Methodenartikel

Een fluorescentie gebaseerde methode om te studeren van bacteriële genregulatie in geïnfecteerde weefsels

DOI:

10.3791/59055

⸱

19 februari 2019

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Georgetown University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wordt beschreven, is een methode voor het analyseren van bacteriële genexpressie in dierlijke weefsels op een cellulair niveau. Deze methode biedt een bron voor de studie van de fenotypische verscheidenheid die zich voordoen binnen een bacteriële bevolking in antwoord op het milieu weefsel tijdens een infectie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bacteriële virulentiegenen zijn vaak op het transcriptional niveau geregeld door meerdere factoren die inspelen op de verschillende Milieusignalen. Sommige factoren optreden rechtstreeks op virulentiegenen; anderen controleren pathogenese door de uitdrukking van downstream toezichthouders of de accumulatie van signalen die invloed hebben op de activiteit van de regelaar aan te passen. Terwijl de verordening is uitgebreid onderzocht tijdens de in vitro groei, is relatief weinig bekend over hoe genexpressie is geherwaardeerd tijdens de infectie. Dergelijke informatie is belangrijk wanneer het product van een bepaald gen een kandidaat voor therapeutische interventie is. Transcriptionele benaderingen zoals kwantitatieve, real-time RT-PCR en RNA-Seq zijn krachtige methoden voor het onderzoeken van genexpressie op mondiaal niveau maar lijden met vele technische uitdagingen, met inbegrip van lage overvloed van bacteriële RNA vergeleken met host RNA en monster aantasting door RNases. Evaluatie van de verordening met behulp van fluorescerende verslaggevers is relatief eenvoudig en kan worden multiplexed met fluorescerende eiwitten met unieke spectrale eigenschappen. De methode geschikt is voor eencellige, Spatio analyse van genexpressie in weefsels die vertonen complexe driedimensionale architectuur en physiochemical verlopen die invloed hebben op bacteriële regulerende netwerken. Deze informatie gaat verloren wanneer de gegevens zijn gemiddeld over de bevolking van de bulk. Hierin beschrijven we een methode voor de kwantificering van de genexpressie in bacteriële pathogenen in situ. De methode is gebaseerd op eenvoudige weefsel verwerking en directe observatie van fluorescentie van verslaggever eiwitten. We tonen het nut van dit systeem door onderzoek van de expressie van Staphylococcus aureus thermonuclease (NOC), wiens gene product vereist voor immuun belastingontduiking en volledige virulentie ex vivo en in vivo is. We laten zien dat NOC-gfp wordt sterk uitgedrukt in renal abcessen en heterogene genexpressie verschuldigde gedeeltelijk openbaren aan schijnbare ruimtelijke verordening voor NOC promotor activity in abcessen volledig betrokken bij de immuunrespons. De methode kan worden toegepast op elke bacterie met een manipulatable genetische systeem en ieder model van de infectie, verstrekken van waardevolle informatie voor preklinische studies en Geneesmiddelenontwikkeling.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bacteriën reageren op de veranderende fysiologische omstandigheden en veranderingen in de voeding van hun omgeving door het differentieel uiten genen nodig voor aanpassing en overleving. Bijvoorbeeld, koloniseren opportunistische pathogenen lichaam oppervlakken op relatief lage dichtheden, en zijn vaak onschuldig. Echter, zodra de bacterie doorgedrongen de fysische en chemische belemmeringen tot is, moet het kampen met host immuun cel contra verdedigingen en beperkte beschikbaarheid van nutriënten1. Als voorbeeld, Staphylococcus aureus koloniseert ongeveer eenderde van de bevolking asymptomatically, maar is ook de oorzaak van de verwoestende huid en weke delen infecties, osteomyelitis, endocarditis en bacteriëmie2. Het succes van S. aureus als een ziekteverwekker wordt vaak toegeschreven aan de metabole flexibiliteit, alsmede een arsenaal van oppervlak-geassocieerde en secreted virulentiefactoren waarmee de bacterie te ontsnappen van de bloedbaan en repliceren in perifere weefsels 3,4,5. Omdat host overlijden ten gevolge van Staphylococcus ziekte een evolutionaire doodlopende en grenzen overbrenging op nieuwe hosts6 is, moet het streven naar virulentie factor productie zorgvuldig worden gecontroleerd.

