Microelektrode impalement methode om membraan potentieel van een gecanuleerde middelste cerebrale slagader record

Summary

Het primaire doel van dit artikel is om de details van hoe het membraanpotentiaal (V_m) van het midden cerebrale slagader met behulp van de microelektrode impalement methode te bieden. De gecanuleerde middelste cerebrale slagader is geëquilibreerd te krijgen myogene Toon, en het schipmuur is Impaled met behulp van hoge weerstand microelektrodes.

Abstract

Membraanpotentiaal (V_m) van vasculaire gladde spiercellen bepaalt het vaartuig Toon en dus de bloedtoevoer naar een orgaan. Veranderingen in de expressie en functie van ionenkanalen en electrogenic pompen die te reguleren V_m in ziekte omstandigheden zou kunnen veranderen v_m, vasculaire Toon, en de bloedstroom. Aldus, is een basisbegrip van Elektrofysiologisch en de methodes noodzakelijk om V_m in gezonde en zieke staten nauwkeurig te registreren essentieel. Deze methode kan moduleren V_m met behulp van verschillende farmacologische middelen te herstellen v_m. Hoewel er verschillende methoden, elk met zijn voor-en nadelen, dit artikel biedt protocollen voor het opnemen V_m van gecanuleerde weerstand schepen zoals het midden cerebrale slagader met behulp van de microelektrode impalement methode. Middelste cerebrale slagaders zijn toegestaan om myogene Toon te krijgen in een myograph kamer, en het schipmuur is inpaled met behulp van hoge weerstand microelektrodes. Het V_m -signaal wordt verzameld via een elektrometer, gedigitaliseerd en geanalyseerd. Deze methode zorgt voor een nauwkeurige lezing van de V_m van een vaatwand zonder beschadiging van de cellen en zonder de membraan weerstand te veranderen.

Introduction

Het membraanpotentiaal (V_m) van een cel verwijst naar het relatieve verschil van Ionische lading over het plasmamembraan en de relatieve permeabiliteit van het membraan naar deze ionen. De V_m wordt gegenereerd door de differentiële verdeling van ionen en wordt onderhouden door ionenkanalen en pompen. De ionenkanalen zoals K⁺, na⁺, en cl⁻ dragen wezenlijk tot het rusten V_mbij. Vasculaire gladde spiercellen (VSMCs) Express meer dan vier verschillende soorten K⁺ kanalen¹, twee soorten van voltage-gated CA^{2 +} kanalen (VGCC)², meer dan twee soorten cl⁻ kanalen^{3, 4 , 5}, op te slaan-bediend CA^{2 +} kanalen⁶, Stretch-activated kation kanalen^7,8, en electrogenic natrium-kalium ATPase pompen⁹ in hun plasmamembranen, die allemaal kunnen worden betrokken bij de regulering van V_m.

De V_m van VSMCs hangt af van lumen druk. In niet-drukvaten, V_m varieert van-50 tot-65 mv, echter, in onder druk gezette arteriële segmenten, v_m varieert van-37 tot-47 MV¹⁰. Elevatie van intravasculaire druk oorzaken VSMCs te depolariseren¹¹, vermindert de drempel voor VGCC opening, en verhoogt de calcium instroom bij te dragen tot de ontwikkeling van myogene Toon¹². Integendeel, in passieve of niet-drukvaten, membraan hyperpolarisatie, als gevolg van hoge K⁺ kanaal activiteit, zal voorkomen dat VGCC van de opening, wat resulteert in een beperkte calcium binnenkomst en een daling van de intracellulaire calcium, bij te dragen tot minder vasculaire Toon¹³. Zo, V_m als gevolg van veranderingen in de lumen druk lijkt te spelen een essentiële rol in de vasculaire Toon ontwikkeling, en zowel VGCC en K⁺ kanalen spelen een cruciale rol in de regulering van V_m.

