Methodenartikel

Monteren van moleculaire Shuttles Powered by omkeerbaar aangesloten Kinesins

DOI:

10.3791/59068

⸱

26 januari 2019

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een protocol om te bouwen van moleculaire/naar vliegveld, waar kinesin oppervlak-in acht genomen motor eiwitten voortbewegen kleurstof-gelabelde microtubuli. Zwakke interacties van de kinesins met het oppervlak kunnen hun omkeerbare gehechtheid aan het. Dit creëert een nanoschaal-systeem dat dynamische montage en demontage van de onderdelen met behoud van zijn functionaliteit vertoont.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol wordt beschreven hoe u van shuttles op moleculaire kinesin-aangedreven met een zwak en omkeerbare gehechtheid van de kinesins aan het oppervlak. In tegenstelling tot eerdere protocollen, in dit systeem, microtubuli werven kinesin motor proteïnen uit oplossing en leg ze op een oppervlak. De kinesins, op zijn beurt, vergemakkelijkt het glijden van de microtubuli langs het oppervlak vóór de desorbing terug in de bulk-oplossing, dus wordt beschikbaar opnieuw worden aangeworven. Deze continue montage en demontage leidt tot opvallend dynamisch gedrag in het systeem, zoals de totstandkoming van tijdelijke kinesin routes door het glijden van de microtubuli.

Verschillende experimentele methoden worden beschreven in dit experiment: UV-Vis spectrofotometrie wordt gebruikt voor het bepalen van de concentratie van stamoplossingen van reagentia, coverslips zullen eerst ozon en ultraviolet (UV) behandeld en vervolgens gesilaneerde voordat wordt gemonteerd in de cellen van de stroom en totale interne reflectie fluorescentie worden microscopie (TIRF) gebruikt voor het gelijktijdig beeld kinesin motoren en door samensmelting van filamenten microtubulus.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het bestuur van het gedrag van actieve nanosystems interacties hebben altijd gekenmerkt door langlevende, bijna onomkeerbaar obligaties1,2,3,4,5,6 ,7,8. Een goed bestudeerde voorbeeld hiervan is de microtubuli-kinesin systeem, waar glijden microtubuli worden aangedreven door onherroepelijk oppervlak-gebonden kinesin motoren1,2,3,4, 5. Systemen waarin de componenten omkeerbaar zijn verbonden met elkaar geweest studeerde theoretisch9,10 en verwezenlijkt de situering11,12, maar schalen van deze systemen tot de nanoschaal is uitdagend. Een van de belangrijkste redenen hiervoor is dat breken en hervormen van de banden tussen de onderdelen vaak vereist een grote verandering in de milieuomstandigheden. Hoewel dergelijke wijzigingen zijn doorgevoerd in de afgelopen13,14,15, zou zij vertrouwen op het systeem zelf te wijzigen in plaats van aan te passen aan zijn omgeving. Ontwerpen van moleculaire schaal systemen waarin onderdelen voortdurend verzamelen en reorganiseren in structuren zonder verstoring van het algemene klimaat waarin de experimenten plaatsvinden zal de deur openzetten voor de verkenning van een breed scala van dynamische gedrag 16 , 17.

Hier, we beschrijven en demonstreren van het gedetailleerd protocol voor het maken van een dynamisch montage en demontage van systeem werking op nanoschaal. Het systeem en de algemene werking geweest geïntroduceerde eerdere18: microtubulus filamenten worden aangedreven door sporen van omkeerbaar oppervlak-gebonden kinesin-1 motoren. Deze kinesin motor eiwitten worden gerekruteerd uit de oplossing helpen voortbewegen microtubuli vooruit, voordat de desorbing weer kort daarna. Eenmaal terug in oplossing, kunnen zij opnieuw voor het voortbewegen van een nieuwe microtubulus worden aangeworven. In de afgelopen13,14,verplicht15, de breaking en hervorming van obligaties milieu wijzigingen; daarentegen is het milieu van onze cel stroom blijft ongewijzigd, terwijl de kinesin motoren met het oppervlak interageren.

Dit protocol zal helpen interesse onderzoekers (1) visualiseren van alle stappen van het protocol, en (2) bijstaan bij het oplossen van dit soort assay. Het is afgeleid van de procedures die in Howard et al. 199319beschreven.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. oplossing voorbereiding

Let op: Drie van de in dit protocol (tolueen, dimethyldichlorosilane en dithiothreitol) gebruikte reagentia zijn zeer giftig. Raadpleeg de relevante veiligheidsinformatiebladen (MSDS) vóór gebruik. Delen van dit protocol moeten bovendien worden uitgevoerd onder een hoger beschermingsniveau, veiligheidsbril en twee sets van beschermende handschoenen dragen, zoals aangegeven. Tenzij anders geadviseerd, kunnen de experimenten worden uitgevoerd op lab banken tijdens het gebruik van alle de passende persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, handschoenen, laboratoriumjas, volledige lengte broek en schoenen van gesloten-teen).

