Methodenartikel

Genoom bewerken in zoogdieren cellijnen met behulp van CRISPR-Cas

21.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59086

⸱

11 april 2019

 ,  ,  , 
1Genome Institute of Singapore, Agency for Science Technology and Research, 2School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

In dit artikel

Samenvatting

CRISPR-Cas is een krachtige technologie om ingenieur van het complex genoom van planten en dieren. Hier, detail we een protocol bij het menselijk genoom met behulp van verschillende Cas enzym efficiënt te bewerken. We benadrukken belangrijke overwegingen en ontwerpparameters bewerken efficiëntie te optimaliseren.

Samenvatting

De geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR) systeem functioneert uiteraard in bacteriële adaptieve immuniteit, maar heeft met succes zijn voorzien voor genoom engineering in vele andere levende organismen. Meestal de wildtype CRISPR verbonden 9 (Cas9) of Cas12a endonuclease wordt gebruikt om specifieke locaties in het genoom, waarna de pauze van de double-stranded DNA is gerepareerd via het niet-homologe einde deelname aan (NHEJ) traject of de homologie geleide reparatie (klieven HDR) traject afhankelijk van of een donor-sjabloon is afwezig of respectievelijk presenteren. Tot op heden, is CRISPR systemen van verschillende bacteriesoorten gebleken kunnen bewerkingen genoom toe te passen in zoogdiercellen. Ondanks de schijnbare eenvoud van de technologie moeten meerdere ontwerpparameters echter worden overwogen, waardoor vaak gebruikers verbijsterd over het beste uit hun genoom bewerken experimenten te voeren. Hier beschrijven we een complete workflow van experimenteel design tot identificatie van cel klonen die gewenste DNA wijzigingen, met het doel van het vergemakkelijken van de succesvolle uitvoering van experimenten in zoogdieren cellijnen bewerken genoom dragen. We benadrukken belangrijke overwegingen voor gebruikers nota te nemen van, met inbegrip van de keuze van het CRISPR systeem, de lengte van de spacer en het ontwerp van een sjabloon van de donor single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN). Wij voorzien dat deze werkstroom zal zitten nuttig voor gene knockout studies, ziekte modellering van inspanningen, of de generatie van verslaggever cellijnen.

Inleiding

De mogelijkheid om ingenieur van het genoom van elk levend organisme heeft vele biomedische en biotechnologische toepassingen, zoals de correctie van de ziekte-veroorzakende mutaties, bouw van accurate cellulaire modellen voor ziekte studies of generatie van landbouw gewassen met wenselijke eigenschappen. Sinds het begin van de eeuw, verschillende technologieën zijn ontwikkeld voor genoom engineering in zoogdiercellen, met inbegrip van meganucleases1,2,3, elektrolytisch vinger nucleasen4,5, of transcriptie activator-achtige effector nucleasen (TALENs)6,7,8,9. Echter zijn deze eerdere technologieën moeilijk te programma of vervelend te monteren, waardoor hun wijdverspreide goedkeuring in onderzoek en de industrie te belemmeren.

In de afgelopen jaren de geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR) - CRISPR-geassocieerde (Cas) systeem heeft ontpopt als een krachtige nieuwe genoom engineering technologie10,11. Oorspronkelijk een adaptieve immuunsysteem in bacteriën, is met succes ingezet voor het wijzigen van het genoom in planten en dieren, inclusief de mens. Een primaire reden waarom CRISPR-Cas heeft populariteit zo veel in zo'n korte tijd is dat het element dat de belangrijkste Cas-endonuclease, zoals Cas9 of Cas12a brengt (ook bekend als Cpf1), naar de juiste locatie in het genoom is gewoon een klein stukje chimeer één gids RN A (sgRNA), die is ontwerp eenvoudig en goedkoop te synthetiseren. Na wordt gerekruteerd om de doelsite, het Cas-enzym functioneert als een paar van moleculaire schaar en cleaves het afhankelijke DNA met haar RuvC, HNH of NOC domeinen12,13,14. De resulterende dubbele gestrande onderbreking (DSB) wordt later hersteld door de cellen via niet-homologe einde deelname aan (NHEJ) of de homologie geleide reparatie (HDR) traject. Bij gebrek aan een reparatie-sjabloon, wordt de DSB hersteld door de vergissing-geneigd NHEJ traject, die aanleiding tot pseudo-willekeurige invoeging of schrapping van nucleotiden (microdeleties) op de gesneden site geven kan, mogelijk veroorzaakt frameshift mutaties in eiwit-codeert genen. Echter in de aanwezigheid van een donor-sjabloon die de gewenste DNA wijzigingen bevat, wordt de DSB hersteld door het traject van de HDR high fidelity. Gangbare typen van donor sjablonen zijn single-stranded oligonucleotides (ssODNs) en plasmiden. De voormalige wordt meestal gebruikt als de beoogde DNA veranderingen klein (bijvoorbeeld wijziging van een enkelvoudige basenpaar), zijn terwijl de laatste meestal gebruikt wordt als men het wil invoegen een relatief lange reeks (bijvoorbeeld de codering opeenvolging van een groen fluorescent proteïne of GFP) in de locus van het doel.

De endonuclease activiteit van het eiwit van Cas vereist de aanwezigheid van een protospacer aangrenzende motief (PAM) op de target website15. De PAM van Cas9 is aan de 3'-eind van de protospacer, terwijl de PAM van Cas12a (ook wel Cpf1 genoemd) in plaats daarvan aan het einde 5'16. Het Cas-guide RNA complex is niet in staat om een DSB als de PAM afwezig17 is. Vandaar, de PAM legt een beperking op de genomic locaties waar een bepaalde Cas nuclease vermag klieven. Gelukkig, Cas nucleasen van verschillende bacteriesoorten vertonen meestal verschillende PAM eisen. Vandaar, door de integratie van verschillende systemen van de CRISPR-Cas in onze engineering toolbox, we kunnen uit te breiden het bereik van sites die in een genoom kunnen worden gericht. Bovendien kan een natuurlijke Cas enzym worden ontworpen of geëvolueerd om te herkennen van de alternatieve opeenvolgingen van het PAM, verdere uitbreiding van het toepassingsgebied van genomic doelstellingen toegankelijk voor manipulatie18,19,20.