Een complexe regelgeving netwerk van eiwitten en niet-coderende RNAs reageert op een verscheidenheid van milieu stimuli, met inbegrip van cel dichtheid, groeifase neutrofiele-geassocieerde factoren en nutriënten beschikbaarheid, om ervoor te zorgen dat virulentiegenen worden uitgedrukt in de precieze tijd en locatie in gastheer weefsel7,8,9,10,11,12,13. Bijvoorbeeld, regelt de SaeR/S 2-componenten systeem (TCS) expressie van verschillende virulentiefactoren via de sensor kinase (SaeS) en de reactie regulator (SaeR)14. SaeS is autophosphorylated op een residu van de geconserveerde histidine in reactie op host signalen (b.v., menselijke neutrofiele peptiden [HNPs], calprotectin)8,15,16. De fosforyl-groep wordt vervolgens overgebracht naar een aspartaat residu op SaeR, activeren als een DNA-bindend-proteïne (SaeR ~ P)17. De SaeR/S TCS regelt meer dan 20 genen die bijdragen aan de pathogenese waaronder fibronectine bindende proteïnen (FnBPs), leukocidins en coagulase14,18,19,20. Doelstellingen kunnen worden ingedeeld in hoge-affiniteit en lage-affiniteit gene doelstellingen, die waarschijnlijk veroorzaakt als het niveau van de SaeR ~ P stijgt wanneer blootgesteld aan haar signalen21. De SaeR/S activiteit wordt beheerd door andere regelgevers van genexpressie zoals de Agr quorum sensing systeem, onderdrukker van toxines eiwitten (Rot), en de alternatieve sigma factor B (SigB)22,23,24.

NOC is een Sae-afhankelijke virulentie gen in Staphylococcus aureus en codeert thermonuclease (NOC), die essentieel is voor het ontsnappen uit neutrophilic extracellular traps (netten) en voor verspreiding tijdens de cursus van infectie25,26. De uitdrukking van NOC is ook sterk indirect onderdrukt door CodY in aanwezigheid van vertakte-keten aminozuren en GTP27, en direct onderdrukt door de Staphylococcus accessoire regelgever proteïne SarA28,29 , waarvan de activiteit wordt beïnvloed door zuurstof (redox staat) en pH30. Gezien het feit dat sae en NOC mutanten zijn verzwakt in muismodellen van infectie, is er interesse in de ontwikkeling van chemische interventies die een remmende werking van hun overeenkomstige activiteiten26,31. Ondanks dit is er geen informatie met betrekking tot hun verordening tijdens de infectie.

Fluorescerende verslaggevers werden gebruikt om te controleren en te kwantificeren van genexpressie op het niveau van één cel. Hierin presenteren wij een methode voor de kwantificering van S. aureus genexpressie gedurende infectie die, wanneer in paren gerangschikt met in vitro transcriptome analyse en krachtige imaging technieken zoals magnetische resonantie beeldvorming (MRI) en magnetische resonantie spectroscopie (MRS), kan onthullen hoe bacteriële Fysiologie is geregeld in vivo en de relatieve abundanties van voedingsstoffen in bepaalde niches. De methode kan worden toegepast op eventuele bacteriële pathogenen met een hanteerbare genetische systeem.

Overzicht van het genoom integratieve vector.

Het genoom integratieve vector pRB4 bevat 500 basenparen elk van de upstream- en downstream regio's van de S. aureus USA300 SAUSA300_0087 pseudogene te vergemakkelijken van homologe recombinatie. pRB4 is afgeleid van de temperatuurgevoelige pMAD vector ruggengraat met de erythromycine weerstand cassette (ermC) en de thermostable beta-galactosidase gene bgaB voor blauw/wit screening van recombinanten32. De gemanipuleerde verslaggever construct bevat ook een chlooramfenicol weerstand marker (kat) voor selectie na genoom integratie en uitbanning van de plasmide, evenals EcoRI en SmaI sites om te fuseren de regelgevende regio van belang zijn voor superfolder groen fluorescente proteïne (sGFP) (Figuur 1). Het is bekend dat de keuze van ribosoom bindende site (RBS) de activiteit van de verslaggever beïnvloedt, en vaak empirische optimalisatie33 vereist. Dus, een RBS wordt niet geleverd. Hier is de inheemse ribosoom bindende site wordt gebruikt om te voorzien in een meer natuurlijke patroon van genexpressie, maar andere sites mogen worden gebruikt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Georgetown.

