Methodenartikel

Gist als chassis voor het ontwikkelen van functionele assays voor het bestuderen van menselijke P53

DOI:

10.3791/59071

⸱

4 augustus 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Mutagenesis and Cancer Prevention Unit, Ospedale Policlinico San Martino, 2Department CIBIO, University of Trento, 3LAQV/REQUIMTE, Laboratory of Microbiology, Faculty of Pharmacy, University of Porto

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier zijn vier protocollen voor het construeren en exploiteren van gist Saccharomyces cerevisiae reporter stammen te bestuderen van menselijke P53 trans activatie potentieel, effecten van de verschillende kanker-geassocieerde mutaties, co-uitgedrukt interactie eiwitten, en de effecten van specifieke kleine moleculen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De bevinding dat het bekende zoogdier P53 eiwit kan fungeren als een transcriptiefactor (TF) in de gist S. cerevisiae heeft toegestaan voor de ontwikkeling van verschillende functionele assays om de effecten van 1) bindingsplaats te bestuderen [d.w.z., Response element (re)] sequentie varianten op P53 transactiveringsspecificiteit of 2) TP53 mutaties, co-uitgedrukt cofactoren of kleine moleculen op P53 trans activatie activiteit. Er zijn verschillende basis-en translationele onderzoekstoepassingen ontwikkeld. Experimenteel, deze benaderingen benutten twee belangrijke voordelen van het gist model. Aan de ene kant maakt het gemak van genoom bewerking een snelle constructie van kwalitatieve of kwantitatieve verslaggever systemen mogelijk door het exploiteren van isogene stammen die alleen verschillen op het niveau van een specifieke P53-RE om sequentie-specificiteit van P53 afhankelijke trans. Aan de andere kant maakt de beschikbaarheid van gereguleerde systemen voor buitenbaarmoederlijke P53 expressie de evaluatie van trans activatie mogelijk in een breed scala aan eiwit expressie. Beoordeeld in dit rapport zijn uitgebreid gebruikte systemen die zijn gebaseerd op Color reporter genen, Luciferase, en de groei van gist ter illustratie van hun belangrijkste methodologische stappen en kritisch beoordelen hun voorspellende vermogen. Bovendien kan de extreme veelzijdigheid van deze benaderingen gemakkelijk worden benut om verschillende TFs te bestuderen, waaronder P63 rooms en P73, die andere leden zijn van TP53 genfamilie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transcriptie is een uiterst complex proces waarbij dynamische, ruimtelijke en temporele organisatie van transcriptiefactoren (TFs) en cofactoren voor de werving en modulatie van RNA-polymerasen op chromatine-gebieden in reactie op specifieke stimuli1 . De meeste TFs, met inbegrip van de menselijke P53 tumor suppressor, herkennen van specifieke CIS-Acting elementen in de vorm van DNA-sequenties genaamd Response Elements (REs), die bestaan uit enkele (of meerdere) unieke motieven ~ 6-10 nucleotiden lang. Binnen deze motieven kunnen individuele posities verschillende graden variabiliteit2vertonen, meestal samengevat op positie gewicht matrices (PWM) of logo's3,4.

De gist S. cerevisiae is een geschikt modelsysteem voor het bestuderen van verschillende aspecten van menselijke eiwitten door middel van complementatie assays, ectopische expressie en functionele assays, zelfs wanneer een ortholoog gist gen niet aanwezig is5, 6 , 7. vanwege het evolutionaire behoud van basale componenten van het transcriptionele systeem8, kunnen veel menselijke TFs (wanneer ectopisch uitgedrukt in gistcellen) de uitdrukking van een reporter-gen moduleren door te handelen via organisatoren die zijn ontworpen om passende REs bevatten. De transcriptie modelsysteem gepresenteerd hier voor menselijke P53 wordt gekenmerkt door drie belangrijke variabelen waarvan de effecten kunnen worden gedifferentieerd: 1) de modaliteit van expressie en type van P53, 2) de RE sequentie die P53-afhankelijke transcriptie bestuurt, en 3) het type Reporter gen (Figuur 1a).

Met betrekking tot de modaliteit van P53 uitdrukking, stelt S. cerevisiae de keuze van de niet-behoudende, onderdeelbare of constitutieve promotoren9,10,11toe. In het bijzonder, de induceerbare cytochromen GAL1 promotor maakt basale (met behulp van raffinose als een koolstofbron) of variabele (door het veranderen van de hoeveelheid galactose in de media) uitdrukking van een tf in gist. In feite vertegenwoordigt de fijnafstemmingen een kritische ontwikkeling voor het bestuderen van niet alleen P53 zelf, maar ook andere P53 familie eiwitten12,13.

Met betrekking tot het type van REs het beheersen van de P53-afhankelijke expressie, S. cerevisiae laat de bouw van verschillende reporter stammen bezitten unieke verschillen in de re van belang in een anders isogene achtergrond. Dit doel wordt bereikt door een aanpassing van een bijzonder veelzijdige genoom Editing aanpak ontwikkeld in S. cerevisiae, genaamd delitto perfetto12,14,15,16.