Opmerking: De concentraties van de ATP, kinesin en microtubuli die worden gebruikt in dit protocol kunnen worden aangepast gezien de behoeften van elk experiment. Echter, als gewijzigd, zorg ervoor dat de eindconcentraties van de andere reagentia hetzelfde als in bepaalde blijven hieronder. Alle experimenten werden uitgevoerd bij kamertemperatuur, (~ 25 ° C).

  1. Voorbereiding van stamoplossingen
    Opmerking: Bereiden en aliquot de volgende oplossingen vooraf. Alle aliquots kunnen bereid worden bij kamertemperatuur (~ 25 ° C).
    1. BRB80 buffer
      Opmerking: De buffer voor de meeste van de oplossingen die in dit protocol worden gebruikt is BRB80. BRB80 kan worden bereid in grote hoeveelheden en opgeslagen in een vriezer van-20 ° C.
      1. Los 24.2 g van piperazine-N, N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (buizen) en 3.1 g van kaliumhydroxide (KOH) in 800 mL in gedeïoniseerd water om 800 mL 100 mM buizen. 100 mL 10 mM magnesiumchloride (MgCl2) en 100 mL 10 mM ethyleen glycol Dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing (EGTA) te krijgen een eindvolume van 1 L. Raising pH 8 met kaliumhydroxide (KOH) kan helpen bij de ontbinding van de buizen en de EGTA toevoegen.
        Opmerking: De eindconcentraties van chemische stoffen in de buffer van de BRB80 zijn 80 mM buizen, 1 mM MgCl2en 1 mM EGTA.
      2. Breng de pH van de buffer 6.9 met behulp van KOH en zoutzuur (HCl).
    2. ATP
      1. Bereid een 1 mL oplossing van 100 mM ATP in ultrazuiver water. Pipetteer de oplossing in 10 μL aliquots. De aliquots opslaan in een vriezer-80 ° C.
    3. GTP
      1. Bereid een 500 μL oplossing van 25 mM GTP in ultrazuiver water. Pipetteer de oplossing in 5 μl aliquots. De aliquots opslaan in een vriezer-80 ° C.
    4. MgCl2
      1. Bereid een 1 mL oplossing van 100 mM MgCl2 in ultrazuiver water. Pipetteer de oplossing in 10 μL aliquots. De aliquots opslaan in een vriezer van-20 ° C.
    5. Caseïne
      1. Weeg 1 g van droge caseïne en overbrengen naar een tube van 50 mL conische centrifuge. 35 mL BRB80 buffer aan de buis te ontbinden de caseïnepoeder toevoegen.
      2. Plaats de oplossing in een tumbler in een koude kamer te ontbinden 's nachts. De oplossing ziet er op dit punt, voor dik en viskeus is.
      3. Laat de buis rechtop in een koelkast 4 ° C te voorzien in een grote onopgeloste bosjes te regelen. Het supernatant overbrengen in een nieuwe buis.
      4. Draai de buis in een centrifuge op 1.000 x g tot pellet uit meer precipitaten. Nogmaals, het supernatant naar een nieuwe buis overbrengen.
      5. Herhaaldelijk Filtreer de oplossing met behulp van 0,2 micrometer (7 bar maximale druk) filters. De oplossing wordt dik, veel filters zal verstopt raken, dus Herhaal deze stap totdat het filter duidelijk is en unclogged.
      6. Bepaal de concentratie van de caseïne in de resulterende oplossing om met UV/Vis-spectrofotometrie, met behulp van caseïne van uitsterven coëfficiënt van 19 mM-1∙cm-1 op 280 nm20. Ervan uitgaande dat een moleculair gewicht van 23 kDa voor caseïne, Verdun de oplossing tot een concentratie van 20 mg∙mL-1 in BRB80.
      7. Pipetteer de oplossing in 20 μL aliquots en de aliquots opslaan in een vriezer van-20 ° C.
    6. D-Glucose
      1. Bereid een 1 mL oplossing van 2 M D-glucose in ultrazuiver water. Pipetteer de oplossing in 10 μL aliquots. De aliquots opslaan in een vriezer van-20 ° C.
    7. Glucose-oxidase
      1. Bereid een 1 mL oplossing van 20 mg∙mL-1 glucose-oxidase in BRB80. Pipetteer de oplossing in 10 μL aliquots. De aliquots opslaan in een vriezer van-20 ° C.
    8. Katalase
      1. Bereid een 1 mL oplossing van 0.8 mg∙mL-1 katalase in BRB80. Pipetteer de oplossing in 10 μL aliquots. De aliquots opslaan in een vriezer van-20 ° C.