1. generatie van de fluorescerende verslaggever stam

  1. De genoom integratieve pRB4 vector opeenvolgend met EcoRI en SmaI restrictie-enzymen verteren. Volgens de fabrikant protocol, opzetten van een overnachting spijsvertering met SmaI met behulp van 1 microgram van pRB4 bij 25 ° C, en ga vervolgens verder met de tweede spijsvertering gedurende 1 uur bij 37 ° C door EcoRI toe te voegen aan het reactiemengsel. Inactivering van de enzymen door broeden bij 65 ° C gedurende 20 min.
  2. PCR versterken de regelgevende regio van belang van genomic DNA (in dit geval een ~ 350 basenpaar fragment van DNA met de promotor-regio voor thermonuclease [NOC]), waarin de beperkingsplaats van een 5'-EcoRI en de beperkingsplaats van een 3'-SmaI. De volgorde van SmaI erkenning moet worden in-frame met de translationeel start codon. In deze studie, de PCR werd uitgevoerd met behulp van een Polymerase van DNA van HiFi-volgens de aanbevelingen van de fabrikant met voorwaartse primer oRB015 (5'-atcattgaattctccaaagtaaattataagttatac-3') en reverse primer oRB016 () 5'-gggcataactaacacctctttctttttag-3'). De onthardende temperatuur was 53 ° C. Het zuiveren van het resulterende fragment met behulp van een PCR-opschonen kit na instructies van de fabrikant.
  3. Het resulterende PCR product met EcoRI en SmaI zoals uitgevoerd in stap 1.1 verteren en afbinden van het verteerd DNA-fragment met de dezelfde sites van pRB4 die gebruikmaken van T4 DNA ligase zoals aanbevolen door de fabrikant voor het genereren van de integratieve constructie. Het introduceren van de afbinding mengsel in E. coli en bevestig construct-opeenvolging.
  4. Electroporate de constructie in S. aureus -stam RN422034zoals hiervoor is beschreven. Kortom, gebruik 1 µg plasmide met 70 µL van electro-bevoegde cellen (100 Ω, 25 µF, en 2.3 kV) in B2 Bouillon (1% [w/v] caseïne hydrolysaat, 2,5% [w/v] gistextract, 2,5% [w/v] NaCl, 0,1% [w/v] K2PO4, 0,5% [w/v] Glucose). Selecteer voor erythromycine weerstand (Emr) op de tolerante temperatuur (30 ° C) al soja agar (TSA) aangevuld met erytromycine (5 µg mL-1) en 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal; 80 µg mL-1). De resulterende transformants zijn blauw als gevolg van de plasmide-gecodeerde β-galactosidase-activiteit.
    Opmerking: Overdracht van DNA in klinische isolaten is uiterst moeilijk als gevolg van een sterke beperking-wijziging barrière35. Dus, S. aureus RN4220 werd gebruikt als een tussenliggende ontvanger voor de fusie construct omdat het beperking ontoereikend en zeer gassamenstelling.
  5. Plasmide Transfer naar S. aureus USA300 stam van belang met behulp van electroporation of bacteriofaag-gemedieerde transductie36 op de tolerante temperatuur. Kortom, propageren Φ11 bacteriofaag deeltjes op de stam van de donor met TSA platen met 5 mM CaCl2 overnachting bij 30 ° C, en vervolgens steriliseren door filtratie door een 0,45 µM celluloseacetaat spuit filter. Hiermee kunt u dat lysates transduce van S. aureus -stam LAC Emr.
    Opmerking: LAC is een veel gebruikte klinische isolaat die eerder maakte Em gevoelige seriële passage in TSB medium om te genezen van de stam van de pUSA03 van de inheemse plasmide die Emr 37,38verleent.
  6. Integreer de constructie door twee opeenvolgende homologe recombinatie gebeurtenissen in het chromosoom zoals eerder beschreven32. De recombinanten zijn chlooramfenicol-resistente (Cmr) op TSA platen met 5 μg mL-1 van chlooramfenicol, erythromycine-gevoelig (Erms) en geen langere blauw.
    Opmerking: Indien mogelijk, opnieuw in te voeren de gemarkeerde fusion USA300 via faag-gemedieerde signaaltransductie om te voorkomen dat de accumulatie van mutaties in vitro stam passage39 en temperatuur verschuivingen zijn gekoppeld.

2. dierlijke infectie: Bereiding van het entmateriaal, systemische infectie en bewerking