Bovendien kunnen verschillende reporter genen (d.w.z. URA3, HIS3 en ADE2) worden gebruikt om de transcriptionele activiteiten van Human TFs in S. cerevisiaekwalitatief en kwantitatief te evalueren, elk met specifieke functies die kunnen worden afgestemd op experimentele behoeften17,18,19,20,21. De uitdrukking van deze reporter genen kent respectievelijk uracil, histidine en adenine prototrofie. De URA3 reporter staat niet toe dat de groei van cellen in de aanwezigheid van 5-FOA ook, en dus het kan worden tegengeselecteerd. Het ADE2 reporter systeem heeft als voordeel dat, naast nutritionele selectie, het de identificatie mogelijk maakt van gistcellen die wild type uitdrukken (d.w.z. functioneel op ADE2 expressie) of Mutant (D.W.Z.niet functioneel op ADE2 ) P53 uit de kolonie kleur.

Bijvoorbeeld, gistcellen die het gen ADE2 uitdrukken genereren normaliter witte kolonies op platen met beperkende hoeveelheden adenine (2,5-5,0 mg/L), terwijl die die slecht zijn of niet transcriberen, op dezelfde plaat verschijnen als kleiner rood (of roze) Kolonies. Dit is te wijten aan accumulatie van een intermediair in de adenine biosynthetische Pathway (d.w.z. P-ribosylamino-imidazol, die eerder amino-imidazol ribotide of lucht genoemd is), die wordt omgezet in een rood pigment. Het kwalitatieve ADE2 reporter gen is sindsdien vervangen door de kwantitatieve Firefly Photinus lichtmot (LUC1)12,22. Meer recentelijk is de ADE2 reporter gecombineerd met de lacz reporter in een eenvoudig te scoren, semi-kwantitatieve, dubbele reporter assay die kan worden benut om P53 mutanten te classificeren op basis van hun rest niveau van functionaliteit 23.

Fluorescerende verslaggevers zoals EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) of dsred (discosoma SP. rood fluorescerende proteïne) zijn ook gebruikt voor de kwantitatieve evaluatie van de transactiveringsactiviteit in verband met alle mogelijke missense-mutaties in de TP53 Codeer volgorde24. Tot slot heeft de kans om tunable promotors te combineren voor P53 allel expressie met isogene giststammen die verschillen voor het re en/of reporter gen geleid tot de ontwikkeling van een data matrix die een verfijnde classificatie genereert van kanker-geassocieerde en kiembaan Mutant P53 allelen25,26,27.

De hierboven beschreven benaderingen worden gebruikt om de transcriptionele activiteit van het P53-eiwit te meten. Echter, de uitdrukking van wild-type P53 in de gist S. cerevisiae28 en schizosaccharomyces pombe29 kan leiden tot groeiachterstand, die is geassocieerd met celcyclus arrestatie28,30 of celdood31. In beide gevallen wordt de remming van de gist groei veroorzaakt door een hoge P53 expressie en gecorreleerd met mogelijke transcriptionele modulatie van endogene gist genen die betrokken zijn bij celgroei. Ter ondersteuning van deze hypothese, de verlies-van-functie Mutant P53 R273H niet interfereren met gist celgroei wanneer uitgedrukt op vergelijkbare niveaus als wild-type P5332. Omgekeerd veroorzaakte de uitdrukking in gist van de giftige Mutant P53 V122A (bekend voor een hogere transcriptionele activiteit in vergelijking met wild-type P53) een sterkere groei remmende werking dan wild type P5332.

Bovendien werd aangetoond dat Human MDM2 in staat was om de menselijke P53 transcriptionele activiteit in gist te remmen, de ubiquitinatie en daaropvolgende afbraak33te bevorderen. Dienovereenkomstig werd het vermogen van Human MDM2 en mdmx voor de remming van P53-geïnduceerde gist groeiremming aangetoond32,34. In een aanvullend onderzoek werd een correlatie tussen P53 transcriptionele activiteit en actine uitdrukkings niveaus vastgesteld, met de identificatie van een vermoedelijke P53 re stroomopwaarts op het ACT1 gen in gist32. Consequent, actine expressie werd versterkt door wild-type P53 en nog meer door P53 V122A, maar niet door Mutant P53 R273H. Omgekeerd daalde de actine expressie door P53 in de co-aanwezigheid van P53 remmers MDM2, MDMX of pifithrin-α (een kleine molecuul remmer van P53 transcriptionele activiteit), in overeenstemming met de resultaten op basis van de gist groei test. Belangrijk, deze resultaten vastgesteld een correlatie tussen P53-geïnduceerde groeiremming en de mate van haar activiteit in gist, die ook is uitgebuit om te identificeren en bestuderen van kleine moleculen modulerende P53 functies28,34 , 35.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. bouw van ADE2 of LUC1 reporter giststammen met een specifieke re (yafm-re of ylfm-re)