    9. Dithiothreitol (DTT)
      Opmerking: Aangezien DTT iets vluchtige en giftige is, voer de volgende stappen uit onder een zuurkast.
      1. Bereid een 1 mL oplossing van 1 M DTT in ultrazuiver water verdund. Pipetteer de oplossing in 10 μL aliquots. De aliquots opslaan in een vriezer van-20 ° C.
    10. Paclitaxel
      1. Bereid een 1 mL oplossing van 1 mM paclitaxel verdund in DMSO. Pipetteer de oplossing in 10 μL aliquots. De aliquots opslaan in een vriezer van-20 ° C.
    11. Dimethylsulfoxide (DMSO)
      Opmerking: De DMSO gebruikt in deze experimenten is puur.
      1. Pipet 1 mL puur DMSO in 10 μL aliquots. De aliquots opslaan in een vriezer van-20 ° C.
    12. Creatine fosfaat
      1. Bereid een 1 mL oplossing van 0,2 M creatine fosfaat in ultrazuiver water. Pipetteer de oplossing in 10 μL aliquots. De aliquots opslaan in een vriezer van-20 ° C.
    13. Creatine phosphokinase
      1. Bereid een 1 mL oplossing van 200 units· L-1 creatine phosphokinase in ultrazuiver water. Pipetteer de oplossing in 10 μL aliquots. De aliquots opslaan in een vriezer van-20 ° C.
    14. Nikkel (II) sulfaat
      1. 500 mL van een oplossing van 50 mM nikkel (II) sulfaat in ultrazuiver water voor te bereiden. Bewaar de oplossing op kamertemperatuur (~ 25 ° C).
    15. Poly(Ethylene glycol)-blok-poly(propylene glycol)-blok-poly(ethylene glycol) (PEG-PPG-PEG) oplossing
      1. Weeg 2 mg PEG-PPG-PEG (nummer gemiddeld molecuulgewicht: 14.600 g∙mol-1)-NTA poeder op het gewicht van papier. PEG-PPG-PEG-NTA is de triblock-copolymeer matiemaatschappij met een nitrilotriacetic zuur (NTA) groep. Verwijzen naar de Tabel van materialen voor meer informatie over de PEG-PPG-PEG-NTA.
      2. Breng het poeder in een tube van 1,5 mL microcentrifuge. 1 mL van de stockoplossing van nikkel (II) sulfaat toevoegen aan de buis. Vortex tot poeder is opgelost en geen zichtbare bosjes blijven.
      3. Winkel voor maximaal een maand bij kamertemperatuur.
  2. Voordat u begint een experiment
    1. Vul een emmer met ijs.
    2. Neem één monster uit elk van de 13 reagentia beschreven in de punten 1.1.1 tot en met 1.1.13 boven en voeg ze toe aan de emmer, dus houden ze op het ijs. Ontdooi elk van de reagentia vóór gebruik.
  3. Microtubulus voorbereiding
    Opmerking: Microtubuli waren polymeervorm van een 20 μg hoeveelheid kleurstof-geëtiketteerden gelyofiliseerd tubuline. De golflengte van de excitatie van de kleurstof is van 647 nm.
    1. Voorbereiding van de microtubuli groei buffer
      1. Pipetteer 21,8 μL van BRB80 buffer in een klein (0,6 mL)-microcentrifuge buis. 1 μL van de stockoplossing van MgCl2 , 1 μL van de stockoplossing van GTP en 1.2 μL van de stockoplossing van DMSO toevoegen.
        Opmerking: De eindconcentraties van de reagentia in de buffer van de BRB80 zijn dus 4 mM MgCl2, 1 mM GTP en 5% (v/v) dimethylsulfoxide.
    2. Microtubuli polymerisatie
      1. Voeg 6,25 μL van microtubulus groei buffer direct in een hoeveelheid van 20 μg van gelabelde gelyofiliseerd tubuline. Vortex het afgepipetteerde deel voor 5 s bij 30 rps.
      2. Koel het afgepipetteerde deel op het ijs gedurende 5 minuten vóór het incuberen bij 37 ° C gedurende 45 minuten en gaat u verder met sectie 1.3.3.
    3. Microtubulus stabilisatie
      1. Voeg toe 5 μL van de oplossing aliquoted paclitaxel aan 490 μL van BRB80 buffer. Vortex de oplossing voor 10 s bij 30 rps.
      2. Zodra de 45 min van incubatie gedurende de microtubuli zijn up, toevoegen 5 μL van de gepolymeriseerde microtubulus-oplossing aan de BRB80/paclitaxel oplossing.
        Opmerking: Deze oplossing 100-fold verdunde, gestabiliseerd, microtubulus zal worden hierna MT100. Het kan tot maximaal 5 dagen worden gebruikt, en het kan worden verdund om te verkrijgen van de gewenste microtubulus-dichtheid voor elk experiment.