V_m varieert tussen Scheepstype en soort. V_m is-54 ± 1,3 mv in proefkonijn superieure mesenterica arteriële stroken¹⁴,-45 ± 1 mv in de rat midden cerebrale slagaders op 60 mmHg lumen druk¹², en-35 ± 1 mv in rat parenchymale slagaders op 40 mmHg lumen druk¹⁵. De rust V_m opgenomen in ongestrekte rat lymfatische spier is-48 ± 2 MV¹⁶. V_m van cerebrale VSMCs is negatiever dan in perifere slagaders. Ter vergelijking, katachtige middelste cerebrale slagaders werden gemeld aan een V_m van ongeveer-70 mV hebben, terwijl mesenterica en kransslagaders werden gemeld te hebben-49 en-58 mv, respectievelijk^17,18. Verschillen in de V_m over vasculaire bedden kunnen weerspiegelen de verschillen in de expressie en functie van ionenkanalen en electrogenic natrium-kalium pompen.

De verhogingen en de dalingen in V_m worden bedoeld als membraan depolarisatie en hyperpolarisatie, respectievelijk. Deze veranderingen in V_m spelen een centrale rol in vele fysiologische processen, met inbegrip van ionen-kanaal gating, cel signalering, spiercontractie, en actie potentiële propagatie. Bij een vaste druk, veroorzaken vele endogene en synthetische vaatverwijdende samenstellingen die K⁺ kanalen activeren membraan hyperpolarisatie, resulterend in vasodilatatie^1,13. Omgekeerd, aanhoudende membraan depolarisatie is van vitaal belang in agonist-geïnduceerde of receptor-gemedieerde vasoconstrictie¹⁹. V_m is een kritische variabele die niet alleen reguleert CA^{2 +} instroom door VGCC¹³ , maar ook van invloed op de release van CA^{2 +} van interne winkels^20,21 en CA^{2 +}-gevoeligheid van het samentrekbaar apparaat²².

Hoewel er verschillende methoden om V_m record van verschillende soorten cellen, gegevens verzameld uit de microelektrode impalement methode van gecanuleerde schepen lijkt meer fysiologische dan de gegevens verkregen uit geïsoleerde VSMCs. Wanneer geregistreerd van geïsoleerde VSMC gebruikend huidige klem methodes, wordt V_m gezien als spontane voorbijgaande Hyperpolarizations in VSMCs²⁴. Geïsoleerde VSMCs zijn niet in de syncytium, en de veranderingen in de reeks weerstand kan bijdragen tot de oscillerende gedrag van V_m. Aan de andere kant, oscillerende gedrag wordt niet waargenomen wanneer V_m is opgenomen van intacte schepen, waarschijnlijk te wijten aan cel-cel contact tussen VSMCs die in syncytium in de slagader en zijn gesommeerd door het hele schip leidt tot een stabiele V_m ²⁴. aldus, is de meting van V_m van onder druk gezette schepen gebruikend standaard microelektrode impalement techniek vrij dicht bij de fysiologische voorwaarden.

Opname V_m van gecanuleerde schepen kunnen vitale informatie, aangezien v_m van VSMCs die in syncytium is een van de belangrijkste determinanten van vasculaire Toon en de doorbloeding, en de modulatie van de v-_m kan een manier om verwijden of vernauwen bloedvaten. Zo is het essentieel om te begrijpen van de methodologie die betrokken zijn bij de opname V_m. Dit artikel beschrijft intracellulaire opname van V_m van gecanuleerde middelste cerebrale slagaders (MCAs) met behulp van een microelektrode impalement methode. Dit protocol zal beschrijven hoe te bereiden MCAs, microelektrodes, het opzetten van de elektrometer en uitvoeren van de impalement methode om V_mrecord. Ook representatieve gegevens, gemeenschappelijke problemen die werden aangetroffen bij het gebruik van deze methode en mogelijke problemen worden besproken.