  1. Streak een yafm-icore of ylfm-icore stam12,14 (icore = i, ISCE-I endonuclease onder GAL1 promotor; CO = teller selecteerbaar URA3; RE = reporter KanMX4 het verlenen van kanamycine resistentie; Tabel 1) van een 15% glycerol bestand opgeslagen bij-80 °C op een YPDA agar plaat (tabel 2). Laat het groeien voor 2-3 dagen bij 30 °C.
  2. Neem één gist kolonie van de verse plaat (niet meer dan 3 weken oud) en plaats deze in een kleine kolf met 5 mL YPDA (tabel 2). Inincuberen bij 30 °C 's nachts, schudden bij 150-200 rpm.
  3. De volgende dag, om alle sporen van dextrose te verwijderen, pellet de cellen voor 2 min bij 3.000 x g en gooi de supernatant door inversie van de buis.
    Opmerking: Voer bij kamertemperatuur (RT) alle centrifugaties in dit protocol uit.
  4. Respendeer de celpellet in 30-50 mL voorverwarmde CM (complete media) met galactose (tabel 2) en inbroed voor 4 uur bij 30 °c, schudden bij 150-200 rpm (noodzakelijk voor de inductie van I-SCEI).
  5. Centrifugeer de cellen 2 min bij 3.000 x g en gooi het supernatant door de inversie van de buis.
  6. Respendeer de celpellet in 30-50 mL steriel water. Herhaal stap 1,5.
  7. Respendeer de celpellet in 10 mL steriel water. Herhaal stap 1,5.
  8. Respendeer de celpellet in 5 mL steriele LiAcTE (tabel 3), een Ionische oplossing die de DNA-opname bevordert. Herhaal stap 1,5.
  9. Respendeer de celpellet in 250 μL steriele LiAcTE en breng de cellen over in een buis van 1,5 mL. Herhaal stap 1,5 en rebreng de celpellet in 300-500 μL steriele LiAcTE.
  10. Tijdens de Wassers, denatureren een 10 mg/mL oplossing van zalm sperma DNA drager voor 10 min bij 100 ° c en chill onmiddellijk op ijs om het te behouden als één-streng DNA.
  11. Voeg in een aparte tube van 1,5 mL 500 picomoles toe van het gewenste oligonucleotide (tabel 3), 5 μl van het DNA van de gekookte zalm sperma drager, 300 μL steriele LIACTE Peg (tabel 3) en 50 μL van de suspensie voor gistcellen (vanaf stap 1,9).
  12. Vortex de buizen voor 10 s te mengen en inbroed gedurende 30 min bij 30 ° c, schudden bij 150-200 rpm. Plaats de 1,5 mL buisjes aan de zijkant om de gunst te schudden.
  13. Hitteschok de gistcellen gedurende 15 minuten bij 42 °C in een verwarmingsblok en centrifugeer vervolgens de cellen gedurende 20 sec. bij 10.000 x g. Verwijder de supernatant en rebreng de cellen in 1 mL steriel water.
  14. Verdeel 100 μL van de celsuspensie op de YPDA agar-plaat en incuberen (ondersteboven) gedurende 1 dag bij 30 °C. Om ervoor te zorgen dat goed gescheiden kolonies worden verkregen, spreidt u ook 100 μL van een 1:10 verdunning uit.
  15. De volgende dag, replica plaat met behulp van steriele velvets op CM agar plaat met dextrose en 5-FOA (tabel 2). Overweeg een tweede replica plaat op een nieuwe plaat als veel cellen worden overgebracht (dat wil zeggen, sommige groei van URA3 cellen).
  16. Drie dagen later, replica plaat op niet-selectieve YPDA en YPDA met G418 (een aminoglycoside antibioticum vergelijkbaar met kanamycine) agar platen (tabel 2), het markeren van elke plaat om hun latere vergelijking te vergemakkelijken. Incuberen de platen 's nachts op 30 °C.
  17. De volgende dag, Identificeer de kandidaat reporter stammen uit kolonies die G418-gevoelig maar groeien op YPDA platen (bijvoorbeeld yLFM-of yAFM-RE kolonies). Streep de geïdentificeerde kolonies (3-6 kolonies) op een nieuwe YPDA plaat om enkele kolonie isolaten te verkrijgen en laat ze groeien voor 2 dagen bij 30 °C.
  18. Patch enkele gist kolonies op een YPDA plaat om de kolonies te isoleren voor verdere analyses. Na 24 uur bij 30 °C, test ze door replica plating op een YPGA agar plaat (tabel 2) die de groei van Petite mutanten (d.w.z. respiratoire-deficiënte mutanten) voorkomen. Op hetzelfde moment, replica plaat op een nieuwe YPDA agar plaat.
  19. Test de juiste patches (d.w.z. groei op YPDA-en YPGA-agar-platen; 1-3 kolonies) uit stap 1,18 voor de aanwezigheid van een juiste oligonucleotide-integratie door kolonie PCR. Monteer een reactiemix door 5 μL van 10x PCR-buffer (1,5 mM MgCl2) toe te voegen, 2 μl van 10 picomoles/μL primers (tabel 3), 4 μl 2,5 mm dntps, 0,25 μL van 5 U/μL Taq polymerase en water tot een eindvolume van 50 μL. Vermenigvuldig de reactiemix voor het aantal gist kolonies dat moet worden gescreend en aliquot 50 μL in elke PCR-buis. Voeg met behulp van een pipet een zeer kleine hoeveelheid gistcellen van de YPDA agar-plaat toe aan een enkele PCR-reactiemix.
  20. Voer de PCR-reactie uit met het volgende programma: 94 °C gedurende 8 minuten, gevolgd door 35 cycli denaturatie gedurende 1 minuut bij 94 °C, primers gloeien gedurende 1 minuut bij 55 °C en verlenging voor 2 minuten bij 72 °C.
  21. Nadat de reactie is voltooid, laadt u een aliquot van de PCR-reactie (ongeveer een tiende van het volume) op een agarose-gel om de juiste maat te controleren (~ 500 BP).
  22. Volg het PCR-product na zuivering met een commerciële Kit om de integratie van de gewenste RE-sequentie te bevestigen met behulp van dezelfde primers van stap 1,19.
  23. Na de validatie van de juiste volgorde, maak een 15% glycerol voorraad yAFM-RE of yLFM-RE stam cultuur (in YPDA) en opslaan bij-80 °C.