  4. Motility oplossing
    1. Enzymatische antifade, ATP regenereren systeem en ATP
      1. 9.0 μL van de aliquoted caseïne-oplossing toevoegen aan 291 μL van BRB80 buffer.
      2. Als de gewenste concentratie van het ATP voor het experiment lager dan 1 mM, Pipetteer 83 μL van de BRB80/caseïne-oplossing in een nieuwe 0,6 mL microcentrifuge buis is. Anderszins, Pipetteer 85 μL van die oplossing in een nieuwe 0,6 mL microcentrifuge buis.
      3. Voeg 1 μL van D-glucose, 1 μL van glucose-oxidase, 1 μL van katalase en 1 μL van DTT aan die buis.
        Opmerking: Deze chemische stoffen vormen een enzymatische antifade cocktail21 die photobleaching verminderen door het verwijderen van zal opgeloste zuurstof en blussen reactieve radicalen. Dit vermindert photobleaching en microtubulus desintegratie, veroorzaakt door de verlichting van de excitatie tijdens fluorescentie22,23imaging.
      4. Experimenten waarin de ATP-concentratie wordt gekozen aanzienlijk lager is dan 1 mM, voegt toe de volgende reagentia aan de oplossing voor het maken van een ATP-regenereren-systeem: 1 μL van de oplossing aliquoted creatine fosfaat en 1 μL van de aliquoted creatine phosphokinase de oplossing.
      5. 1 μL van de stockoplossing van ATP toevoegen aan de oplossing van de motiliteit. Flick of vortex het afgepipetteerde deel homogeen verdelen de chemische stoffen.
        Opmerking: De uiteindelijke concentratie van chemische stoffen in de oplossing zijn dus 10 μM paclitaxel, 0.5 mg·mL−1 caseïne, 20 mM D-glucose, 200 μg·mL−1 glucose oxidase, 8 μg·mL−1 katalase, dithiothreitol van 10 mM, 2 mM creatine fosfaat (als toegevoegd), 2 units· L−1 creatine phosphokinase (als toegevoegd), en 1 mM ATP. Deze oplossing zal worden hierna te noemen de motiliteit oplossing.
    2. Kinesin
      Opmerking: De voorraad kinesin-oplossing gebruikt bij deze experimenten is voorbereid door G. vrijgezel in het midden voor geïntegreerde nanotechnologieën op Sandia National Laboratories en beschikbaar gesteld onder een gebruikersovereenkomst (https://cint.lanl.gov/becoming-user/call-for-proposals.php). de buffer gebruikt hier bestaat uit 40 mM imidazool, 300 mM NaCl, 0,76 g· L-1 EGTA, 37.2 mg· L-1 EDTA, 50 g· L-1 sacharose, 0,2 mM TCEP en 50 μM Mg-ATP. Voor deze serie van experimenten, werd de structuur van de kinesin van de rkin430eGFP gebruikt. Dit is een kinesin bestaande uit de eerste 430 aminozuren van rat kinesin zware ketting gesmolten eGFP en een C-terminal zijn-tag op de staart domein24. Het kwam tot uitdrukking in Escherichia coli en gezuiverd met behulp van een Ni−NTA kolom. De concentratie van de stockoplossing GFP-kinesin was 1.8 ± 0,3 μM zoals bepaald door UV/Vis-spectrofotometrie, met behulp van een aanpassingscoëfficiënt vast die uitsterven voor GFP van 55 mM-1•cm-1 op 489 nm25, en rekening houdend met die kinesin is een dimeer.
      1. Bepalen de gewenste kinesin concentratie of oppervlak dichtheid voor het experiment. Deze concentratie is voor typische testen, 20 nM. Als de concentratie van de kinesin moet worden verdund moet meer dan een awreken, het verdund in een oplossing van BRB80 dat 0,5 mg·mL-1 voor caseïne bevat.
      2. Voeg 1 µL van kinesin oplossing aan de motiliteit oplossing om een eindconcentratie van ongeveer 20 nM.
    3. Microtubuli
      1. Voeg toe 10 μL van de MT100 oplossing bereid in punt 1.3 tot de oplossing van de motiliteit.
        Opmerking: Deze beweeglijkheid oplossing kan worden gebruikt voor maximaal 3 uur. Na die tijd verliest het antifade systeem zijn doeltreffendheid aangezien de glucose in de oplossing is uitgeput door de enzymatische reactie.