Protocol

De mannelijke ratten werden gehuisvest in de Dierenzorg faciliteit op UMMC, die is goedgekeurd door de vereniging voor de beoordeling en accreditatie van laboratoriumdieren zorg (AAALAC). Dieren hadden gedurende de hele studie vrije toegang tot voedsel en water. De dieren werden gehandhaafd in een gecontroleerde omgeving met temperatuur bij 24 ± 2 °C, vochtigheidsniveaus van 60 – 80% en 12 h lichte/donkere cycli. Alle protocollen werden goedgekeurd door de Dierenzorg en het gebruik Comite van UMMC.

1. voorbereiding van apparatuur

1. Plaats een Dual Channel differentieel elektrometer versterker (Zie de tabel van materialen) dicht bij de schip kamer en op de gewenste locatie.
2. Sluit de uitgang van het versterker kanaal A of B aan op de kanaal ingang van de digitizer met een BNC-BNC kabel.
3. Monteer de sonde in de micro manipulator en plaats deze in de buurt van de Microscoop en de myograph. De opname-instelling moet worden geïnstalleerd op een tril vrije tafel.
4. Plaats de knoppen en schakelingen op de voorkant van de versterker in posities die het configureren voor dit experiment, zoals beschreven in de handleiding.
5. Sluit de bad grond aan op het circuit grond van de versterker via met een geschikte elektrode. Evenzo, ervoor te zorgen dat de kooi is geaard om het chassis van de versterker.

2. voorbereiding van de microelektrodes en assemblage

1. Gebruik borosilicaatglas glas microelektrodes (Zie de tabel van materialen) en trek de glazen tip om een 8 tot 10 mm taper, diameter van < 1 µm en weerstand van 80 tot 120 MΩ wanneer gevuld met 3 M KCl.
   1. Gebruik een standaard trekker om een korte geleidelijke versmalling te bereiken gebruikend de volgende montages: hitte = 650; Velocity = 20; pull = 25; tijd = 250 en lus tweemaal voor hogere weerstanden en kleinere tips. Zie de tabel van de materialen als de instellingen zijn instrument-specifiek.
      Opmerking: Tip diameters < 1 µm zal leiden tot minimale schade aan de cel bij inpaled.
2. Vul de micro electrode met een KCl van 3 M met behulp van een spuit (Zie de tabel van de materialen).
   1. Trek langzaam de zuiger van de microfiber spuit omhoog terwijl het injecteren van de 3 M KCl in de microelektrode om ruimte voor de vloeistof te vullen en om de vorming van luchtbellen te voorkomen in de micro electrode.
   2. Vul de microelektrode tot vol en zorg ervoor dat er geen luchtbellen voordat u het in de microelektrode houder. Als bubbels aanwezig zijn, tikt u zachtjes op de microelektrode met een vinger om de bubbels te verwijderen.
3. De uitoefening van zorg, stevig duw de elektrode schacht in de houder door de verveelde gat. Als overtollig vocht aanwezig is, verwijder het met een tissue.
4. Sluit de montage van de elektrode houder aan op de versterker sonde. Voer een elektrode test, pas de input offset, verifiëren nul instelling en controleer de sonde input lekkage volgens de versterker handleiding.
5. Meet de elektrode weerstand met behulp van een elektrode test zoals aangegeven in tabel 1.
6. Merk op dat een werkende elektrode geeft een positieve DC voltage verschuiving van 1 mV/MΩ op het kanaal uitgang. Aan de andere kant, als een grote spanning verschijnt op het kanaal output en op de meter, dit duidt op een geblokkeerde of gebroken elektrode.
7. Open de opname software, wijs een naam aan het dossier toe en bewaar het voor toekomstige analyse in een het opslaan software.