2. evaluatie van P53 eiwit transactiveringsvermogen met behulp van de kwalitatieve ADE2 gist assay op basis van kleur

  1. Herhaal de stappen 1,1 en 1,2 met behulp van de yAFM-RE stam (tabel 1).
  2. De dag daarna verdunt u de celkweek (1:10) in 30-50 mL voorverwarmde YPDA en blijft u door schudden tot 30 °C inbrokkelen tot de OD600nm 0,8-1,0 (~ 2 uur) bereikt.
  3. Herhaal stap 1.5-1.10.
  4. Voeg in een aparte 1,5 mL-buis 300-500 ng gist P53 (of controle) expressie vector (tabel 4), 5 μl van de gekookte zalm sperma-DNA drager, 300 μL steriele LIACTE PEG en 50 μL gist celsuspensie toe.
  5. Herhaal de stappen 1,12 en 1,13 maar hervat de celpellet in 300 μL steriel water.
  6. Verdeel 100 μL van de celsuspensie op synthetische selectieve (voor P53 expressie-of besturings vector) platen die dextrose als koolstofbron bevatten en een grote hoeveelheid adenine (tabel 2), en incuberen (ondersteboven) bij 30 °c gedurende 2-3 dagen.
  7. Streak enkele gist transformant kolonies (2-6 strepen per plaat) op een nieuwe selectieve plaat en laat ze groeien 's nachts op 30 ° c.
  8. De dag na, met behulp van steriele velvets replica plaat op nieuwe selectieve platen die het mogelijk maken voor de beoordeling van de kleur fenotype (dat wil zeggen, platen met dextrose als koolstofbron, maar het beperken van de hoeveelheid adenine; Tabel 2). Inincuberen de platen ondersteboven bij 30 °C gedurende 3 dagen. Als u de temperatuurgevoeligheid van P53 eiwit wilt evalueren, inbroed dan bij drie verschillende temperaturen gedurende 3 dagen: 24 °C, 30 °C en 37 °C.
    Notes: dezelfde streak kan meerdere malen in een replica worden geplateerd.
  9. Voor het evalueren van het P53 eiwit transactiveringsvermogen, Controleer het op kleur gebaseerde fenotype van gist kolonies en vergelijk het P53 eiwit fenotype met betrekking tot P53 wild-type en lege Vector fenotypes.

3. evaluatie van P53 eiwit transactiveringsvermogen met behulp van de kwantitatieve luminescentie LUC1 gist assay