  1. Voorbereiding van bacteriële entmateriaal
    1. Strijk S. aureus stammen van belang voor isolatie op bloed agar platen uit de voorraad van een bevroren glycerol. Incubeer bij 37 ° C gedurende 16-24 uur te bevestigen hemolytische fenotypen op basis van hun vermogen lyse van rode bloedcellen (RBC) en formulier schakelt u transparante gebieden.
    2. Initiëren overnachting culturen door het enten van enkele kolonies van elke stam tot 4 mL al soja Bouillon (TSB) in steriele glazen buizen. Draai de buizen bij 37 ° C gedurende 16-24 uur in een buis roller vastgesteld op ongeveer een hoek van 70° en 70 rotaties per minuut [RPM].
    3. Een spectrofotometer gebruiken voor het meten van de extinctie op 600 nm (OD600) van de culturen uit stap 2.1.2. Gebruik steriele medium als een optische verwijzing (leeg). Verdun deze cellen een OD600 van 0,05 in 25 mL van steriele al soja Bouillon (TSB) in aparte, 125 mL DeLong kolven (5:1 kolf volumeverhouding) en incubeer culturen in een waterbad (voor een goede warmteoverdracht naar de culturen), schudden bij 280 RPM en ingesteld op 37 ° C.
      Opmerking: Groei van het entmateriaal kan worden uitgevoerd op verschillende manieren; een methode voor het kweken van cellen naar exponentiële fase wordt gepresenteerd. Hoe dan ook, is het belangrijk om consequent dezelfde methode te gebruiken ter voorbereiding van de cellen van de inenting.
    4. Bij een OD600 ~ 1, Verdun opnieuw de cellen tot verse medium naar een startende OD600 van 0,05 om ervoor te zorgen de cellen bereiken exponentiële fase en dat factoren die zich tijdens nachtelijke incubatie ophopen hebben teruggebracht tot exponentiële fase niveaus.
    5. Het oogsten van de cellen in exponentiële fase (OD600 ~0.6–0.8) door centrifugatie bij 3000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    6. Het wassen van de pellets tweemaal in gelijkwaardige hoeveelheid steriele 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; pH 7.4).
    7. Opschorten van de cellen in 1 x PBS (pH 7.4) tot een concentratie van 1 x 108 kolonievormende eenheden (CFUs) mL-1 of, afhankelijk van de gewenste experimenteren.
      Opmerking: is het belangrijk om te bepalen van de relatie tussen OD600 en CFU mL-1 voor elke stam van belang omdat stam-afhankelijke wijzigingen van de celgrootte en vorm kunnen invloed hebben op de eigenschappen van de lichtverstrooiing en uiteindelijk, de infectie dosis.
  2. Voorbereiding van de dieren en de bacteriële infectie
    1. Acclimatiseren muizen voor 7 dagen op gezuiverde dieet AIN-93. Het dieet is geformuleerd om adequate voeding terwijl het verminderen van weefsel auto-fluorescentie verband met de consumptie van plantaardige ingrediënten gebruikt in standaard muis chow40.
      Opmerking: Vrouwelijke C57/BL6 muizen (6-8 weken oud) hier worden gebruikt, maar de muis stam en het geslacht zal afhangen van de studie.
    2. Voordat de infectie, verwijden muis staart aders met lauw water.
    3. Dieren infecteren door injecterend 100 µL van de bacteriële entmateriaal via staart-aders te produceren van een systemische infectie. Een aliquoot gedeelte van de oorspronkelijke entmateriaal opslaan als uitvoert stroom cytometry (zie punt 4).
    4. Dieren dagelijks controleren en evalueren van hun gezondheidsstatus met behulp van een systeem voor gezondheidsmonitoring gecontroleerd en goedgekeurd door iemands institutionele Animal Care en gebruik Comité.
    5. Toestaan dat de infectie aan de vooruitgang voor de gewenste duur. Hier, zijn de experimenten beëindigd 3 dagen na infectie.
      Opmerking: Onder deze omstandigheden bestaan abcessen uit een Staphylococcus abces Gemeenschap van bacteriën, omringd door fibrine deposito's, en omgeven door concentrische lagen van immuuncellen5,41.
  3. Oogsten van de organen en weefsel verwerking
    1. Euthanaseren van de dieren door CO2 inhalatie en cervicale dislocatie als secundaire methode en het uitvoeren van de necropsie.
    2. Oogst van de nier (rechts) en andere vitale organen (hart, lever, longen, milt) en Pipetteer in polypropyleen tubes 15 mL met 10% [v/v] gebufferd formaline. Ga verder met deze organen te versterken 2.3.4 hieronder.
    3. De linker nier overbrengen in een steriele 2 mL slagvaste buis met ~ 500 µL van 2 mm silica kralen en 1 mL steriele 1 x PBS (pH 7.4). Ga verder met dit orgel met stap 4.2.
    4. Toestaan dat organen van stap 2.3.2 om in het donker bij kamertemperatuur met zacht schudden of rotatie voor ten minste 24 uur maar niet meer dan 48 uur te bevestigen.
    5. Insluiten van organen in duidelijke weefsel bevriezing van middellange en opslaan van de weefsels bij-80 ° C.
    6. Met behulp van een cryostaat, sectie weefsel in plakjes van 10 µm dikte.
    7. Droog de secties op een vooraf gereinigd, geladen glasplaatje gedurende 20 minuten in de duisternis, harde montage medium met 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) vlek, van toepassing en breng dekglaasje aan. Genezen van gekoppelde dia's bij kamertemperatuur overnachten en overbrengen van 4 ° C voor langdurige opslag.