Hoewel meerdere CRISPR-Cas systemen beschikbaar voor technische doeleinden genoom zijn, hebben de meeste gebruikers van de technologie vertrouwd voornamelijk op de Cas9 nuclease van Streptococcus pyogenes (SpCas9) om meerdere redenen. Ten eerste, het vereist een relatief eenvoudig NGG PAM, in tegenstelling tot veel andere certificeringsinstanties eiwitten die kunnen alleen in de aanwezigheid van meer complexe PAMs klieven. Ten tweede, het is de eerste Cas endonuclease om te worden geïmplementeerd in menselijke cellen21,22,23,24. Ten derde, SpCas9 is veruit het beste gekarakteriseerd enzym tot nu toe. Als een onderzoeker wil gebruiken een ander Cas nuclease, zou hij of zij vaak onduidelijk over de beste manier om het experiment en hoe goed de andere enzymen zal presteren in verschillende biologische contexten, in vergelijking met SpCas9 te ontwerpen.

Om duidelijkheid aan de relatieve prestaties van de verschillende systemen van de CRISPR-Cas, hebben we onlangs uitgevoerd een systematische vergelijking van vijf Cas enzym-SpCas9, het Cas9-enzym van Staphylococcus aureus (SaCas9), het enzym van de Cas9 van Neisseria meningitidis (NmCas9), het Cas12a-enzym van Acidaminococcus sp. BV3L6 (AsCas12a), en het enzym van de Cas12a van de Lachnospiraceae bacterie ND2006 (LbCas12a)25. We geëvalueerd voor een eerlijke vergelijking, de diverse Cas nucleasen met behulp van dezelfde set doel sites en andere experimentele omstandigheden. De studie ook afgebakend ontwerpparameters voor elk CRISPR-Cas-systeem, die als een nuttige referentie voor gebruikers van de technologie dienen zou. Hier, beter in staat stellen onderzoekers gebruik te maken van de CRISPR-Cas systeem, wij bieden een stapsgewijze protocol voor optimale genoom engineering met verschillende Cas9 en Cas12a enzymen (Zie Figuur 1). Het protocol omvat niet alleen experimentele details maar ook belangrijke ontwerpoverwegingen te maximaliseren van de kans op een succesvolle genoom engineering resultaat in zoogdiercellen.

figure-introduction-1
Figuur 1 : Een overzicht van de workflow voor het genereren van genoom bewerkt menselijke cellijnen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. ontwerp van sgRNAs

  1. Selecteer een passend CRISPR-Cas-systeem.
    1. Eerst, Inspecteer de regio van de doelgroep voor de PAM sequenties van alle Cas9 en Cas12a nucleasen, die hebben aangetoond dat functioneel in zoogdiercellen16,21-32. Vijf veel gebruikte enzymen zijn gegeven in tabel 1 samen met hun respectieve PAMs.
      Opmerking: naast de enzym vermeld in tabel 1, er zijn andere minder gebruikte Cas-enzymen die met succes zijn ingezet in zoogdiercellen eveneens, zoals een Cas9 nuclease van Streptococcus thermophilus (St1Cas9) dat herkent de PAM NNAGAAW. Als de gewenste doelsite geen een bekende PAM bevat, zou een niet kundig voor toepassing van het CRISPR-Cas-systeem voor genoom-engineering.
    2. Ten tweede, overweeg elke bekende eigenschappen van de doel genomic locus of gene. Sommige eigenschappen rekening te houden omvatten gen expressie niveaus of chromatine toegankelijkheid en of er andere nauw zijn gerelateerde sequenties ook.
      Opmerking: Bepaalde enzymen zijn beter geschikt voor bepaalde biologische contexten. Bijvoorbeeld, als u wilt bewerken een repetitieve genomic locus of een gen met verschillende andere nauwe paralogs, het is aanbevolen om gebruik van beide AsCas12a (als gevolg van de lagere tolerantie voor incongruenties tussen de sgRNA en het DNA van het doel dan SpCas9 en LbCas12a) of SaCas9 (wegens zijn eis voor langere afstandhouders, waarin hogere targeting specificiteit)25.
CAS EndonucleasePAMOptimale spacer lengte
SpCas9NGG17-22 nt inclusieve
SaCas9NNGRRT≥ 21 nt
NmCas9NNNNGATT≥ 19 nt
AsCas12a en LbCas12aTTTV≥ 19 nt

Tabel 1: enkele veelgebruikte Cas enzymen met hun cognaat PAMs en lengtes van de optimale sgRNA. N = elk nucleotide (A, T, G of C); R = A- of G; V = A, C, of G.

  1. Selecteer een geschikte spacer-reeks. Identificeren als unieke een opeenvolging mogelijk om het risico van off-target decollete gebeurtenissen, door het onderzoek van het genoom van de doelgroep met BLAST33 of met behulp van verschillende vrij beschikbare online tools, zoals: (a) programma van Feng Zhang's laboratorium34 (http://crispr.mit.edu/); (b) CHOPCHOP35 (http://chopchop.cbu.uib.no/); (c) E-CRISP36 (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/); (d) CRISPOR37 (http://crispor.tefor.net/); (e) Cas-OFFinder38 (http://www.rgenome.net/cas-offinder/).
    Opmerking: De optimale lengte van het tussenstuk kan variëren van 17 tot 25 nucleotiden (nt) inclusief, afhankelijk van welke Cas enzym wordt gebruikt (Zie tabel 1). Voor Cas9, is de spacer stroomopwaarts van de PAM, terwijl voor Cas12a, de spacer is stroomafwaarts van de marcheer bovendien, HDR-efficiëntie daalt snel met toenemende afstand van de gesneden site. Vandaar, voor precieze DNA bewerken, plaatst u de sgRNA zo dicht mogelijk bij de beoogde wijziging-site.
  2. Synthetiseren DNA oligonucleotides met de juiste overhangen voor de CRISPR-plasmide die wordt gebruikt.
    1. Een nucleotide G voor de spacer toevoegen als de eerste positie van de gids niet een G. bepalen de omgekeerde bijkomende opeenvolging van het tussenstuk is. Voeg in de nodige overhangen voor het klonen van doeleinden.
      Opmerking: Ter illustratie, voor de plasmiden gebruikt in onze evaluatie studie25, de oligonucleotides te worden gesynthetiseerd worden weergegeven in tabel 2. Gebruik het voorbeeld in Figuur 2 als een gids, indien nodig. Vele CRISPR plasmiden zijn beschikbaar uit commerciële bronnen (bijvoorbeeld Addgene). Enkele van de meer populaire plasmiden zijn gegeven in de Tabel van materialen.
CRISPR plasmideVolgorde
pSpCas9 en pSaCas9Sense: 5' - CACC (G) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'
Antisense: 3' - (C) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5'
pNmCas9Sense: 5' - CACC (G) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'
Antisense: 3' - (C) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAC - 5'
pAsCas12a en pLbCas12aSense: 5' - AGATNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'
Antisense: 3' - NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAAAA - 5'