2. monteren van de stroom-cellen

  1. Wassen van de coverslips
    1. Voor stroom cellen, gebruikt u een grote dekglaasje aan (dimensie: 60 x 25 mm) en een kleine (afmetingen: 22 x 22 mm)19.
    2. Spoel alle coverslips tweemaal met ethanol en tweemaal met ultrazuiver water. Bewerk de ultrasone trillingen ten de coverslips in ultrazuiver water voor 5 min. ze drogen in een oven bij een temperatuur van 50-75 ° C.
    3. Met behulp van een UV/ozon schoner (Zie Tabel van materialen en aanwijzingen van de fabrikant), behandeling van één zijde van elke dekglaasje aan voor 15 min. deze stap kunt uitvoeren, bij kamertemperatuur (~ 25 ° C) en in normale atmosferische toestand (druk van 1 atm).
    4. Zorgvuldig zet elke dekglaasje aan naar de andere kant (met pincet) en UV/ozon behandelen die kant ook.
    5. Bewerk ultrasone trillingen ten de coverslips in ultrazuiver water opnieuw gedurende 5 minuten vóór het drogen ze opnieuw in de oven bij een temperatuur van 50-75 ° C.
  2. Behandeling van de coverslips om te schakelen van PEG-PPG-PEG coating
    Opmerking: De dimethyldichlorosilane en de tolueen gebruikt in dit deel van het protocol wordt zeer giftig, volgt onder een zuurkast, terwijl de volgende voorzorgsmaatregelen nemen: het dragen van twee sets van beschermende handschoenen en een lange mouwen shirt onder hun lab vacht. Plooi de randen van de handschoenen in de mouwen van het shirt zodat geen huid van de onderarmen rechtstreeks aan de chemische stoffen die in het geval van een morsen blootstaat. Beschermende bril.
    1. Verdun 25 mL van pure dimethyldichlorosilane in 475 mL tolueen. Elke dekglaasje aan in de dimethyldichlorosilane en tolueen oplossing onderdompelen gedurende 15 seconden.
    2. Wassen de coverslips tweemaal in tolueen en drie keer in methanol. Droog de coverslips met behulp van hydrofoor stikstof.
  3. Montage van coverslips in cellen van de stroom
    1. Zodra de coverslips droog zijn, snij een 2 x 2,5 cm stukje dubbelzijdig tape verticaal in twee 1 x 2,5 cm strepen.
    2. De grote dekglaasje aan zetten de Wisser van een delicate taak en plak de tape strepen in de lengte langs de randen van het dekglaasje aan een 1 x 2,5 cm ruimte tussen de stukjes tape te creëren.
    3. Plak de klein dekglaasje aan op de top van de strepen van de band tot het einde van de vergadering van de cel van de stroom.

3. stroomt de oplossingen in een flow-cel

  1. Stroom ongeveer 20 μL van de PEG-PPG-PEG-oplossing in de cel geassembleerde stroom. Het volume dat is gevlogen in de cel moet groot genoeg zijn om de kamer te vullen. In de volgende stappen gebruiken hetzelfde volume als de oplossingen uit te wisselen.
  2. Zorgen voor de oplossing van de PEG-PPG-PEG te vangen op het oppervlak voor 5 minuten. De PEG-PPG-PEG-oplossing met BRB80 buffer 3 keer langs stroomt de buffer in uitwisselen. De motiliteit oplossing uitmonden in de cel van de stroom.
  3. Het zegel van de randen van de cel van de stroom met vet om te voorkomen dat de verdamping, als de geplande experiment langer dan een uur is.
    Opmerking: De stroom-cel is nu klaar om te worden beeld.