3. laser Scanning Confocal Microscopie en beeldverwerking

  1. Onderzoeken gekoppelde dia's om te zoeken van de laesies met behulp van lasers geschikt is voor de fluorescerende verslaggever wordt gebruikt. In dit geval, de groen (GFP), rood (tdTomato) en blauwe (DAPI) fluorescentie worden signalen gebruikt.
  2. Verwerven van de afbeelding met behulp van de passende doelstelling voor het visualiseren van afzonderlijke cellen (bijvoorbeeld meestal 20 x of 40 x doelstellingen worden gebruikt).
  3. Meet de intensiteit van de fluorescentie in de confocal beelden.
    1. Open de confocal afbeelding in afbeelding J en aanpassen helderheid/contrast om het signaal van de fluorescentie van de laesie correct te visualiseren.
    2. De regio van belang, en met behulp van de optie drempelmethode definiëren, stel dan de boven- en ondergrenzen fluorescentie als dit nodig is.
    3. Definieer de centroid door gebied → gemiddelde grijswaarde → Centroid → beperken tot drempel onder het tabblad analyseren in beeld J.
    4. Uittreksel centroid fluorescentie intensiteitswaarde of meten van de intensiteit van de fluorescentie van de gemiddelde in een bepaalde laesie per oppervlakte-eenheid (gemiddelde fluorescentie intensiteit, MFI) voor GFP en tdTomato. Hier werden de gebieden van één µm2 gebruikt.
      Opmerking: Een geblindeerde tweede analyse wordt bias geminimaliseerd wanneer de identiteit van het monster is bekend.
    5. De gegevens uitzetten en de passende statistische analyses uit te voeren voor elke vergelijking.