  1. Transformeer gistcellen met P53 (of Control) expressie vectoren (tabel 4) met behulp van de op Liac gebaseerde methode zoals beschreven in Protocol 2. Gebruik yLFM-RE stam (tabel 1).
  2. Patch enkele transformanten op een nieuwe selectieve plaat met de hoge hoeveelheid adenine bevattende glucose als de koolstofbron en laat ze groeien bij 30 °C 's nachts. Maak 5-7 verschillende patches voor elk transformatietype.
  3. Na nachtelijke groei, regenereren een kleine hoeveelheid gistcellen met behulp van een steriele tandenstoker of pipetpunt van de plaat in synthetische selectieve medium met dextrose of raffinose als de koolstofbron (200 μL eindvolume in een transparante 96 goed plaat, met een ronde of vlakke bodem). Als het experiment induceerbare cytochromen P53 expressie vereist, voeg galactose toe aan het raffinose medium om het inductie niveau te moduleren (tabel 2).
    Opmerking: deze celsuspensies moeten een OD600nm hebben van ongeveer 0,4 en niet hoger dan 1.
  4. Meet de extinctie van elk goed bij OD600nm na een Induceerbaar P53 expressie (4-8 h bij 30 °c met 150-200 rpm schudden) met behulp van een multilabel plaat lezer. Zorg ervoor dat de celsuspensies homogeen zijn door elke put te mengen met een meerkanaalspipet.
  5. Breng 10-20 μL celsuspensie van de doorzichtige 96 goed plaat over in een witte 384 (of 96) goed plaat en meng met een gelijk volume (10-20 μL) lysisbuffer. Inincuberen voor 10-15 min bij RT op een shaker (150-200 rpm) om permeabilization van de cel naar de plaats substraat te bereiken.
  6. Voeg 10-20 μL Firefly plaats substraat toe en meet de licht eenheden (LU) door een multi-label plaat lezer.
  7. Om P53 eiwit transactiveringsvermogen te bepalen, Normaliseer de LUs van elke put naar de corresponderende OD600nm (relatieve licht eenheid, rlu). Bereken de gemiddelde RLU en standaarddeviatie van 3-4 patches van gist transformant kolonies.
  8. Vergelijk de P53-eiwit transactiveringsgegevens met betrekking tot P53 wild-type en lege Vector, hetzij door de waarden die zijn verkregen met de lege Vector af te trekken of door te delen door de waarden die zijn verkregen met de lege Vector (d.w.z. computer vouw van inductie).
    Opmerking: de P53 trans activatie-activiteit kan ook worden geëvalueerd met dezelfde experimentele opstelling in de aanwezigheid van P53-interactie eiwitten (d.w.z. MDM2 en MDMX) en/of met inbegrip van medicamenteuze behandeling.

4. evaluatie van P53 eiwit groeiremming met behulp van de gist fenotypic assay

  1. Transformeer gistcellen met P53/MDM2/MDMX (of Control) expressie vectoren (tabel 4) met behulp van de op Liac gebaseerde methode zoals beschreven in punt 2. Gebruik de CG379 stam (tabel 1) en spreid gist transformanten op minimale selectieve platen (tabel 2).
  2. Groei getransformeerde cellen in minimaal selectief medium (tabel 2) tot ongeveer 1 od600nm.
  3. Verdun gistcellen tot 0,05 OD600nm in het selectieve inductie medium (tabel 2) en voeg desgewenst een gekozen kleine molecule toe aan de juiste concentratie (of alleen oplosmiddel) om de werkzaamheid ervan te testen bij het reactiveren van mutant P53 of bij het remmen van MDM2- /MDMX-P53 interacties.
  4. Incuberen cellen bij 30 °C onder continu orbitaal schudden (200 rpm) gedurende ongeveer 42 uur (tijd vereist door negatieve controle gist om de mid-log-fase te bereiken, ongeveer 0,45 OD600nm).
  5. Spot 100 μL aliquots van gist celculturen op minimale selectieve platen (tabel 2).
  6. Incuberen gedurende 2 dagen bij 30 °C.
  7. Meet de gist groei door het aantal kolonies te tellen dat is verkregen in de 100 μL kweek druppels (kolonie vormende eenheid, CFU tellingen). Bereken bijvoorbeeld het Mutante reactiverende effect van verbindingen gezien de groei van wild-type P53 die gist uitdrukken als het maximaal mogelijke effect (ingesteld op 100%), terwijl de groei van cellen die Mutant P53 (maar blootgesteld aan oplosmiddel controle) representeert het nulniveau van reactivering.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aanleg van ADE2 of een LUC1 reporter giststammen

Dedelitto perfettoapproach12,14,15,16 is aangepast om de bouw van P53 reporter giststammen mogelijk te maken (Figuur 1b