3. isolatie en Canulatie van de middelste hersen slagader

1. Voorbereiding van de reagentia.
   1. Bereid de normale en lage calcium fysiologische zoutoplossing (PSS) voor, zoals beschreven in tabel 2.
2. Bereid de myograph.
   1. Spoel de myograph kamer (Zie de tabel van de materialen) met gedistilleerd water meerdere malen te houden vrij van puin. Laad de kamer met 5 mL normale PSS.
   2. Vul beide glazen canules met een gefilterde normale PSS met een spuit van 5 tot 10 mL. Vul de hele bril en de bijgevoegde slang voorzichtig in zonder luchtbellen te introduceren.
   3. Bereid twee monofilament nylon hechtingen (10-0, 0,02 mm) met een halve knoop elk met botte Tang.
   4. Plaats de gedeeltelijk gesloten hechtdraad knopen op beide canules iets weg van de tip met behulp van dissectie Tang onder een dissectie Microscoop. Later zullen deze knopen worden geschoven en zorgvuldig vastgebonden op de gecanuleerde arteriële uiteinden om het schip te beveiligen.
3. Isoleren en cannulate de middelste hersen slagader.
   1. Induceren diepe anesthesie in een Sprague Delombaerde rat met behulp van 2 tot 4% ingeademd Isofluraan.
   2. Onthoofd de rat met behulp van guillotine onder diepe anesthesie.
   3. Verwijder voorzichtig de schedel met behulp van een bone cutter en een schaar.
   4. Verwijder de hersenen van de schedel en plaats deze in 5 mL van de lage calcium PSS op ijs.
   5. Identificeer en ontleden uit een onvertakte segment van de rat midden cerebrale slagader (MCA) met een binnendiameter van 100-200 μm uit de hersenen met behulp van de lente schaar en Tang.
   6. Monteer de MCA op het glas canules met behulp van fijne Tang en veilig door het aandraaien van de hechtingen in de myograph met normale PSS.
   7. Sluit de distale bril af, zodat er geen stroom binnen de MCAs is.
   8. Sluit de instroom pipet aan op een reservoir met PSS, zodat de intraluminal druk kan worden gecontroleerd die met een in-line drukregelaar wordt bewaakt.
   9. Visualiseer de gecanuleerde MCAs met behulp van een charge-gekoppelde apparaat camera (Zie de tabel van materialen) gemonteerd op een omgekeerde Microscoop en een imaging software.
   10. Stel de axiale lengte van het MCA op een geschatte lengte waar het moet verschijnen noch stijf, noch slappe.
   11. Equilibrate de bad oplossing met O₂ (95%) en CO₂ (5%) bij 37 °C om adequate oxygenatie, temperatuur te verstrekken en pH bij 7,4 te handhaven.
4. Impale (doordring de cel plasmamembraan) de vasculaire gladde spiercellen.
   1. Sluit de grondelektrode en houd deze ondergedompeld in de PSS van de myograph.
   2. Verlicht de schip kamer en kijk door de Microscoop om het uiteinde van de microelektrode in de bad oplossing te visualiseren.
      Opmerking: Als alternatief kan men visualiseren van de MCA en micro elektrode op een computer met een imaging software.
   3. Gebruik de controles van de micromanipulator om het uiteinde van de microelektrode dicht bij de buitenmuur van het bloedvat te bewegen. De micromanipulator en het uiteinde van de microelektrode moeten in een stabiele positie in verhouding tot het weefsel zijn.
      Opmerking: Voor het begin van experimenten, bevestigen dat de membraanspanning is gestabiliseerd. Als de gemeten spanning instabiel is, wordt de verbinding tussen de elektrode en de cel niet verzegeld, met vermelding van een lek.
   4. Start de opname.
   5. Beweeg langzaam het uiteinde van de micro-elektrode naar het schip, strevend naar het centrum van het schip dat cursus of fijne controle van de micromanipulator gebruikt.
      Opmerking: Af en toe, een kleine afbuiging in de opname kan worden waargenomen wanneer de microelektrode Tip contact op met een spiervezel membraan.
   6. Wanneer de tip komt in de nabijheid van het schip, vooraf de elektrode naar voren in een snelle beweging met behulp van de micromanipulator om het membraan van de spier impale.
   7. Op dit punt kan men beginnen met het observeren van de veranderingen in V_m wordt geregistreerd. Raak de micromanipulator niet aan wanneer de microelektrode het membraan van de cel doorboort.
      Opmerking: Het verschil in spanning tussen de opname-en referentie-elektrode daalt van 0 mV tot tussen-40 mV en-75 mV afhankelijk van het niveau van de intravasculaire druk of andere prikkelende of remmende stimuli. Deze lezingen kenmerken het transmembraan potentiaalverschil van de huidige cel.
   8. Voer meerdere impales uit op een enkel schip in verschillende gebieden van het schip zonder beschadiging van VSMCs om nauwkeurige metingen te krijgen.
   9. Na het opnemen, gebruik maken van de manipulator om de microelektrode te verwijderen in een snelle beweging.
   10. Stop de opname en opslaan van gegevensbestanden voor verdere analyse.