4. Stroom Cytometry analyse

  1. (Optioneel) Fusion activiteit van het entmateriaal bepalen op de dag van de infectie (van punt 2.2.3)
    1. Naar 899 µL van 1 x steriel PBS (pH 7.4) Voeg 100 µL van elke entmateriaal en 1 µL van membraan nucleïnezuur permeant vlek (Zie Tabel van materialen). Als een besturingselement, moet omvatten een steekproef nucleïnezuur vlek ontbreekt.
    2. Stroom cytometry uitvoeren op alle monsters.
      Opmerking: Voor het allereerste experiment is het nuttig om een vector enige besturingselement voor de fusie van belang zijn voor het bepalen van de juiste spanning te gebruiken. Een duidelijke scheiding tussen positieve en negatieve monsters is essentieel voor data-analyse, met vermelding van de verslaggever is ruim boven de achtergrond signaal.
    3. U kunt identificeren de bacteriële bevolking, plot gebeurtenissen met behulp van nucleïnezuur vlek (y-as) en toekomen scatter (x-as).
    4. Tekenen van een opneming poort rond gebeurtenissen die zijn beide nucleïnezuur vlek positief en de juiste grootte van de bacterie op basis van de voorwaartse scatter (tussen 0,5 naar 2.0 µm voor S. aureus).
      Opmerking: Rigoreus zijn bij het identificeren van deze bevolking, zoals het is van cruciaal belang om op te nemen van de gebeurtenissen die zich duidelijk binnen deze parameters. Zorg ervoor dat deze poort sluit alle gebeurtenissen voor de negatieve controles onder andere omstandigheden. In deze studie, ongeveer 70% de celpopulatie ontmoette deze eisen in de analyse.
  2. Analyse van weefselmonsters na offer:
    1. Euthanaseren van de dieren, oogsten van de linker nieren (zie stap 2.3) en overdracht in parel-kloppend buizen met 1 mL 1 x steriel PBS (pH 7.4) en 250 µL van 2 mm borosilicaat parels.
    2. Verstoren weefsels om bacteriële cellen vrij te geven. Voor nieren, gebruikt u een homogenizer te verstoren van de cellen. Hier werden drie 30 s uitbarstingen op 6800 rpm met 1 min koeling perioden op nat ijs tussen cycli gebruikt om te minimaliseren van verwarming monsters.
    3. Pellet het grotere weefsel puin door centrifugatie bij 250 x g gedurende 3 minuten in een tafelblad microcentrifuge gekoeld tot 4 ° C.
      Opmerking: Er is meestal een pellet van de cel aan de onderkant van de buis en een laag van zwevend puin op de top. De waterige middenlaag bevat de bacteriële cellen.
    4. Pipetteer 10 µL van de waterige laag in een schone 1,5 mL microcentrifuge buis met 1 µL van nucleïnezuur vlek in 989 µL van PBS (total volume 1 mL).
    5. Uitvoeren van cytometry van de stroom met behulp van dezelfde gegevens overname parameters en gating wat betreft de initiële entmateriaal.
      Opmerking: Bacteriële cellen zullen zeer laag zijn, omdat het monster voornamelijk weefsel puin bevat. De "Live gate" optie kan ook worden gebruikt als de cellen nucleïnezuur vlek positief en grootte-gated wanneer gegevens zijn geladen in de toepassing. Dit zal ook bijdragen tot meer van de gebeurtenissen van de doelgroep analyseren en bestandsgrootte verkleinen. Bijna een miljoen evenementen per monster worden geteld kunnen, maar meer gebeurtenis graven nodig zijn afhankelijk van de ernst van de infectie en de grootte van weefsel geanalyseerd.
    6. Gegevensanalyse: Bepalen fluorescerende intensiteit (MFI) betekenen voor elk fluorophore in een monster met behulp van de poorten van de opname bepaald in punt 4.1.4. Normaliseren monsters in de software van de analyse van de stroom aan gebeurtenis graven. 10.000 graven zijn meestal voldoende in de analyse.
      Opmerking: Het is niet ongewoon om te vinden van monsters die minder dan dit aantal gebeurtenissen bevatten sinds dit afhankelijk van de ernst van abces vorming en infectie is. Met behulp van deze aanpak, 500-40.000 worden evenementen meestal gevonden in geïnfecteerde weefsel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We ontwikkelden een plasmide afgeleid van pMAD32 , die een verslaggever leveren kan fusion constructie in het chromosoom door dubbele crossover homologe recombinatie (Figuur 1). Deze constructie zorgt voor de kwantitatieve analyse van alle regelgevende regio die ondersteuning biedt voor de productie van GFP eiwit en fluorescent signaal boven achtergrond. Het plasmide verleent ampicilline-resistentie (Apr) voor onderhoud en v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bacteriële infectieziekten zijn een toenemend gezondheidsprobleem wereldwijd als gevolg van de overname van antibioticaresistentie determinanten46. Omdat aanpassing aan de host-omgevingen essentieel voor groei en overleving tijdens de infectie is, kunnen strategieën gericht op gen expressie programma's waardoor pathogen fitness nuttig therapeutisch. Een dergelijk programma is de verzameling van genen gecontroleerd door de SaeR/S 2-componenten systeem (TCS), om te spelen een essentiële rol bij immu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Alexander Horswill voor de gave van de PsarAP1- tdTomato fusion, en Karen Creswell voor hulp bij stroom cytometry analyse. Wij danken ook Alyssa King voor advies over statistische analyse. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door een NIH exploratiepremies/Developmental Research Award (grant AI123708) en SRB fondsen faculteit opstarten. De financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en interpretatie, of de beslissing tot het indienen van het werk voor publicatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
5% schapenbloedHardy Diagnostics (Santa Maria, CA)A10
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-Gal)ThermoScientificR0402
AmpicillinFisher ScientificBP1760-25
C57Bl/6 MuizenCharles RiverNA
ChloramfenicolSigma-AldrichC-0378
confocale laserscanning microscoopZeissNA
cryostat microtoomThermo ScientificNA
Cultuur, CapVWR International2005-02512
D+2:25NA OligoIntegrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)NA
DNA LigaseNew England BiolabsM0202S
ErytromycinSigma-AldrichE5389
Flow AnalyzerBecton DickinsonNA
glaskralenSigmaZ273627
Miniprep, plasmidPromegaA1220
orbitaal schudbaadNew Brunswick InnovaNA
PCR zuiveringQIagen28106
Fosfaat Buffer Saline (PBS)Cellgrow46-013-CM
Plate readerTecanNA
Precellys 24 homogenisatorBertin LaboratoriesNA
pUC57-KanGenScript (Piscataway, NJ)NA
Q5 Taq DNA PolymeraseNew England Biolabs (Ipswich, MA)M0491S
RestrictienenzyymenNew England Biolabs (Ipswich, MA)R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).
Reverse transcriptaseNew England BioLabsE6300L
Sanger SequencingGenewiz (Germantown, MD)NA
Sub Xero clear weefselvriesmediumMercedes MedicalMER5000
Superfrost Plus microscoopglaasjesFisher Scientific12-550-15
superloopGE Lifesciences18111382
Spuit, FilterVWR International28145-481
Syto 40Thermo Fisher ScientificS11351Membraan doorlatende nucleïnezuurkleurstof
TetracyclineSigma-AldrichT7660
Tryptic Soya BouillonVWR90000-376
UV-zichtbaar spectrofotometerBeckman Coulter-DU350NA
Vectashield Antifade Montagemedium met DAPIVector LaboratoriesH-1500