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Op gist gebaseerde assays zijn nuttig gebleken om verschillende aspecten van P53 eiwit functies te onderzoeken. Deze assays zijn bijzonder gevoelig voor het evalueren van P53 transactiveringspotentieel naar varianten van RE target sites, met inbegrip van de evaluatie van functionele polymorfismen. Het gebruik van kleuren verslaggevers en miniaturisatie van de plaats-assay resulteren in kosteneffectieve en relatief schaalbare assays. Ook is de groeiremmende test mogelijk vatbaar voor gebruik in de chemische bibliotheek sc...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken de Europese Unie (FEDER funds POCI/01/0145/FEDER/007728 via programa Operacional Factores de Competitividade-concurreren) en nationale fondsen (FCT/MEC, Fundação para a Ciência e Tecnologia en Ministério da Educação e Ciência) onder de Partnerschapsovereenkomst PT2020 UID/QUI/50006/2019 en de projecten (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014-POCI-01-0145-FEDER-016581. FCT Fellowships: SFRH/BD/96189/2013 (v. Gomes). Dit werk werd gesteund door de Compagnia S. Paolo, Turijn, Italië (project 2017,0526) en Ministerie van volksgezondheid (project 5x1000, 2015 en 2016; huidig onderzoek 2016). We danken Dr. Teresa López-Arias Montenegro (Universiteit van Trento, experimentele wetenschappen onderwijs laboratoria) ten zeerste voor hulp bij video-opnames.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
L-AsparaginezuurSIGMA11189
QIAquick PCR-zuiveringsetQIAGEN28104
L-FenylalanineSIGMA78019
PeptonBD Bacto211677
Gist ex+A2:C26tractBD Bacto212750
Difco giststikstofbasis zonder aminozuren en ammoniumsulfaatBDTM233520
LitiumacetaatdihydraatSIGMA517992
Bacteriologische agar type ABiokar DiagnosticsA1010 HA
G418 disulfaat zoutSIGMAA1720
AmmoniumsulfaatSIGMAA2939
L-ArgininemonohydrochlorideSIGMAA5131
Adenine hemisulfaat zoutSIGMAA9126
Passieve lysisbuffer 5xPROMEGAE1941
Bright-Glo luciferase-assaysysteem PROMEGAE2620
5-FOAZymo ResearchF9001
D-(+)-GalactoseSIGMAG0750
L-GlutaminezuurSIGMAG1251
Dextrose SIGMAG7021
L-HistidineSIGMAH8125
L-IsoleucineSIGMAI2752
L-LysineSIGMAL1262
L-LeucineSIGMAL8000
L-MethionineSIGMAM2893
PEGSIGMAP3640
D-(+)-Raffinose pentahydraatSIGMAR0250
L-SerineSIGMAS4500
L-TryptofaanSIGMAT0271
L-ThreonineSIGMAT8625
UracilSIGMAU0750
L-ValineSIGMAV0500