Tabel 2: Oligonucleotides voor het klonen van de sequenties van de sgRNA in CRISPR plasmiden gebruikt in een recente evaluatie vereiste studie25. De overhangen zijn cursief weergegeven.

figure-protocol-1
Figuur 2 : Een voorbeeld illustreren hoe Selecteer doel sites en ontwerpen oligonucleotides voor het klonen in CRISPR plasmiden. De doelgroep genomic locus hier is exon 45 van de menselijke CACNA1D-gen. De PAMs voor SpCas9 en SaCas9 zijn respectievelijk NGG en NNGRRT en worden gemarkeerd in het rood, terwijl de PAM voor AsCas12a en LbCas12a is TTTN en is gemarkeerd in het groen. De rode horizontale balk geeft de protospacer voor SpCas9 en SaCas9, terwijl de groene horizontale balk geeft aan de protospacer voor de twee Cas12a enzymen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

2. klonen van oligonucleotides in een ruggengraat vector

  1. Phosphorylate en ontharden de betekenis en antisense oligonucleotides.
    1. Als de oligonucleotides zijn gelyofiliseerd, resuspendeer hen tot een concentratie van 100 µM in tris-ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) (TE bufferen, Zie Tabel van materialen) of ddH2O.
    2. Bereiden van een 10 µL reactie mix bevattende 1 µL van zin oligonucleotide, 1 µL van antisense oligonucleotide, 1 µL van T4 DNA ligase buffer (10 x), 1 µL van T4 polynucleotide kinase (PNK), en 6 µL van ddH2O. Mix goed pipetteren en plaats van de reactie mix in een thermische cy Cler met behulp van de volgende parameters: 37 ° C gedurende 30 minuten, 95 ° C gedurende 5 minuten, en oprit tot 25 ° C op 6 ° C/min.
    3. Verdun de reactie mix 1:100 in ddH2O (bijvoorbeeld 2 µL reactie mix + 198 µL ddH2O).

figure-protocol-2
Figuur 3 : Een voorbeeld van een plasmide CRISPR. (een) A kaart met vermelding van verschillende belangrijke kenmerken van de plasmide. De EF-1a promotor rijdt hier, de uitdrukking van Cas9, terwijl de U6 promotor de uitdrukking van de sgRNA rijdt. Amp(R) geeft een gen voor ampicilline-resistentie in de plasmide. (b) de volgorde van de "BbsI-BplI klonen site" in het plasmide. De volgorde van de erkenning van BbsI is GAAGAC en wordt aangegeven in het rood, terwijl de volgorde van de erkenning van BplI GAG-N5 is- CTC en wordt aangegeven in het groen. (c) inleidingen die kunnen worden gebruikt voor PCR van de kolonie om te controleren of de volgorde van de sgRNA met succes heeft gekloond in de plasmide. De hU6_forward primer wordt aangegeven door een paarse pijl op de kaart van de plasmide, terwijl de universele primer van de M13R(-20) wordt aangegeven door een roze pijl op de plasmide-kaart. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

  1. Verteren de plasmide van CRISPR met een geschikte restrictie-enzym.
    Opmerking: De enzymen van de beperking van de IIs in het Golden Gate vergadering met type klonen van sgRNAs meestal afhankelijk. Verschillende enzymen kunnen worden gebruikt voor verschillende CRISPR plasmiden. Voor pSpCas9, BbsI of BplI te gebruiken (Zie Figuur 3). Voor pSaCas9, pNmCas9, pAsCas12a en pLbCas12a, gebruikt u BsmBI.
    1. Voorbereiden van een 20 µL reactie mix met 1 microgram van circulaire plasmide vector, 2 µL van buffer (10 x), 1 µL van het restrictie-enzym (b.v., BbsI, BplI of BsmBI) en ddH2O tot een eindvolume van 20 µL. Incubeer de reactie bij 37 ° C gedurende 2,5 uur.
    2. Voeg 1 µL van garnalen alkalisch fosfatase (SAP) met de reactie en Incubeer bij 37 ° C gedurende een ander 30 minuten.
    3. Doven de reactie door toevoeging van 5 µL van 6 x DNA laden kleurstof (Zie Tabel of Materials), mix goed, en de reactie op een 0,8% agarose gel met 1 x tris-acetaat-EDTA (TAE)-buffer op te lossen. Vervolgens, de juiste band accijnzen en overgaan tot het gel zuiveren de gelineariseerde vector.
  2. Het afbinden van de ontharde oligonucleotides in het verteerd CRISPR plasmide.
    1. Een mix van 10 µL reactie voor te bereiden: 50 ng van gelineariseerde vector, 1 µL van verdunde ontharde oligonucleotides, 1 µL van T4 DNA ligase buffer (10 x), 1 µL van T4 DNA ligase en ddH2O tot een eindvolume van 10 µL (Zie Tabel van materialen). Incubeer de reactie bij 16 ° C's nachts of bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
      Opmerking: Om te versnellen het proces van de afbinding, gebruik van geconcentreerde T4 DNA ligase en Incubeer de mix van de reactie bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten (Zie Tabel van materialen).
  3. Ligaturen producten omvormen chemisch bevoegde E. coli cellen (Zie aanvullende bestand 1). Verspreid de getransformeerde bacteriecellen op een LB agarplaat met 100 µg/mL ampicilline.
  4. Presteren kolonie polymerase-kettingreactie (PCR) om te identificeren van de bacteriën met invoegen.
    1. Twee sets van steriele PCR strip buizen voor te bereiden. In Set 1, toevoegen van 4,7 µL van ddH2O, terwijl in Set 2, voeg 50 µL van de pond-Bouillon met passende antibioticum (bijvoorbeeld 100 µg/mL ampicilline).
    2. Met een steriele Pipetteer tip, kies een kolonie uit de plaat, jat het kort in een buis Set 1, en laat het uiteinde in een Set 2-buis. Herhaal voor een paar kolonies, ervoor zorgend om het gebruik van verschillende PCR buizen elke keer.
      Opmerking: Screening van vier kolonies is meestal voldoende. Echter, dit kan variëren afhankelijk van de kloneringsefficiëntie.
    3. De volgende reagentia toevoegen aan elke Set 1 buis (voor een 10 µL PCR): 5 µL van 2 x PCR master mix (met laden kleurstof, Zie Tabel of Materials), 0,15 µL van gevoel of antisense oligonucleotide (100 µM), 0,15 µL primer (100 µM) gericht op de CRISPR plasmide stroomafwaarts of omhoog stroom van de cassette sgRNA respectievelijk (Zie Figuur 3).
      Opmerking: Het PCR product moet idealiter opleveren voor de grootte van een product van ongeveer 150 bp of groter, dus dat ieder positieve banden zijn niet vergis als inleidingsdimeer.
    4. De PCRs uitvoeren in een thermische cycler met behulp van de volgende parameters: 95 ° C gedurende 3 min, 95 ° C gedurende 30 s (stap 2), 60 ° C gedurende 30 s (stap 3), 72 ° C gedurende 30 s (stap 4), herhaal stappen 2\u20124 voor een ander 34 cycli, 72 ° C gedurende 5 minuten , en houd bij 4 ° C.
      Opmerking: De onthardende temperatuur van 60 ° C mogelijk moet worden geoptimaliseerd voor de inleidingen ontworpen. De tijd van de rek van 30 s kan ook variëren naargelang de verwachte PCR amplicon grootte en de polymerase van DNA gebruikt.
    5. De reacties op een 1% agarose gel met 1 x TAE buffer oplossen.
    6. Inoculeer een kolonie die een positieve band in PCR door overdracht van 50 µL van de cultuur van de bijbehorende Set 2-buis in een grotere conische buis met 5 mL LB met een geschikt antibioticum oplevert. Laat de cultuur groeien 's nachts in een 37 ° C incubator shaker.
    7. Isoleren van plasmiden uit het nachtelijke cultuur met behulp een miniprep kit (Zie Tabel of Materials), en het volgnummer van het monster met behulp van de kolonie PCR primer thats niet de zin of antisense oligonucleotide (hU6_forward of M13R(-20) in Figuur 3).
      Opmerking: Indien nodig, uitvoeren van een maxiprep van de reeks-gecontroleerd CRISPR plasmide te verkrijgen van een groter bedrag voor downstream experimenten.

