor 1 min en vervolgens dit te verhogen tot 250 ° C, meer dan 11,5 min met een debiet van de kolom van 1 mL/min.
    Opmerking: De temperatuur van de MS voor de ion-bron is 220° C en 250° C voor de interface.
  4. Kwantificeren van het bedrag van elke SCFA standaard curven en 2-methylhexanoic zuur als de interne standaard gebruikt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het bovenstaande protocol beschrijft instellen, inenting, en de werking van een 5-traps in-vitro systeem te bestuderen van de darmflora van de dikke darm. Voor het genereren van de gegevens hieronder, op basis van DNA-extractie, werd 16S rRNA marker gene DNA sequencing van de V1V2-regio uitgevoerd met behulp van de hoge doorvoer sequencing (b.v., MiSeq Illumina platform) door het Microbiome Center op het Children's Hospital van Philadelphia27. QIIME (kwant...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vitro kweken systemen zijn ontwikkeld om te bestuderen van de darmflora van de dikke darm. Zij maken gebruik van toestellen die zijn ontworpen om te simuleren de fysiologische omstandigheden van de gastro intestinal traktaat, bevordering van de groei van een volwassen gut microbiële Gemeenschap voor elke regio van de dubbele punt33. Terwijl het concept logisch en begrijpelijk is, vereist het werkelijke verloop van in vitro kweken systemen te bestuderen van de darmflora precisie en een begrip va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen. Vermelding van handelsnamen of commerciële producten in deze publicatie is uitsluitend met het oog op het verstrekken van specifieke informatie en houdt geen aanbeveling of bekrachtiging door het U.S. Department of Agriculture. USDA is een aanbieder van gelijke kansen en de werkgever.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MS. Audrey Thomas-Gahring wordt erkend voor haar GC/MS werken. Wij zouden ook willen bedanken Massimo Marzorati voor het bewerken van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
TWINSHIMEProdigestNA
Gedefinieerd medium (Volwassen M-SHIME groeimedium met zetmeel)ProdigestNA
Masterflex slangcole ParmerNA
UrinewaasjeBardNA
LabsorbSigma-AldrichNA
Fecale monsterOpenbiomeNA
SpuitenBecton DicksonNA
Gedefinieerd mediumProdigestNA
Oxgall BileBecton DicksonNA
PancreatineSigma-AldrichNA
GlaswerkAce GlassNA
Porcine mucineSigma-AldrichNA
Bacteriologische agarSigma-AldrichNA
SterilisatiezakjesVWRNA
BeadBugBenchmark ScientificNA
Triple-Pure High Impact Zirconium 0,1 mm Bead beater buisBenchmark ScientificNA
RNAse vrij, DNAse vrij, steriel waterRocheNA
Shimadzu QP2010 Ultra GC/MSShimadzuNA
Stabilwax-DA kolom, 30 m, 0,25 mm ID, 0,25 µmRestekNA
Kunststof mucine carriersProdigestNA