Results

De gepresenteerde methode kan betrouwbaar worden gebruikt voor het opnemen V_m in gecanuleerde schepen. In Figuur 1awordt een korte procedure beschreven om MCA van de hersenen te isoleren. Na het scheiden van de hersenen van de schedel, werd het MCA ontleed en geplaatst in een Petri schaaltje met een laag calcium PSS. Een deel van het bindweefsel dat werd gehecht werd ook ontleed samen met MCA met behulp van de lente schaar en Tang om schade aan MCA...

Discussion

Dit artikel bevat de nodige stappen op het gebruik van een scherpe microelektrode impalement methode om V_m record van een gecanuleerde schip voorbereiding. Deze methode wordt veel gebruikt, en biedt een hoge kwaliteit, consistente opnames van V_m dat antwoord op een breed scala van experimentele vragen.

Sommige kritieke overwegingen en stappen voor probleemoplossing worden hier beschreven om het succes van de methode te garanderen. De kwaliteit van de micro-elektrode (de s...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissectie-instrumenten
Anesthesie-verdamper	Parkland scientific	V3000PK
Dissectiemicroscoop	Nikon Instruments Inc., NY	Eclipse Ti-S
Kleine guillotine type 7575	Harvard Apparatus, MA	73-198
Littauer botmes	Fine science tools	16152-15
Moria MC40 ultrafijne pincetten	Fine science tools	11370-40
Chirurgische schaar scherp-blunt	Fine science tools	14008-14
Hechtdraad	Harvard Apparatus	72-3287
Vannas veerschaar	Fine science tools	15018-10
Elektrofysiologie-instrumenten
Charge-coupled device-camera	Qimaging,, BC	Retiga 2000R
Differentiële elektrometersversterker	WPI	FD223A
Inline druktransducer	Harvard Apparatus, MA	MA1 72-4496
Micromanipulator	Thor labs	PCS-5400
Microelektroden	Warner Instruments LLC, CT	G200-6,
Microfil (microvezel spuit)	WPI	MF28G67-5
Micro-elektrodehouder	WPI	MEH1SF
Myograaf	Living Systems Instrumentation, VT	CH-1-SH
Puller	Sutter Instrument, San Rafael, CA	P-97
Vibratievrije tafel	TMC	3435-14
Software
Clampex 10	Molecular devices
p Clamp 10	Molecular devices
Beeldvormingssoftware	Nikon, NY	NIS-elements
Chemische stoffen
NaCl	Sigma	S7653
KCl	Sigma	P4504
MgSO4	Sigma	M7506
CaCl2	Sigma	C3881
HEPES	Sigma	H7006
Glucose	Sigma	G7021
NaH2PO4	Sigma	S0751
NaHCO3	Sigma	S5761