3. ontwerp en synthese van reparatie sjablonen

Opmerking: Voor precisie-engineering genoom, een sjabloon opgeven de gewenste DNA wijzigingen moet worden verstrekt samen met de CRISPR reagentia. Voor kleine DNA bewerkingen zoals wijziging van een single nucleotide zijn ssODN donor sjablonen meest geschikte (zie punt 3.1). Voor grotere DNA bewerkingen zoals inbrengen van een GFP tag 5' of 3' van een bepaald eiwit-codeert gen, plasmide donor sjablonen zijn meest geschikte (zie paragraaf 3.2).

  1. Ontwerpen en synthetiseren van een sjabloon van de donor ssODN (Zie Figuur 4).
    1. Bepaal dat de juiste onderdeel waarvan volgorde de sjabloon moet volgen.
      Opmerking: Cas12a vertoont een voorkeur voor ssODNs van de doelsoort strand-reeks, terwijl Cas9 een voorkeur vertoont voor ssODNs van de doel-streng volgnummer in plaats daarvan25 (Zie Figuur 4een).
    2. Ervoor zorgen dat de gerepareerde volgorde niet targetable door de geselecteerde Cas nuclease opnieuw. Bijvoorbeeld, de PAM op zodanige wijze dat er geen verandering van de aminozuur is muteren of elimineren de PAM uit de sjabloon van de donor als er geen functionele gevolgen. Gebruik het voorbeeld in Figuur 4b als een gids, indien nodig.
    3. Beslissen als een symmetrisch of asymmetrisch donor-sjabloon is gewenst. Voor symmetrische donors, ervoor zorgen dat elke arm van de homologie flankerende de DNA wijziging site ten minste 17 nt lang25. Gebruik voor asymmetrische donor sjablonen, langere armen 5 ' van de gewenste DNA veranderingen (Zie Figuur 4een). Nog belangrijker is, ervoor zorgen dat de kortere arm rond 37 nt in lengte, terwijl de andere homologie tak ongeveer 77 nt in lengte25,39.
    4. De ontworpen sjabloon als een stuk single-stranded DNA synthetiseren.
      Opmerking: Asymmetrische ssODNs kan, maar niet altijd, vertonen hogere HDR efficiëntie dan symmetrische ssODNs. Een asymmetrische donor meestal presteert over het algemeen ten minste evenals een symmetrische donor, wanneer correct ontworpen. De asymmetrische sjabloon kost echter veel meer want het is langer en daarom polyacrylamide-gel elektroforese (pagina) zuivering of een speciale synthese-procedure vereist. Routine gene uitsparingen meestal afhankelijk van de NHEJ reparatie pathway en vereisen geen een reparatie-sjabloon. Echter, als de knock-out-efficiëntie laag is, ontwerpsjabloon een ssODN donor die een frameshift mutatie bevat en ten minste 120 nt in lengte25,40.

figure-protocol-3
Figuur 4 : Ontwerp van ssODN donor sjablonen. (een) Schematische illustratie van diverse mogelijke uitvoeringen. De rode horizontale rechthoeken geven de doelsoort (NT) strand, terwijl de blauwe rechthoeken het doel (T)-onderdeel geven. Bovendien, geven de kleine groene rechthoeken de gewenste DNA wijzigingen (bijvoorbeeld wijzigingen in één nucleotide). Wanneer een symmetrische ssODN wordt gebruikt, de minimumlengte voor elke homologie arm moet ten minste 17 nt (maar kan langer). Voor asymmetrische ssODNs lijkt de ssODN van 37/77 T optimaal is voor SpCas9-geïnduceerde HDR, terwijl de 77/37 NT ssODN lijkt te zijn optimaal voor Cas12a-geïnduceerde HDR. L = links homologie arm; R = rechts homologie arm. (b) een specifiek voorbeeld demonstreren hoe ssODN ontwerpsjablonen. Hier is de doelgroep genomic locus exon 45 van de menselijke CACNA1D-gen. De PAM voor Cas9 is roze en onderstreepte, terwijl de PAM voor Cas12a is bruin en onderstreept. Het doel is het creëren van een missense Mutatie (gemarkeerd in groen) door het omzetten van AGU (codering serine) aan AGG (codering arginine). Om te voorkomen dat opnieuw richten door Cas12a, is de TTTC PAM gemuteerd naar CTTC. Merk op dat er is geen verandering in aminozuur (UAU en UAC beide voor tyrosine code). Voorkom verdere opnieuw richten door Cas9 en een AGU codon is vervangen door een UCC codon (vet), beide van die code voor serine. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