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Johansson, M., Larsson, J., Hansson, G. The two mucus layers of colon are organized by the MUC2 mucin, whereas the outer layer is a legislator of host-microbial interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (1), 4659-4665 (2011).
  2. Xu, J., Gordon, J. Honor thy symbionts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10452-10459 (2003).
  3. Jandhyala, S., Talukdar, R., Subramanyam, C., Vuyyuru, H., Sasikala, M., Reddy, D. Role of the normal gut microbiota. World Journal of Gastroenterology. 21 (29), 8787-8803 (2015).
  4. Macfarlane, G., Macfarlane, S. Models for intestinal fermentation: association between food components, delivery systems, bioavailability and functional interactions in the gut. Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), (2007).
  5. McDonald, J., et al. Simulating distal gut mucosal and luminal communities using packed-column biofilm reactors and an in vitro chemostat model. Journal of Microbiological Methods. 108, 36-44 (2015).
  6. Van den Abbeele, P., et al. Arabinoxylans, inulin and Lactobacillus reuteri 1063 repress the adherent-invasive Escherichia coli from mucus in a mucosa-comprising gut model. NPJ Biofilms and Microbiomes. 27 (2), 16016(2016).
  7. Van den Abbeele, P., Van de Wiele, T., Verstraete, W., Possemiers, S. The host selects mucosal and luminal associations of coevolved gut microorganisms: a novel concept. FEMS Microbiology Reviews. 35 (4), 681-704 (2011).
  8. Van den Abbeele, P., et al. Incorporating a mucosal environment in a dynamic gut model results in a more representative colonization by lactobacilli. Microbial Biotechnology. 5 (1), 106-115 (2012).
  9. Kinross, J., Darzi, A., Nicholson, J. Gut microbiome-host interactions in health and disease. Genome Medicine. 3 (3), 14(2011).
  10. Wissenbach, D., et al. Optimization of metabolomics of defined in vitro gut microbial ecosystems. International Journal of Medical Microbiology. 306 (5), 280-289 (2016).
  11. McDonald, J., et al. Evaluation of microbial community reproducibility, stability and composition in a human distal gut chemostat model. Journal of Microbiological Methods. 95 (2), 167-174 (2013).
  12. Venema, K., van den Abbeele, P. Experimental models of the gut microbiome. Best Practice and Research. Clinical Gastroenterology. 27 (1), 115-126 (2013).
  13. Krishnan, S., Alden, N., Lee, K. Pathways and functions of gut microbiota metabolism impacting host physiology. Current Opinion in Biotechnology. 36, 137-145 (2015).
  14. Lach, G., Schellekens, H., Dinan, T., Cryan, J. Anxiety, Depression, and the Microbiome: A Role for Gut Peptides. Neurotherapeutics. 15 (1), 36-59 (2018).
  15. Arias-Jayo, N., Alonso-Saez, L., Ramirez-Garcia, A., Pardo, M. Zebrafish Axenic Larvae Colonization with Human Intestinal Microbiota. Zebrafish. 00 (00), (2017).
  16. Zhu, W., Lin, K., Li, K., Deng, X., Li, C. Reshaped fecal gut microbiota composition by the intake of high molecular weight persimmon tannin in normal and high-cholesterol diet-fed rats. Food and Function. 9 (1), 541-551 (2018).
  17. Nguyen, T., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Model Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
  18. Hale, V., et al. Diet Versus Phylogeny: a Comparison of Gut Microbiota in Captive Colobine Monkey Species. Microbial Ecology. 75 (2), 515-527 (2018).
  19. Lu, D., et al. Host contributes to longitudinal diversity of fecal microbiota in swine selected for lean growth. Microbiome. 6 (1), 4(2018).
  20. Payne, A., Zihler, A., Chassard, C., Lacroix, C. Advances and perspectives in in vitro human gut fermentation modeling. Trends in Biotechnology. 30 (1), 17-25 (2012).
  21. Muegge, B., et al. Diet drives convergence in gut microbiome functions across mammalian phylogeny and within humans. Science. 332 (6032), 970-974 (2011).
  22. Santiago-Rodriguez, T., et al. Chemostat culture systems support diverse bacteriophage communities from human feces. Microbiome. 9 (3), 58(2015).
  23. Sousa, T., Paterson, R., Moore, V., Carlsson, A., Abrahamsson, B., Basit, A. The gastrointestinal microbiota as a site for the biotransformation of drugs. International Journal of Pharmaceutics. 363 (1-2), 1-25 (2008).
  24. Pferschy-Wenzig, E., Koskinen, K., Moissl-Eichinger, C., Bauer, R. A Combined LC-MS Metabolomics- and 16S rRNA Sequencing Platform to Assess Interactions between Herbal Medicinal Products and Human Gut Bacteria in Vitro: a Pilot Study on Willow Bark Extract. Frontiers in Pharmacology. 8 (893), (2017).
  25. Cueva, C., et al. In vitro fermentation of grape seed flavan-3-ol fractions by human faecal microbiota: changes in microbial groups and phenolic metabolites. FEMS Microbiology Ecology. 83 (3), 792-805 (2013).
  26. Molly, K., Van de Woestyne, M., Verstraete, W. Development of a 5-step multi-chamber reactor as a simulation of the human intestinal microbial ecosystem. Applied Microbiology and Biotechnology. 39 (2), 254-258 (1993).
  27. Wang, M., et al. Apigenin Impacts the Growth of the Gut Microbiota and Alters the Gene Expression of Enterococcus. Molecules. 22 (8), (2017).
  28. Caporaso, J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
  29. Edgar, R. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
  30. Cole, J., et al. Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 42 (database issue), 633-642 (2014).
  31. McDonald, D., et al. An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea. The ISME Journal. 6 (3), 610-618 (2012).
  32. Liu, L. S., et al. Establishing a mucosal gut microbial community in vitro using an artificial simulator. PLoS ONE. 13 (7), e0197692(2018).
  33. Van de Wiele, T., Van den Abbeele, P., Ossieur, W., Possemiers, S., Marzorati, M. Chapter 27: The Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem (SHIME ®). The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health. Verhoeckx, K., et al. , Springer Link. (2015).
  34. Van den Abbeele, P., et al. Butyrate-producing Clostridium cluster XIVa species specifically colonize mucins in an in vitro gut model. The ISME Journal. 7 (5), 949-961 (2013).
  35. Possemiers, S., Verthé, K., Uyttendaele, S., Verstraete, W. PCR-DGGE-based quantification of stability of the microbial community in a simulator of the human intestinal microbial ecosystem. FEMS Microbiology Ecology. 49 (3), 495-507 (2004).
  36. Tan, J., McKenzie, C., Potamitis, M., Thorburn, A., Mackay, C., Macia, L. The role of short-chain fatty acids in health and disease. Advances in Immunology. 121, 91-119 (2014).
  37. Yang, J., Kweon, M. The gut microbiota: a key regulator of metabolic diseases. BMB Reports. 49 (10), 536-541 (2016).
  38. Sonnenburg, J., Bäckhed, F. Diet-microbiota interactions as moderators of human metabolism. Nature. 535 (7610), 56-64 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

In vitro cultuurmucine gecoate dragersfecale inoculatiekortketenvetzurenprincipale co rdinatenanalyseDNA sequencingmetabolomanalyseanaerobe conditiespH controle

Gerelateerde artikelen