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Spitz, F., Furlong, E. E. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nature Reviews Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).
  2. Pan, Y., Tsai, C. J., Ma, B., Nussinov, R. Mechanisms of transcription factor selectivity. Trends in Genetics. 26 (2), 75-83 (2010).
  3. Das, M. K., Dai, H. K. A survey of DNA motif finding algorithms. BMC Bioinformatics. 8 Suppl 7, S21(2007).
  4. Sebastian, A., Contreras-Moreira, B. The twilight zone of cis element alignments. Nucleic Acids Resesarch. 41 (3), 1438-1449 (2013).
  5. Iggo, R., et al. Validation of a yeast functional assay for p53 mutations using clonal sequencing. Journal of Pathology. 231 (4), 441-448 (2013).
  6. Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. Recent developments in yeast aging. PLoS Genetics. 3 (5), e84(2007).
  7. Scharer, E., Iggo, R. Mammalian p53 can function as a transcription factor in yeast. Nucleic Acids Research. 20 (7), 1539-1545 (1992).
  8. Kennedy, B. K. Mammalian transcription factors in yeast: strangers in a familiar land. Nature Reviews Molecular Cellular Biology. 3 (1), 41-49 (2002).
  9. Belli, G., Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast. Nucleic Acids Research. 26 (4), 942-947 (1998).
  10. Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22 (25), 5767-5768 (1994).
  11. Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5(2014).
  12. Inga, A., Storici, F., Darden, T. A., Resnick, M. A. Differential transactivation by the p53 transcription factor is highly dependent on p53 level and promoter target sequence. Molelcular and Cellular Biology. 22 (24), 8612-8625 (2002).
  13. Resnick, M. A., Inga, A. Functional mutants of the sequence-specific transcription factor p53 and implications for master genes of diversity. Proceeding of the National Academy of Science USA. 100 (17), 9934-9939 (2003).
  14. Tomso, D. J., et al. Functionally distinct polymorphic sequences in the human genome that are targets for p53 transactivation. Proceeding of the National Academy of Science USA. 102 (18), 6431-6436 (2005).
  15. Storici, F., Lewis, L. K., Resnick, M. A. In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides. Nature Biotechnology. 19 (8), 773-776 (2001).
  16. Storici, F., Resnick, M. A. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).
  17. Campomenosi, P., et al. p53 mutants can often transactivate promoters containing a p21 but not Bax or PIG3 responsive elements. Oncogene. 20 (27), 3573-3579 (2001).
  18. Flaman, J. M., et al. A simple p53 functional assay for screening cell lines, blood, and tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 92 (9), 3963-3967 (1995).
  19. Kovvali, G. K., Mehta, B., Epstein, C. B., Lutzker, S. G. Identification of partial loss of function p53 gene mutations utilizing a yeast-based functional assay. Nucleic Acids Research. 29 (5), E28(2001).
  20. Shimada, A., et al. The transcriptional activities of p53 and its homologue p51/p63: similarities and differences. Cancer Research. 59 (12), 2781-2786 (1999).
  21. Sunahara, M., et al. Mutational analysis of p51A/TAp63gamma, a p53 homolog, in non-small cell lung cancer and breast. Oncogene. 18 (25), 3761-3765 (1999).
  22. Andreotti, V., et al. p53 transactivation and the impact of mutations, cofactors and small molecules using a simplified yeast-based screening system. PLoS ONE. 6 (6), e20643(2011).
  23. Hekmat-Scafe, D. S., et al. Using yeast to determine the functional consequences of mutations in the human p53 tumor suppressor gene: An introductory course-based undergraduate research experience in molecular and cell biology. Biochemistry Molecular Biology Educaction. 45 (2), 161-178 (2017).
  24. Kato, S., et al. Understanding the function-structure and function-mutation relationships of p53 tumor suppressor protein by high-resolution missense mutation analysis. Proceedings of the National Academy of Science USA. 100 (14), 8424-8429 (2003).
  25. Monti, P., et al. Transcriptional functionality of germ line p53 mutants influences cancer phenotype. Clinical Cancer Research. 13 (13), 3789-3795 (2007).
  26. Monti, P., et al. Dominant-negative features of mutant TP53 in germline carriers have limited impact on cancer outcomes. Molecular Cancer Research. 9 (3), 271-279 (2011).
  27. Leroy, B., et al. The TP53 website: an integrative resource centre for the TP53 mutation database and TP53 mutant analysis. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D962-D969 (2013).
  28. Nigro, J. M., Sikorski, R., Reed, S. I., Vogelstein, B. Human p53 and CDC2Hs genes combine to inhibit the proliferation of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 1357-1365 (1992).
  29. Bureik, M., Jungbluth, A., Drescher, R., Wagner, P. Human p53 restores DNA synthesis control in fission yeast. Biological Chemistry. 378 (11), 1361-1371 (1997).
  30. Leao, M., et al. Alpha-mangostin and gambogic acid as potential inhibitors of the p53-MDM2 interaction revealed by a yeast approach. Journal of Natural Products. 76 (4), 774-778 (2013).
  31. Hadj Amor, I. Y., et al. Human p53 induces cell death and downregulates thioredoxin expression in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Research. 8 (8), 1254-1262 (2008).
  32. Leao, M., et al. Novel simplified yeast-based assays of regulators of p53-MDMX interaction and p53 transcriptional activity. FEBS J. 280 (24), 6498-6507 (2013).
  33. Di Ventura, B., Funaya, C., Antony, C., Knop, M., Serrano, L. Reconstitution of Mdm2-dependent post-translational modifications of p53 in yeast. PLoS ONE. 3 (1), e1507(2008).
  34. Leao, M., et al. Discovery of a new small-molecule inhibitor of p53-MDM2 interaction using a yeast-based approach. Biochemichal Pharmacology. 85 (9), 1234-1245 (2013).
  35. Billant, O., Blondel, M., Voisset, C. p53, p63 and p73 in the wonderland of S. cerevisiae. Oncotarget. 8 (34), 57855-57869 (2017).
  36. Cho, Y., Gorina, S., Jeffrey, P. D., Pavletich, N. P. Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: understanding tumorigenic mutations. Science. 265 (5170), 346-355 (1994).