  1. Ontwerp en een passende plasmide donor sjabloon kloon. Bijvoorbeeld, een opeenvolging van de GFP geflankeerd door lange armen die homoloog aan de genomic locus doel kan bevatten (Zie Figuur 5).
    1. Ervoor zorgen dat de gewijzigde volgorde niet targetable door de geselecteerde Cas nuclease opnieuw. Bijvoorbeeld, kan de protospacer worden verdeeld door de ingevoegde (GFP)-tag. Anderzijds kan de PAM worden gemuteerd of verwijderd uit de sjabloon van de donor zodanig dat heeft geen invloed op de genfunctie.
    2. Versterken van de armen van de homologie van genomic DNA met PCR. De lengte van elke geleding homologie is meestal 1000 tot 1500 bp.
      Opmerking: Om te vergemakkelijken klonen, ervoor te zorgen dat de voorwaartse primer voor de linker homologie arm en de omgekeerde primer voor de juiste homologie arm elk minstens 20 nt overlapping van reeks met een geselecteerde vector-backbone. Daarnaast zorgen ervoor dat het omgekeerde primer voor de linker homologie arm en de voorwaartse primer voor de juiste homologie arm bepaalde overlappende reeksen met de epitoop tag ook.
    3. Kloon van de twee takken van de homologie en de (GFP)-tag in de ruggengraat van de vector met behulp van Gibson vergadering41 (Zie de Tabel van de materialen). Controleer of de plasmide door Sanger sequencing met behulp van vooruit en omgekeerde inleidingen die bedrijven stroomopwaarts en stroomafwaarts van de donor sjabloon respectievelijk.
      Opmerking: Sanger rangschikken is wijd en goedkoop beschikbaar als commerciële dienstverlening. Stuur een aliquoot gedeelte van het plasmide samen met de sequencing inleidingen aan een serviceprovider.
    4. Linearize de donor-sjabloon met een restrictie-enzym dat het plasmide slechts eenmaal stroomopwaarts van de linker homologie arm of stroomafwaarts van de juiste homologie-arm snijdt.
      Opmerking: Onlangs, double-cut donateur, die wordt geflankeerd door de sgRNA-PAM sequenties en wordt vrijgegeven van de plasmide na splitsing door de overeenkomstige Cas nuclease, heeft aangetoond dat HDR efficiëntie42verhogen. Wanneer de sgRNA-PAM sequenties worden ingevoegd stroomopwaarts en stroomafwaarts van de linker en rechter homologie wapens respectievelijk (bijvoorbeeld door Gibson vergadering), de lengte van de arm homologie mag worden verminderd tot 300 bp en er is geen behoefte aan het plasmide linearize.

figure-protocol-4
Figuur 5 : Ontwerp en klonen van een plasmide donor sjabloon. (een) het doel in dit specifieke voorbeeld is om te fuseren P2A-GFP aan de C-terminus van het eiwit CLTA. De blauwe horizontale rechthoek geeft de homologie linker arm, terwijl de rode horizontale rechthoek de juiste homologie-arm aangeeft. Hoofdletters geven eiwit-codeert sequenties, terwijl de kleine letters geven aan van niet-coderende sequenties. De PAMs voor SpCas9 en Cas12a worden onderstreept en cursief weergegeven. (b) een plasmide donor sjabloon die kan worden gebruikt om te taggen endogeen P2A-GFP in het C-terminus van CLTA. De meegeleverde primer sequenties kunnen worden gebruikt om klonen van de plasmide door Gibson vergadering. De PCR voorwaarden zijn als volgt: 98 ° C gedurende 3 minuten, 98 ° C gedurende 30 s (stap 2), 63 ° C gedurende 30 s (stap 3), 72 ° C gedurende 1 min (stap 4), herhaal stappen 2\u20124 voor een ander 34 cycli, 72 ° C gedurende 3 minuten, en houd bij 4 ° C. Zwarte letters corresponderen met vector sequenties, blauwe letters corresponderen met de linker homologie-arm, groene letters corresponderen met P2A-GFP en rode letters corresponderen met de juiste homologie-arm. Merk op dat zodra de codering P2A-GFP volgorde is met succes geïntegreerd in de target-locus, opnieuw richten door SpCas9 niet mogelijk, sinds slechts 9 zijn zal nt van de protospacer (GTGCACCAG) zal worden intact gelaten. Bovendien, om te voorkomen dat opnieuw richten door Cas12a, drie basepairs onmiddellijk stroomafwaarts van de STOP codon (in vet) worden verwijderd uit de plasmide-reeks. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

4. cel transfectie

Opmerking: De overige delen van het protocol worden geschreven met HEK293T cellen in het achterhoofd. Het gebruikte kweekmedium bestaat van Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 4,5 g/L glucose, 10% foetale runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine en 0,1% penicilline/streptomycine. Verschillende stappen van het protocol wellicht worden gewijzigd volgens de regel van de daadwerkelijke cel gebruikt. Alle wordt cel cultuur gewerkt in een klasse II bioveiligheid kabinet om een steriele werkomgeving.

  1. Zaad 1.8 x 105 cellen in een 24-well weefselkweek bord één dag voorafgaand aan de transfectie.
    1. De cellen van elkaar gescheiden door de aspirating van de media en vervolgens toe te voegen 150 µL 0,25% trypsine-EDTA per putje. Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 2 minuten.
    2. De trypsine neutraliseren door toevoeging van 150 µL (of 1 x volume) van de voedingsbodems van de cel. De celsuspensie overbrengen in een conische buis. Spin down de cellen in een bench top centrifuge op 1000 x g gedurende 5 minuten.
    3. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer met 5 mL van de voedingsbodems van de cel. In een aparte centrifugebuis, aliquoot 10 µL van 0.4% trypan blauw-oplossing. Dan, Voeg in 10 µL geresuspendeerde cellen uit stap 4.1.2 en meng.
    4. Pipetteer 10 µL van het mengsel (cellen + trypan blauw) in een hemocytometer. Ga naar de cellen tellen handmatig of door middel van een geautomatiseerde cel itemlogboeken.
    5. Zaad 1.8 x 105 cellen in één putje van de plaat van een 24-well weefselkweek.
  2. Bereiden van een mix van de transfectie met ofwel 500 ng CRISPR plasmide (voor het bewerken van NHEJ-gemedieerde) of 300 ng CRISPR plasmide en 300 ng van donor-sjabloon (voor HDR-gemedieerde bewerking), volgens de instructies bij de transfectiereagens (Zie Tabel van materialen). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende de Aanbevolen tijdsduur (meestal rond de 10\u201220 min).
  3. De transfectie mix toevoegen aan de cellen op een dropwise manier, en zachtjes swirl de plaat na.
  4. Incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 lucht incubator voor 24 h (voor NHEJ gebaseerde experimenten) of 72 h (voor HDR gebaseerde experimenten).

