Method Article

Zeer gevoelige meting van de glomerulaire permeabiliteit bij muizen met Fluorescein isothiocyanaat-poly sucrose 70

DOI:

10.3791/59064

⸱

August 9th, 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, Medical Faculty, Heinrich-Heine-University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol voor het testen van de glomerulaire permeabiliteit in muizen met behulp van een zeer gevoelige, niet-radioactieve Tracer. Deze methode maakt repetitieve urine analyses mogelijk met kleine urine volumes.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het verlies van albumine in de urine (albuminurie) voorspelt cardiovasculaire uitkomst. Onder fysiologische omstandigheden worden kleine hoeveelheden albumine gefilterd door de glomerulus en weer geabsorbeerd in het buis systeem tot de absorptie limiet is bereikt. Vroege verhogingen van pathologische albumine filtratie kunnen dus worden gemist door het analyseren van albuminurie. Daarom lijkt het gebruik van tracers voor het testen van glomerulaire permselectiviteit voordelig. Fluorescently gelabeld Tracer fluoresceïne isothiocyanaat (FITC)-poly sucrose (d.w.z. FITC-Ficoll), kan worden gebruikt om glomerulaire permselectiviteit te bestuderen. FITC-poly sucrose moleculen worden vrij gefilterd door de glomerulus maar niet geabsorbeerd in het buis systeem. Bij muizen en ratten is FITC-poly sucrose onderzocht in modellen van glomerulaire permeabiliteit door gebruik te maken van technisch complexe procedures (d.w.z. radioactieve metingen, hogedrukvloeistofchromatografie [HPLC], gel filtratie). We hebben een FITC-polysucrose Tracer-gebaseerd protocol aangepast en vergemakkelijkt om vroege en kleine stijgingen van de glomerulaire permeabiliteit te testen op FITC-poly sucrose 70 (grootte van albumine) bij muizen. Deze methode maakt repetitieve urine analyses mogelijk met kleine urine volumes (5 μL). Dit protocol bevat informatie over hoe de Tracer FITC-poly sucrose 70 intraveneus wordt aangebracht en urine wordt opgevangen via een eenvoudige urinaire katheter. Urine wordt geanalyseerd via een fluorescentie plaat lezer en genormaliseerd naar een urine concentratie marker (creatinine), waardoor technisch complexe procedures te vermijden.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Functionele of structurele defecten binnen de glomerulaire filtratie barrière verhogen glomerulaire permeabiliteit aan albumine, wat resulteert in de detectie van albumine in de urine (albuminurie). Albuminurie voorspelt cardiovasculaire uitkomst en is een belangrijke marker voor glomerulaire letsel1. Zelfs lage niveaus van albuminurie, liggend binnen het normale bereik, worden geassocieerd met een verhoogd cardiovasculair risico1.

Onder fysiologische omstandigheden, wordt albumine gefilterd door de glomerulus en wordt bijna volledig geabsorbeerd in het buisvormige systeem2

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De onderzoeken zijn uitgevoerd volgens de richtlijnen die zijn uiteengezet in de gids voorzorg en gebruik van proefdieren (US National Institutes of Health Publication No. 85-23, herziene versie van 1996). Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante institutionele goedkeuringen (staatsbestuur Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz [LANUV] referentienummer 84-02.04.2012. A397).

1. voorbereiding van instrumenten, oplossingen en apparatuur

  1. Reconstitueer FITC-poly sucrose 70 met 0,9% steriel natriumchloride (NaCl) tot een eindconcentratie van 10 mg/mL (d.w.z. 100 mg in 10 mL NaCl).
  2. Dialy....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zoals afgebeeld in Figuur 2, is de methode om de glomerulaire permeabiliteit bij muizen te testen opgebouwd in drie fasen. De eerste fase wordt de voorbereidingsfase genoemd, waarin een urine katheter en een centrale veneuze katheter worden geplaatst. De tweede fase wordt de evenwichts fase genoemd, beginnend met een intraveneuze bolusinjectie van FITC-poly sucrose 70 en gevolgd door de continue infusie van FITC-polysucrose 70 voor 60 min. De laatste fase wor.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De gepresenteerde methode stelt de onderzoeker in staat om de glomerulaire permeabiliteit bij muizen op een zeer gevoelige manier te testen met behulp van een Tracer. Met deze methode, op korte termijn stijgingen van de glomerulaire permeabiliteit kan worden gediagnosticeerd met behulp van slechts kleine hoeveelheden urine. De meest kritieke stappen voor het succesvol beheersen van deze techniek zijn 1) ontwikkeling van handmatige expertise in muis chirurgie, vooral in de cannulatie van een centrale ader, 2) het plaatsen.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken Christina Schwandt, Blanka Duvnjak en Nicola Kuhr voor hun uitzonderlijke technische assistentie en Dr. Dennis Sohn voor zijn hulp bij de fluorescentie scan. Dit onderzoek werd gesteund door een subsidie van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP b18 tot L.C.R. en L.S. De Funder had geen rol in het studie ontwerp, gegevensverzameling en-analyse, besluit tot publicatie of voorbereiding van het manuscript.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Motic SMZ168 BLMoticSMZ168BLmicroscope for mouse surgery
KL1500LCDPulch and Lorenz microscopy150500light for mouse surgery
MicrofederschereBraun, AesculapFD100Rfine scissors
Durotip Feine ScherenBraun, AesculapBC210Rfor neck cut
Anatomische PinzetteBraun, AesculapBD215Rfor surgery 
PräparierklemmeAesculapBJ008Rfor surgery 
SeraflexSerag WiessnerIC108000silk thread
Ketamine 10%Medistaranesthesia
Rompun (Xylazin) 2%Bayeranesthesia
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mmPortex800/100/100Catheter
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mmPortex800/100/200Catheter
Harvard apparatus 11 PlusHarvard Apparatus70-2209syringe pump
BD Insyte AutoguardBD381823 urinary catheter
Multimode Detector DTX 880Beckman Coulterplate reader
384 well microtiterplateNunc262260384 well platte
Creatinine Assay KitSigma-AldrichMAK080to measure creatinine concentration
96 well plateNunc260836for creatinine assay 
FITC-labeled polysuccrose 70TBD ConsultancyFP70FITC-ficoll
Angiotensin IISigma-AldrichA9525used to test glomerular permeability
BP-98ASoftronfor blood pressure measurement
OTS 40.3040Medite01-4005-00heating plate for mouse surgery
Instillagel 6mLFarco-Pharma GmbHfor urinary catheter
ExactaAesculapGT415shaver

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chronic Kidney Disease Prognosis Consortium,, et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
  2. Mori, K. P., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Glomerular PermeabilityFITC Polysucrose 70Urine AnalysisFluorescence Plate ReaderUrinary CatheterizationJugular Vein CannulationSyringe Pump InfusionCreatinine NormalizationAngiotensin II StimulationMouse Kidney Disease

Related Articles