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
  2. Lowy, F. Staphylococcus aureus infections. The New England Journal of Medicine. 339 (8), 520-532 (1998).
  3. Grosser, M. R., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus nitric oxide resistance and virulence. PLoS Pathogen. 14 (3), 1006907(2018).
  4. Valentino, M., et al. Genes contributing to Staphylococcus aureus fitness in abscess- and infection-related ecologies. MBio. 5 (5), 01714-01729 (2014).
  5. Cheng, A., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. FASEB Journal. 23 (10), 3393-3404 (2009).
  6. Meyers, L. A., Levin, B. R., Richardson, A. R., Stojiljkovic, I. Epidemiology, hypermutation, within-host evolution and the virulence of Neisseria meningitidis. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 270 (1525), 1667-1677 (2003).
  7. Balasubramanian, D., et al. Staphylococcus aureus Coordinates Leukocidin Expression and Pathogenesis by Sensing Metabolic Fluxes via RpiRc. MBio. 7 (3), 00818(2016).
  8. Geiger, T., Goerke, C., Mainiero, M., Kraus, D., Wolz, C. The virulence regulator Sae of Staphylococcus aureus.: promoter activities and response to phagocytosis-related signals. Journal of Bacteriology. 190 (10), 3419-3428 (2008).
  9. Weiss, A., Broach, W. H., Shaw, L. N. Characterizing the transcriptional adaptation of Staphylococcus aureus. to stationary phase growth. Pathogens and Disease. 74 (5), (2016).
  10. Balaban, N., Novick, R. P. Autocrine regulation of toxin synthesis by Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (5), 1619-1623 (1995).
  11. Pohl, K., et al. CodY in Staphylococcus aureus: a regulatory link between metabolism and virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 191 (9), 2953-2963 (2009).
  12. Majerczyk, C. D., et al. Staphylococcus aureus CodY negatively regulates virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 190 (7), 2257-2265 (2008).
  13. McNamara, P. J., Milligan-Monroe, K. C., Khalili, S., Proctor, R. A. Identification, cloning, and initial characterization of rot, a locus encoding a regulator of virulence factor expression in Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology. 182 (11), 3197-3203 (2000).
  14. Liu, Q., Yeo, W. S., Bae, T. The SaeRS Two-Component System of Staphylococcus aureus. Genes (Basel). 7 (10), 81(2016).
  15. Giraudo, A., Calzolari, A., Cataldi, A., Bogni, C., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus encodes a two-component regulatory system. FEMS Microbiology Letters. 177 (1), 15-22 (1999).
  16. Cho, H., et al. Calprotectin Increases the Activity of the SaeRS Two Component System and Murine Mortality during Staphylococcus aureus Infections. PLoS Pathogen. 11 (7), 1005026(2015).
  17. Sun, F., et al. In the Staphylococcus aureus two-component system sae, the response regulator SaeR binds to a direct repeat sequence and DNA binding requires phosphorylation by the sensor kinase SaeS. Journal of Bacteriology. 192 (8), 2111-2127 (2010).
  18. Liang, X., et al. Inactivation of a two-component signal transduction system, SaeRS, eliminates adherence and attenuates virulence of Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 74 (8), 4655-4665 (2006).
  19. Giraudo, A. T., Cheung, A. L., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus controls exoprotein synthesis at the transcriptional level. Archives of Microbiology. 168 (1), 53-58 (1997).
  20. Flack, C. E., et al. Differential regulation of staphylococcal virulence by the sensor kinase SaeS in response to neutrophil-derived stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (19), 2037-2045 (2014).
  21. Mainiero, M., et al. Differential target gene activation by the Staphylococcus aureus two-component system saeRS. Journal of Bacteriology. 192 (3), 613-623 (2010).
  22. Li, D., Cheung, A. Repression of hla by rot is dependent on sae in Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 76 (3), 1068-1075 (2008).
  23. Bischoff, M., et al. Microarray-based analysis of the Staphylococcus aureus sigmaB regulon. Journal of Bacteriology. 186 (13), 4085-4099 (2004).
  24. Novick, R., Jiang, D. The staphylococcal saeRS system coordinates environmental signals with agr quorum sensing. Microbiology. 149, Pt 10 2709-2717 (2003).
  25. Olson, M. E., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  26. Berends, E., et al. Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps. Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-587 (2010).
  27. Waters, N. R., et al. A spectrum of CodY activities drives metabolic reorganization and virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 101 (3), 495-514 (2016).
  28. Cassat, J., et al. Transcriptional profiling of a Staphylococcus aureus clinical isolate and its isogenic agr and sarA mutants reveals global differences in comparison to the laboratory strain RN6390. Microbiology. 152, Pt 10 3075-3090 (2006).
  29. Kiedrowski, M., et al. Nuclease modulates biofilm formation in community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 6 (11), 26714(2011).
  30. Fujimoto, D. F., et al. Staphylococcus aureus SarA is a regulatory protein responsive to redox and pH that can support bacteriophage lambda integrase-mediated excision/recombination. Molecular Microbiology. 74 (6), 1445-1458 (2009).