5. fluorescentie geactiveerd cell sorting (FACS) van transfected cellen

  1. De cellen door aspirating van de media en vervolgens toe te voegen 150 µL van 0,25% trypsine-EDTA per putje distantiëren. Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 2 minuten.
  2. De trypsine neutraliseren door toevoeging van 150 µL (of 1 x volume) van de voedingsbodems van de cel. De celsuspensie overbrengen in een centrifugebuis. Spin down de cellen in een microcentrifuge bij 235 x g gedurende 5 min.
  3. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de cellen met 2% foetale runderserum (FBS) in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). De cellen tot een maaswijdte van 30 µm filter of zeef in een tube van 5 mL FACS cel.
  4. Bereiden van een andere centrifugebuis met ongeveer 100 µL voedingsbodems of 2% FBS in PBS voor verzameling cellen.
  5. Poort op de stroom cytometer, de cellen met niet-transfected cellen als een negatieve controle. Sorteren en verzamelen van transfected cellen, volgens welke fluorescentie marker aanwezig op de CRISPR-plasmide gebruikt is. Bijvoorbeeld, als de plasmide een mCherry gen draagt, sorteren voor RFP-positieve cellen.
    Opmerking: Andere CRISPR plasmiden zal hebben verschillende selecteerbare merkers. De set van plasmiden, (pSpCas9, pSaCas9, pNmCas9, pAsCpf1 en pLbCpf1) gebruikt in dit evaluatieonderzoek dragen de oranje fluorescente proteïne (OFP) of het mCherry-gen.

6. uitbreiding van de individuele klonen

  1. Centrifugeer de gesorteerde cellen in een bench top centrifuge op maximale snelheid (18.000 x g) voor 5 min. Aspirate het supernatant en resuspendeer de pellet met 300 µL voedingsbodems. Zaad 200 µL cellen in een 24-well weefselkweek plaat en laat ze herstellen voor een paar dagen in een 37 ° C incubator. Houd de resterende 100 µL cellen voor sectie 7.
  2. Zodra de cellen steeds confluente beginnen, passage hen volgens stappen 4.1.1\u20124.1.3. Zaad de cellen dunbevolkte in een schotel weefselkweek 100 mm tot en met voldoende ruimte voor individuele kolonies groeien. Incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 lucht incubator.
    Opmerking: Probeer verschillende verdunningen. Afzonderlijke cellen moeten voldoende ruimte om te groeien als afzonderlijke kolonies. Echter kunnen ze ook niet overdreven schaars, zoals sommige cellijnen niet groeien goed wanneer het aantal cellen te weinig zijn.
  3. Zodra de kolonies beginnen te vormen, halen ze onder de Microscoop (met een 4 x vergroting) en plaats elke kloon in een individuele putje van een 24-well plaat die cel cultuurmedia bevat. Incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 lucht incubator totdat de cellen confluente worden.
    Opmerking: Een alternatief voor seriële verdunningen en kolonie picking is het gebruik van stroom cytometry te sorteren voor enkele cellen in een 96-wells-plaat. Dit kan echter niet werken voor sommige cellijnen die niet groeien goed wanneer er slechts één cel is.

7. evaluatie van het bewerken van efficiëntie

  1. Uittreksel genomic DNA door centrifugeren van de resterende 100 µL gesorteerd op cellen (uit stap 6.1) in een bench top centrifuge op maximale snelheid (18.000 x g) voor 5 min. Aspirate het supernatant en gaat u verder met het isoleren van genomic DNA met behulp van een extractie kit (Zie tabel van Materialen).
  2. Uitvoeren van de T7 endonuclease ik (T7EI) splijten assay (Zie Figuur 6).
    1. Instellen van een 50 µL PCR met 10 µL van het PCR reactie buffer (5 x), 1 µL van dNTP mix (10 mM), 2,5 µL van gebruiker gedefinieerde voorwaartse primer (10 µM), 2,5 µL van gebruiker gedefinieerde omgekeerde primer (10 µM), 0,5 µL van de polymerase van DNA, 2\u20125 µL van genomic DNA sjabloon (afhankelijk van hoeveel cellen hebben zijn gesorteerd op), klik vervolgens bovenaan maximaal 50 µL met ddH2O (Zie Tabel van materialen).
      Opmerking: De inleidingen zijn ontworpen om de flank van de target genomic locus en opbrengst die een PCR-product van rond 400\u2012700 bp. meestal een primer dichter is gepositioneerd op de gesneden site van het enzym Cas dan de andere primer, zodat het resultaat van de bepaling van de T7EI twee verschillende bands op een ag is gel is ontstaan (Zie Figuur 6).
    2. De PCR uitvoeren in een thermische cycler met de volgende parameters: 98 ° C gedurende 3 minuten, 98 ° C gedurende 30 s (stap 2), 63 ° C gedurende 30 s (stap 3), 72 ° C gedurende 30 s (stap 4), herhaal stappen 2\u20124 voor een ander 34 cycli, 72 ° C gedurende 2 minuten , en houd bij 4 ° C.
    3. De reactie op een 2% agarose gel met 1 x TAE buffer oplossen.
    4. Het PCR-product van de gel met een schone, scherpe scalpel accijnzen en het zuiveren van het DNA met behulp van een gel extractie kit, volgens de instructies van de fabrikant. Meten van de concentratie van het PCR-product met behulp van een spectrofotometer bij een golflengte van 260 nm extinctie (Zie Tabel van materialen).
    5. Bereiden van een mix van de assay met 200 ng van DNA, 2 µL van T7EI reactie buffer (10 x), en maximaal 19 µL met ddH2O bijgevuld (Zie Tabel van materialen).
    6. Opnieuw het ontharden van het PCR-product in een thermische cycler met behulp van de volgende parameters: 95 ° C gedurende 5 min, oprit tot 25 ° C op 6 ° C/min, houd vervolgens bij 4 ° C.
    7. 5 U T7EI toevoegen aan het opnieuw ontharde PCR product, meng goed door pipetteren en Incubeer bij 37 ° C gedurende 50 minuten.
    8. Het oplossen van het T7EI-verteerd DNA op een 2,5% agarose gel met 1 x TAE buffer.
    9. Afbeelding van de gel, kwantificeren van de intensiteiten van de band met behulp van ImageJ en berekenen van indel formatie met behulp van de volgende formule:
      figure-protocol-5
      Indien een vertegenwoordigt de intensiteit van het PCR-product intact en b en c komen overeen met de intensiteiten van de splitsingsproducten producten43.
      1. Om te kwantificeren van de intensiteit van een band in ImageJ, tekent eerst een rechthoekig vak rond de band als dicht bij de grens mogelijk. Ten tweede, klik op analyseren en vervolgens Instellen metingen. Controleer of het gebied, gemiddelde grijze waardeen geïntegreerde dichtheid opties zijn geselecteerd. Sluit het instellingenvenster door op okte klikken. Ten derde, klik op analyseren en vervolgens maatregel. Het gemiddelde of de RawIntDen waarde wordt gebruikt als de intensiteit van de band.