4. imaging een stroom-cel

  1. Het uitvoeren van de beeldvorming die met behulp van een doelstelling-type totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) setup voor zowel de microtubuli, en de motoren van de kinesin (Zie Tabel van materialen).
    Opmerking: Hier, we gebruikten een microscoop met een 100 x / 1,49 de lens van de doelstelling van het numerieke opening, met behulp van twee lasers, één met een golflengte van 642 nm en een maximaal vermogen van 140 mW, en een ander met een golflengte van 488 nm en een maximumvermogen van 150 mW.
  2. Breng een druppel van immersie-olie op het doel.
  3. Plaats van de cel van de stroom op het platform van de Microscoop en brengen de doelstelling tot er contact tussen de olie op het doel en de stroom-cel is.
  4. Gebruik van de Microscoop vergrendeling cover systeem voor het blokkeren van alle laserlicht ontsnappen.
  5. Zet de laser en zich richten op het onderste oppervlak van de cel van de stroom. De microtubuli fluorescently zijn geëtiketteerd en opgewonden bij een golflengte van 647 nm. Zij zal worden beeld met behulp van een 642 nm laser terwijl een 488 nm laser wordt gebruikt voor het GFP-kinesin motoren.
  6. Het opnemen van de beelden of video's van belang. De kracht van de laser is meestal ongeveer 30 mW en een belichtingstijd van 50 ms voor zowel laser kanalen. Beelden kunnen opgenomen worden voor zolang er beweeglijkheid in de cel van de stroom.
    Opmerking: De laser verlichting is schadelijk voor het blote oog en kan onherstelbare schade veroorzaken. Gelieve ervoor te zorgen dat de verlichte gebied volledig met een ondoorzichtige deksel bedekt is.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze experimenten, gebruikten we een 1.000 keer verdunning van de microtubuli bereid in punt 1.3.2. De concentratie van de kinesin was 20 nM, en de ATP-concentratie is 1 mM. Imaging werd uitgevoerd met behulp van microscopie van TIRF. Zweefvliegen microtubuli werden afzonderlijk beeld van de kinesin motoren: microtubuli waren zichtbaar na excitatie met een 647 nm laser (Figuur 1, rood), en het GFP-kinesin was zichtbaar wanneer opgewekt met een 488 nm laser (Figuur 1, groen). De tijd tussen excitatie met het rood en groen licht was minder dan 1 s. De tijd tussen frames was dat 10 s. microtubuli weergegeven stabiele glijden. De gemiddelde microtubulus zweefvliegen snelheid was ongeveer 800 nm/s. De oppervlakte microtubulus-dichtheid was 400 mm-2. Sporen van kinesin (groen) bleek verder reiken dan het afsluitende einde van de microtubuli (rood) voor verschillende micrometers.

figure-results-1
Figuur 1: zweefvliegen microtubuli aangedreven door motoren van zwak oppervlak-gebonden kinesin. Als microtubuli vooruit, accumuleren ze kinesin motoren van de oplossing. Deze motoren afwisselend twee staten: single-gebonden aan de microtubuli, en dubbel-gebonden aan zowel de microtubulus en het oppervlak. Wanneer een dubbel gebonden motor het einde van de microtubuli bereikt, de motor is achtergelaten en langzaam desorbs van het oppervlak met een weg tarief van ongeveer 0,1 s-1. Dientengevolge, blijven routes van kinesin motoren achter de microtubuli. Bovenste rij: rood (microtubulus) kanaal. Middelste rij: groen (kinesin) kanaal. Onderste rij: combinatie van rood (microtubulus) en groene (GFP-kinesin) kanaal. Schaal bar: 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit werk presenteren wij een actieve nanoschaal systeem welke zelf zwak-bindende bouwstenen monteert voor de bouw van een eigen nummer. Zoals aangegeven in Figuur 1, glijden van microtubuli accumuleren kinesin motoren van oplossing en stort ze op het oppervlak. De motoren van de kinesin blijven in de nasleep van de microtubuli voor een korte periode van tijd voordat hij terugkeerde naar oplossing. Dus, in dit experiment, kinesin motoren alternatieve tussen 3 bepaalt:

(1) een microtubulus single-gebonden staat: dit is wanneer een kinesin eerst aan een microtubulus bindt. Het bestaat in evenwicht met staat (2).

(2) een dubbel-gebonden staat: in dit geval, een microtubulus single-gebonden kinesin ook bindt aan de oppervlakte via haar zijn-tag. Deze dubbel-gebonden staat voorziet microtubulus voortstuwing.

(3) een eenheidsstaat oppervlak-gebonden: een dubbel-gebonden kinesin die uit het einde van de microtubuli heeft gelopen en heeft nog niet uit het oppervlak gedesorbeerde is in deze toestand. Deze motoren kunnen worden waargenomen in Figuur 1 (gecombineerd en groene kanalen): ze breiden achter de staart van de microtubuli voor verschillende micrometers en vormen zijn afnemende spoor.

De meest kritische stap van dit protocol is de vorming van de hydrophobic oppervlakte op de dia. Niet alleen maakt het gebruik van gevaarlijke chemische stoffen, maar het maakt het ook mogelijk de PEG-PPG-PEG matiemaatschappij met de groep van de NTA jas van het oppervlak, waarmee vervolgens de kinesin omkeerbaar binden aan het oppervlak. Een andere belangrijke stap is de stroom cel afdichten met vet. Dit zorgt voor langdurige imaging zonder de vloeistof in de verdamping van de cel van de stroom.