  31. Yeo, W. S., et al. The FDA-approved anti-cancer drugs, streptozotocin and floxuridine, reduce the virulence of Staphylococcus aureus. Scientific Reports. 8 (1), 2521(2018).
  32. Arnaud, M., Chastanet, A., Débarbouillé, M. New vector for efficient allelic replacement in naturally nontransformable, low-GC-content, Gram-positive bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 70 (11), 6887-6891 (2004).
  33. Malone, C. L., et al. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. Journal of Microbiological Methods. 77 (3), 251-260 (2009).
  34. Schenk, S., Laddaga, R. A. Improved method for electroporation of Staphylococcus aureus. FEMS Microbiology Letters. 73 (1-2), 133-138 (1992).
  35. Monk, I. R., Foster, T. J. Genetic manipulation of Staphylococci-breaking through the barrier. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2, 49(2012).
  36. Novick, R. P. Genetic systems in staphylococci. Methods in Enzymology. 204, 587-636 (1991).
  37. Diep, B. A., et al. Complete genome sequence of USA300, an epidemic clone of community-acquired meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 367 (9512), 731-739 (2006).
  38. Boles, B. R., Thoendel, M., Roth, A. J., Horswill, A. R. Identification of genes involved in polysaccharide-independent Staphylococcus aureus biofilm formation. PLoS One. 5 (4), 10146(2010).
  39. Villaruz, A. E., et al. A point mutation in the agr locus rather than expression of the Panton-Valentine leukocidin caused previously reported phenotypes in Staphylococcus aureus pneumonia and gene regulation. Journal of Infect Diseases. 200 (5), 724-734 (2009).
  40. Reeves, P. G., Nielsen, F. H., Fahey, G. C. J. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet. Journal of Nutrition. 123 (11), 1939-1951 (1993).
  41. Thomer, L., Schneewind, O., Missiakas, D. Pathogenesis of Staphylococcus aureus Bloodstream Infections. Annual Review of Pathology. 11, 343-364 (2016).
  42. Olson, M., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  43. Thammavongsa, V., Missiakas, D., Schneewind, O. Staphylococcus aureus degrades neutrophil extracellular traps to promote immune cell death. Science. 342 (6160), 863-866 (2013).
  44. Cheung, A. L., Nast, C. C., Bayer, A. S. Selective activation of sar promoters with the use of green fluorescent protein transcriptional fusions as the detection system in the rabbit endocarditis model. Infection and Immunity. 66 (12), 5988-5993 (1998).
  45. Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
  46. Uhlemann, A. C., Otto, M., Lowy, F. D., DeLeo, F. R. Evolution of community- and healthcare-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Infection, Genetics and Evolution. 21, 563-574 (2014).
  47. Voyich, J. M., et al. The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus. Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).
  48. Cheng, A., DeDent, A., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus. abscess formation. Trends in Microbiology. 19 (5), 225-232 (2011).
  49. Balasubramanian, D., Harper, L., Shopsin, B., Torres, V. J. Staphylococcus aureus pathogenesis in diverse host environments. Pathogens and Disease. 75 (1), (2017).
  50. Vitko, N. P., Grosser, M. R., Khatri, D., Thurlow, L. R., Richardson, A. R. Expanded Glucose Import Capability Affords Staphylococcus aureus Optimized Glycolytic Flux during Infection. MBio. 7 (3), 00296(2016).
  51. Landete, J. M., et al. Use of anaerobic green fluorescent protein versus green fluorescent protein as reporter in lactic acid bacteria. Applied Microbiology and Biotechnol. 99 (16), 6865-6877 (2015).
  52. Buckley, A. M., et al. Lighting Up Clostridium Difficile: Reporting Gene Expression Using Fluorescent Lov Domains. Scientific Reports. 6, 23463(2016).
  53. Bose, J. L. Genetic manipulation of staphylococci. Methods in Molecular Biology. 1106, 101-111 (2014).
  54. Krute, C. N., et al. Generation of a stable plasmid for in vitro and in vivo studies of Staphylococcus. Applied and Environmental Microbiology. , 02370(2016).
  55. Cassat, J. E., et al. Integrated molecular imaging reveals tissue heterogeneity driving host-pathogen interactions. Science Translational Medicine. 10 (432), 6361(2018).
  56. Handlogten, M. E., Hong, S. P., Westhoff, C. M., Weiner, I. D. Apical ammonia transport by the mouse inner medullary collecting duct cell (mIMCD-3). American Journal of Physiology-Renal Physiology. 289 (2), 347-358 (2005).
  57. Hijmans, B. S., Grefhorst, A., Oosterveer, M. H., Groen, A. K. Zonation of glucose and fatty acid metabolism in the liver: mechanism and metabolic consequences. Biochimie Journal. 96, 121-129 (2014).
  58. Davis, K. M., Mohammadi, S., Isberg, R. R. Community behavior and spatial regulation within a bacterial microcolony in deep tissue sites serves to protect against host attack. Cell Host & Microbe. 17 (1), 21-31 (2015).
  59. Stenman, J. M., et al. Canonical Wnt signaling regulates organ-specific assembly and differentiation of CNS vasculature. Science. 322 (5905), 1247-1250 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Fluorescent Reporter AssayConfocal MicroscopyFlow CytometryStaphylococcus aureusTissue SectioningFluorescence Intensity MeasurementSpatial Gene ExpressionIn Situ AnalysisGFP Fusion Protein

Gerelateerde artikelen