figure-protocol-6
Figuur 6 : Controle van cellen voor succesvolle genoom bewerken resultaten. (een) A schema illustreert twee algemeen gebruikte tests, namelijk het wanverhouding splijten assay met de T7 endonuclease ik enzym (T7EI) en de volgende generatie sequencing (NGS) of gerichte amplicon sequencing. De blauwe horizontale rechthoeken geven aan dat DNA en de gele cirkels geven wijzigingen geïnduceerd door de CRISPR-Cas-systeem. Inleidingen voor de bepaling van de T7E1 worden aangeduid in het groen, terwijl inleidingen voor het genereren van waarbij voor NGS worden aangeduid in het rood. (b) ontwerp van primer reeksen voor de T7EI decollete assay en voor NGS. Hier is de doelgroep genomic locus exon 45 van de menselijke CACNA1D-gen. De beoogde wijziging-site wordt aangeduid met een sterretje. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

  1. Uitvoeren van gerichte amplicon sequencing (Zie Figuur 6).
    1. PCR inleidingen aan het versterken van de target genomic locus ontwerpen. Plaats een van de inleidingen aan minder dan 100 bp maar meer dan 20 bp van de protospacer.
      Opmerking: Doorgaans de totale grootte van de PCR-product is ontworpen om te worden rond 150\u2012300 bp (Zie Figuur 6).
    2. Toevoegen van extra sequenties aan de inleidingen als volgt: (a) 5' \u2012GCGTTATCGAGGTC - NNNN-[vooruit Primer] – 3'; (b) 5' - GTGCTCTTCCGATCT-[omgekeerde Primer] –3'.
    3. Instellen van een 50 µL PCR reactie mix met 10 µL van het PCR reactie buffer (5 x), 1 µL van dNTP (10 mM), 5 µL primer een (10 µM), 5 µL van primer b (10 µM), 0,5 µL polymerase van DNA, 2\u20125 µL genomic DNA sjabloon (afhankelijk van hoeveel cellen zijn gesorteerd) , dan boven 50 µL met ddH20.
    4. De PCR uitvoeren in een thermische cycler met de volgende parameters: 98 ° C gedurende 3 minuten, 98 ° C gedurende 30 s (stap 2), 63 ° C gedurende 30 s (stap 3), 72 ° C gedurende 15 s (stap 4), herhaal stappen 2\u20124 voor een ander 34 cycli, 72 ° C gedurende 2 minuten , en houd bij 4 ° C.
    5. Los van de reactie op 2% agarose gel en zuiveren van het PCR-product met behulp van een gel extractie kit volgens de instructies van de fabrikant. Kwantificeren van het DNA met een spectrofotometer bij een golflengte van 260 nm extinctie (Zie de Tabel van de materialen).
    6. De volgende ronde 2 PCR inleidingen synthetiseren: (c) 5' \u2012 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCCTACACGAGCGTTATCGAGGTC – 3'; (d) 5' \u2012CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-[barcode] - GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'
    7. Instellen van een PCR-reactie van 20 µL mengen met 4 µL van het PCR reactie buffer (5 x), 0.4 µL van dNTP (10 mM), 2 µL van primer c (10 µM), 2 µL van primer d (10 µM), 0,2 µL van de polymerase van DNA, 2 µL van DNA-sjabloon (van stap 7.3.5 verdund 1:100), en 9.4 µL van ddH2O.
      Opmerking: De verdunningsfactor voor de DNA-sjabloon kan variëren afhankelijk van de oorspronkelijke concentratie. Als de concentratie rond 20\u201240 ng/µL is, gebruikt u een 1:100 verdunningsfactor. Bovendien, kies een andere barcode voor elk experimenteel monster, als de dezelfde primer een primer b in stap 7.3.3 worden gebruikt.
    8. De PCR uitvoeren in een thermische cycler met de volgende parameters: 98 ° C gedurende 3 minuten, 98 ° C gedurende 30 s (stap 2), 65 ° C gedurende 30 s (stap 3), 72 ° C gedurende 30 s (stap 4), herhaal stappen 2\u20124 voor een andere 14 cycli, 72 ° C gedurende 2 minuten , en 4 ° C houdt.
    9. Oplossen van 5 µL van elke reactie op een 2% agarose gel te bepalen het succes van het PCRs. combineren alle monsters samen (ervan uitgaande dat een verschillende barcode is gebruikt voor elk monster) en het schoonmaken van de gebundelde DNA met behulp van een PCR zuivering kit volgens fabrikant instructies. Als sommige van de PCRs vertonen meer dan één band (met vermelding van de aanwezigheid van niet-specifieke producten), een extra gel extractie stap uitvoeren.
    10. Volgnummer van de bibliotheek op een hoge doorvoersnelheid sequencing instrument (Zie Tabel van materialen) volgens de instructies van de fabrikant voor de productie van gepaarde 151 bp leest. De lezen 1 sequencing primer aangepaste ontworpen is en moet afzonderlijk worden verstrekt. De volgorde is als volgt: Read1_seq: 5'-CCACCGAGATCTACACCCTACACGAGCGTTATCGAGGTC-3'. Het lezen 2 sequencing primer en index sequencing primer zijn standaard en vindt u in het reagens cartridge.
      Opmerking: De T7EI assay en de sequencing van gerichte amplicon worden vaak gebruikt om de efficiëntie van het bewerken van het genoom te controleren. Echter kunnen andere experimenten worden uitgevoerd om te evalueren bewerken efficiëntie, afhankelijk van het type van DNA wijzigingen. Bijvoorbeeld, als een beperkingsplaats is gemaakt op de doelsite, kan een beperking fragment length polymorphism (RFLP) test worden uitgevoerd. Het is vergelijkbaar met de bepaling van de T7EI, behalve dat een beperking endonuclease wordt gebruikt voor het verteren van het PCR-product in plaats daarvan.