De primaire wijzigingen aan deze techniek bestaan uit microtubulus concentratie, kinesin concentratie en ATP concentratie wijzigen. Microtubulus concentratie wijzigt, zal het aantal microtubuli glijden over het oppervlak. Kinesin concentratie wijzigt, zal het aantal kinesin moleculen die zich aan de microtubuli binden kan. Echter, verhoging van de concentratie van de kinesin boven de bedragen die al zijn gedefinieerd in dit experiment zou kunnen vergroten achtergrond fluorescentie, waardoor het moeilijker om te zien de kinesin paden achtergelaten zweefvliegen microtubuli. Ondertussen, verlaging van de concentraties van de ATP beneden 10 µM zal leiden tot aanzienlijke afname microtubulus zweefvliegen snelheid. Als dit effect gewenst is, is het noodzakelijk gebruik te maken van een ATP regenereren systeem bestaande uit creatine fosfatase en phosphokinase.

Een mogelijke beperking van deze techniek is dat, als gevolg van de grote actieve kinesin inhoud van het systeem, de ATP kan snel worden verbruikt, en experimenten minder dan een uur in bepaalde voorwaarden duren kunnen. Dit zou bijvoorbeeld het geval als een tweeledig hogere kinesin concentratie en vijfvoudige hogere microtubulus concentratie dan wat wordt gepresenteerd in dit protocol gebruikt.

In onze eerdere werk18, studeerde we de ruimtelijke verdeling van kinesin motoren langs de microtubuli, waaruit blijkt dat zweefvliegen microtubuli accumuleren kinesin motoren van oplossing, resulterend in een verhoging van de dichtheid van motoren langs de lengte van de Microtubulus. We vonden ook dat de microtubuli glijden stabiliteit aangetoond een niet-lineaire afhankelijkheid van de oplossing kinesin concentratie en microtubulus-snelheid.

Het gepresenteerde protocol effent de weg voor een efficiënter gebruik van eiwit motors in nanoschaal engineered systemen en voor verder onderzoek in het ontwerp van actieve nanosystems die in dynamisch evenwicht. Bovendien, de dynamische aard van dit systeem maakt het mogelijk om te dienen als een modelsysteem voor het bestuderen van zelfhelend en dynamische vervanging van moleculaire componenten, deel van de kloof tussen ontwikkelde en natuurlijke structuren te sluiten.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs mijn dankbaarheid uitspreken voor financiële steun uit hoofde van NSF grant NSF-DMR-1807514. De auteurs bedanken G. vrijgezel en V. Vandelinder voor het verstrekken van het GFP-kinesin-eiwit. Dit werk werd uitgevoerd, ten dele, bij het Center for geïntegreerde nanotechnologieën, een Office van wetenschap gebruiker faciliteit geëxploiteerd voor de Office of Science van ons Department of Energy (DOE) door Los Alamos National Laboratory (contract neen. DE-AC52-06NA25396) en Sandia National Laboratories (con-darmkanaal no. 97 DE-AC04-94AL85000). De auteurs bedanken Dr. Jennifer Neff en AllVivo Vascular voor hun gift van PEG-PPG-PEG matiemaatschappij met NTA.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
488 nm laserOmicron LaserageLuxX 488-150
642 nm laserOmicron LaserageLuxX 642
CaseïneSigmaC7078-500G
Catalase uit runderleverSigmaC40-500MG
CreatinefosfaatSigmaP-7936
CreatinefosfokinaseSigmaC3755-500UN
D-GlucoseSigmaG2133-50KU
Dichloordimethylsilaan-oplossingSigma40140-25MLToxisch
DimethylsulfoxideSigma34869-100ML
DithiothreitolSigmaD0632-5GToxisch
Eclipse TINikon Instruments
eGFP rkin430Verstrekt door George Bachand
EGTASigmaE4378-25G
Falcon 50 ml conische centrifugeerbuisjesFisher Scientific14-959-49A
GlucoseoxidaseSigmaG0543-10KU
GuanosinetrifosfaatSigmaG8877-10MG
Kimwipes Delicate Task WipersSigma Pharmaceuticals8089
MagnesiumchlorideSigmaM1028-100ML
MethanolFisher ChemicalA412Toxisch
Milli-Q waterzuiveringssysteemMillipore Corporation
NikkelsulfaatSigma656895-50G
PaclitaxelSigmaT1912-5MG
PIPESSigmaP-6757
Pluronic F108-NTAVerstrekt door Jennifer Neff en AllVivo VascularPEG-PPG-PEG-NTA
Pluronic F-108Sigma542342-250GPEG-PPG-PEG
Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge TubesFisher Scientific21-403-190
TolueenFisher ChemicalT324Toxisch
Tubuline, HiLyte647-gelabeldCytoskeleton, Inc.TL670M
UV Ozone ProcleanerBioForce NanosciencesPC440
Whatman Puradisc spuitfiltersSigmaWHA67840402
Zyla 4.2 sCMOS-cameraAndor TechnologysCMOS 4.2