  37. Muller, P. A., Vousden, K. H., Norman, J. C. p53 and its mutants in tumor cell migration and invasion. Journal of Cellular Biology. 192 (2), 209-218 (2011).
  38. Oren, M., Rotter, V. Mutant p53 gain-of-function in cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), a001107(2010).
  39. Walerych, D., Napoli, M., Collavin, L., Del Sal, G. The rebel angel: mutant p53 as the driving oncogene in breast cancer. Carcinogenesis. 33 (11), 2007-2017 (2012).
  40. Ciribilli, Y., et al. The coordinated p53 and estrogen receptor cis-regulation at an FLT1 promoter SNP is specific to genotoxic stress and estrogenic compound. PLoS ONE. 5 (4), e10236(2010).
  41. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. Potentiating the p53 network. Discovery Medicine. 10 (50), 94-100 (2010).
  42. Monti, P., et al. Characterization of the p53 mutants ability to inhibit p73 beta transactivation using a yeast-based functional assay. Oncogene. 22 (34), 5252-5260 (2003).
  43. Monti, P., et al. Tumour p53 mutations exhibit promoter selective dominance over wild-type p53. Oncogene. 21 (11), 1641-1648 (2002).
  44. Shiraishi, K., et al. Isolation of temperature-sensitive p53 mutations from a comprehensive missense mutation library. Journal of Biological Chemistry. 279 (1), 348-355 (2004).
  45. Soussi, T. TP53 mutations in human cancer: database reassessment and prospects for the next decade. Advances in Cancer Research. 110, 107-139 (2011).
  46. Malkin, D. Li-Fraumeni Syndrome. Genes and Cancer. 2, 474-484 (2001).
  47. el-Deiry, W. S., Kern, S. E., Pietenpol, J. A., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Definition of a consensus binding site for p53. Nature Genetics. 1 (1), 45-49 (1992).
  48. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. The expanding universe of p53 targets. Nature Reviews in Cancer. 9, 724-737 (2009).
  49. Ciribilli, Y., et al. Transactivation specificity is conserved among p53 family proteins and depends on a response element sequence code. Nucleic Acids Research. 41 (18), 8637-8653 (2013).
  50. Smeenk, L., et al. Characterization of genome-wide p53-binding sites upon stress response. Nucleic Acids Research. 36, 3639-3654 (2008).
  51. Vyas, P., et al. Diverse p53/DNA binding modes expand the repertoire of p53 response elements. Proceeding of the National Academy of Science USA. 114 (40), 10624-10629 (2017).
  52. Tebaldi, T., et al. Whole-genome cartography of p53 response elements ranked on transactivation potential. BMC Genomics. 16, 464(2015).
  53. Wang, T., et al. Species-specific endogenous retroviruses shape the transcriptional network of the human tumor suppressor protein p53. Proceedings of the National Academy of Science USA. 104, 18613-18618 (2007).
  54. Bond, G. L., et al. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119 (5), 591-602 (2004).
  55. Zeron-Medina, J., et al. A polymorphic p53 response element in KIT ligand influences cancer risk and has undergone natural selection. Cell. 155 (2), 410-422 (2013).
  56. Lion, M., et al. Evolution of p53 transactivation specificity through the lens of a yeast-based functional assay. PLoS ONE. 10 (2), e0116177(2015).
  57. Schumacher, B., et al. C. elegans ced-13 can promote apoptosis and is induced in response to DNA damage. Cell Death and Differentiation. 12 (2), 153-161 (2005).
  58. Jordan, J. J., et al. Low-level p53 expression changes transactivation rules and reveals superactivating sequences. Proceeding of the National Academy of Science USA. 109 (36), 14387-14392 (2012).
  59. Soares, J., et al. Oxazoloisoindolinones with in vitro antitumor activity selectively activate a p53-pathway through potential inhibition of the p53-MDM2 interaction. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 66, 138-147 (2015).
  60. Leao, M., et al. Enhanced cytotoxicity of prenylated chalcone against tumour cells via disruption of the p53-MDM2 interaction. Life Sciences. 142, 60-65 (2015).
  61. Soares, J., et al. A tryptophanol-derived oxazolopiperidone lactam is cytotoxic against tumors via inhibition of p53 interaction with murine double minute proteins. Pharmacol Research. 95-96, 42-52 (2015).
  62. Soares, J., et al. DIMP53-1: a novel small-molecule dual inhibitor of p53-MDM2/X interactions with multifunctional p53-dependent anticancer properties. Molecular Oncology. 11 (6), 612-627 (2017).
  63. Soares, J., et al. Reactivation of wild-type and mutant p53 by tryptophanolderived oxazoloisoindolinone SLMP53-1, a novel anticancer small-molecule. Oncotarget. 7 (4), 4326-4343 (2016).
  64. Sharma, V., Monti, P., Fronza, G., Inga, A. Human transcription factors in yeast: the fruitful examples of P53 and NF-small ka, CyrillicB. FEMS Yeast Research. 16 (7), (2016).
  65. Stepanov, A., Nitiss, K. C., Neale, G., Nitiss, J. L. Enhancing drug accumulation in Saccharomyces cerevisiae by repression of pleiotropic drug resistance genes with chimeric transcription repressors. Molecular Pharmacology. 74 (2), 423-431 (2008).
  66. Sharma, V., et al. Quantitative Analysis of NF-kappaB Transactivation Specificity Using a Yeast-Based Functional Assay. PLoS ONE. 10 (7), e0130170(2015).
  67. Epinat, J. C., et al. Reconstitution of the NF-kappa B system in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 13 (7), 599-612 (1997).
  68. Inga, A., Reamon-Buettner, S. M., Borlak, J., Resnick, M. A. Functional dissection of sequence-specific NKX2-5 DNA binding domain mutations associated with human heart septation defects using a yeast-based system. Human Molecular Genetics. 14 (14), 1965-1975 (2005).
  69. Reamon-Buettner, S. M., Ciribilli, Y., Inga, A., Borlak, J. A loss-of-function mutation in the binding domain of HAND1 predicts hypoplasia of the human hearts. Human Molecular Genetics. 17 (10), 1397-1405 (2008).
  70. Balmelli-Gallacchi, P., et al. A yeast-based bioassay for the determination of functional and non-functional estrogen receptors. Nucleic Acids Research. 27 (8), 1875-1881 (1999).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Gist p53 assaysp53 transactivatiegist reporterstammenluciferase assaykleur reportergenremming van gistgroeip53 respons elementlithiumacetaat transformatieanalyse van p53 mutantenstudie naar transcriptiefactoren

Gerelateerde artikelen