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vale, R. D., Reese, T. S., Sheetz, M. P. Identification of a Novel Force-Generating Protein, Kinesin, Involved in Microtubule-Based Motility. Cell. 42, 39-50 (1985).
  2. Ray, S., Meyhofer, E., Milligan, R. A., Howard, J. Kinesin Follows the Microtubule's Protofilament Axis. Journal of Cell Biology. 121, 1083-1093 (1993).
  3. Dennis, J. R., Howard, J., Vogel, V. Molecular shuttles: directed motion of microtubules along nanoscale kinesin tracks. Nanotechnology. 10, 232-236 (1999).
  4. Kawamura, R., Kakugo, A., Osada, Y., Gong, J. P. Microtubule bundle formation driven by ATP: the effect of concentrations of kinesin, streptavidin and microtubules. Nanotechnology. 21, 145603(2010).
  5. Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. Kinesin-1 Expressed in Insect Cells Improves Microtubule in Vitro Gliding Performance, Long-Term Stability and Guiding Efficiency in Nanostructures. IEEE Transactions on Nanobioscience. 15, 62-69 (2016).
  6. Whitesides, G. M., Grzybowski, B. Self-assembly at all scales. Science. 295, 2418-2421 (2002).
  7. Ringler, P., Schulz, G. E. Self-assembly of proteins into designed networks. Science. 302, 106-109 (2003).
  8. Boncheva, M., et al. Magnetic self-assembly of three-dimensional surfaces from planar sheets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 3924-3929 (2005).
  9. England, J. L. Dissipative adaptation in driven self-assembly. Nature Nanotechnology. 10, 919(2015).
  10. Fialkowski, M., et al. Principles and Implementations of Dissipative (Dynamic) Self-Assembly. The Journal of Physical Chemistry B. 110, 2482-2496 (2006).
  11. Boncheva, M., Whitesides, G. M. Self-healing systems having a design stimulated by the vertebrate spine. Angewandte Chemie-International Edition. 42, 2644-2647 (2003).
  12. Rubenstein, M., Cornejo, A., Nagpal, R. Programmable self-assembly in a thousand-robot swarm. Science. 345, 795-799 (2014).
  13. Plaisted, T. A., Vakil Amirkhizi, A., Arbelaez, D., Nemat-Nasser, S. C., Nemat-Nasser, S. Self-healing structural composites with electromagnetic functionality. Proceedings of the Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers. 5054, 372-381 (2003).
  14. Ghosh, S. K. Self-Healing Materials. Ghosh, S. K. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Weinheim. 1-28 (2009).
  15. Burnworth, M., et al. Optically healable supramolecular polymers. Nature. 472, (2011).
  16. Bachand, G. D., Spoerke, E. D., Stevens, M. J. Microtubule-Based Nanomaterials: Exploiting Nature's Dynamic Biopolymers. Biotechnology and Bioengineering. 112, 1065-1073 (2015).
  17. Gao, Y. W., Lei, F. M. Small scale effects on the mechanical behaviors of protein microtubules based on the nonlocal elasticity theory. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387, 467-471 (2009).
  18. Lam, A. T. -C., Tsitkov, S., Zhang, Y., Hess, H. Reversibly Bound Kinesin-1 Motor Proteins Propelling Microtubules Demonstrate Dynamic Recruitment of Active Building Blocks. Nano Letters. 18, 1530-1534 (2018).
  19. Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules. Methods in Cell Biology. 39, 137-147 (1993).
  20. Huppertz, T., Fox, P. F., Kelly, A. L. Proteins in Food Processing (Second Edition). Yada, R. Y. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 49-92 (2018).
  21. Wettermark, G., Borglund, E., Brolin, S. E. A regenerating system for studies of phosphoryl transfer from ATP. Analytical Biochemistry. 22, 211-218 (1968).
  22. Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination. Journal of Cell Biology. 107, 1011-1024 (1988).
  23. Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -H., Vogel, V. Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices. Nanotechnology. 15, S540-S548 (2004).
  24. Rogers, K. R., et al. KIF1D is a fast non-processive kinesin that demonstrates novel K-loop-dependent mechanochemistry. EMBO Journal. 20, 5101-5113 (2001).
  25. Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 73, 2782-2790 (1997).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Door kinesine aangedreven moleculaire shuttlesreversibele kinesine bindingmicrotubuli glijassaytotale interne reflectie fluorescentieUV ozonbehandelingassemblage van de flowcelmicrotubuli polymerisatieGFP kinesine imagingbereiding van motiliteitsoplossingsilanisering van dekglasplaatjes

Gerelateerde artikelen