8. de screening van de individuele klonen

  1. Vanaf stap 6.3, door de cellen te splitsen, zodra ze beginnen met het krijgen van confluente. Voor elke individuele kloon, verzamelen van de resterende cellen en haal genomic DNA volgens stap 7.1.
  2. De bepaling van de T7EI voor de individuele klonen volgens paragraaf 7.2, met uitzondering van één wijziging uitvoeren. Versterken van de target genomic locus van wildtype cellen en in stap 7.2.5, in plaats van met behulp van 200 ng van test DNA alleen, mix 100 ng van DNA test met 100 ng van wildtype DNA.
    Opmerking: De reden voor de gewijzigde stap is dat sommige klonen eventueel hebben ondergaan succesvolle biallelic conversie en homozygoot mutanten zijn. In dergelijke gevallen zullen er geen decolleté bands in de bepaling van de T7EI als de wildtype DNA is niet vermengd.
  3. Het volgnummer van de doelsite in de klonen die decollete bands in de bepaling van de T7EI vertonen.
    1. Versterken van de gemodificeerde genomic locus volgens stappen 7.2.1–7.2.4.
    2. Instellen van de volgende klonen reactie: 4 µL van het PCR-product, 1 µL van zoutoplossing, 1 µL van TOPO vector (Zie de Tabel van de materialen).
    3. Meng zachtjes door pipetteren en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 5 minuten staan.
    4. 3 µL van het mengsel reactie omvormen chemisch bevoegde E. coli cellen (zoals TOP10 of Stbl3) (Zie aanvullende bestand 1). Verspreid de getransformeerde bacteriecellen op een LB agarplaat met 50 μg/mL kanamycine.
    5. De volgende dag, beënten ten minste 10 kolonies in vloeibare media LB met 50 μg/mL kanamycine.
    6. Wanneer de bacteriele troebel, isoleren de plasmiden met behulp van een miniprep kit (Zie Tabel van materialen) en sequence ze met behulp van de standaard M13 vooruit of omgekeerde primer M13.
  4. Het uitvoeren van een westelijke vlek (ook bekend als immunoblot) om te bepalen van de afwezigheid of de aanwezigheid van de gerichte proteïne (als het genoom bewerken experiment een gen eiwit-codeert via frameshift mutaties uitsparen betreft). Zie aanvullende bestand 1.
    Opmerking: Andere experimenten kunnen worden uitgevoerd om de uitvoering van de gewenste genomic wijzigingen kloon vast te stellen. Een fenotypische assay kan bijvoorbeeld worden uitgevoerd als een bepaald gen uitsparen is bekend dat bepaalde veranderingen in cellulaire gedrag veroorzaken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Voor het uitvoeren van een experiment, een CRISPR-plasmide uiting geven aan een sgRNA gericht op die de locus-of-interest moet worden gekloond bewerken genoom. Ten eerste, de plasmide wordt verteerd met een restrictie-enzym (meestal een type IIs enzym) aan het linearize. Het is raadzaam om op te lossen het verteerd product op een 1% agarose gel naast een onverteerd plasmide onderscheid maken tussen een volledige en gedeeltelijke vertering. Zoals onverteerd plasmiden supercoiled, ze de neiging om sneller dan hun gelineari...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het CRISPR-Cas-systeem is een krachtige, revolutionaire technologie om ingenieur van het genoom en de transcriptomes van planten en dieren. Talrijke bacteriesoorten bleken te bevatten van de CRISPR-Cas systemen, die potentieel kunnen worden aangepast voor genoom en transcriptome engineering doeleinden44. Hoewel de endonuclease van de Cas9 van Streptococcus pyogenes (SpCas9) was het eerste enzym met succes worden ingezet in menselijke cellen21,

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

M.H.T. wordt ondersteund door een Agentschap voor wetenschap, technologie en onderzoek de gezamenlijke Raad Office grant (1431AFG103), een nationale Medical Research Council verlenen (OFIRG/0017/2016), National Research Foundation verleent (NRF2013-THE001-046 en NRF2013-THE001-093), een Ministerie van onderwijs Tier 1 grant (RG50/17 (S)), een startup verlenen vanaf Nanyang Technological University, en fondsen voor de internationale genetisch Engineering Machine (iGEM) concurrentie van Nanyang Technological University.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
T4 Polynucleotide Kinase (PNK)NEBM0201
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)NEBM0371
Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X1st BaseBUF-3000-50X4LVerdunn tot 1X voor gebruik. De 1X oplossing bevat 40 mM Tris, 20 mM azijnzuur en 1 mM EDTA.
Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X1st BaseBUF-3020-10X4LVerdunn tot 1X voor gebruik. De 1X oplossing bevat 10 mM Tris (pH 8,0) en 1 mM EDTA. 
BbsINEBR0539
BsmBINEBR0580
T4 DNA LigaseNEBM0202400.000 eenheden/ml
Quick Ligation KitNEBM2200Een alternatief voor T4 DNA Ligase.
Rapid DNA Ligation KitThermo ScientificK1423Een alternatief voor T4 DNA Ligase.
Zero Blunt TOPO PCR Cloning KitThermo Scientific451245De zout oplossing komt met de TOPO vector in de kit.
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNEBE2621LKit voor Gibson assembly.
One Shot Stbl3 Chemically Competent E.ColiThermo ScientificC737303
LB Broth (Lennox), poederSigma AldrichL3022Reconstitueer in ddH20, en autoclaveer voor gebruik
LB Broth met Agar (Lennox), poederSigma AldrichL2897Reconstitueer in ddH20, en autoclaveer voor gebruik
SOC media--2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM glucose in 1 L LB Broth
Ampicilline (Natrium), USP-kwaliteitGold BiotechnologyA-301
REDiant 2X PCR Mastermix1st BaseBIO-5185
Agarose1st BaseBIO-1000
T7 Endonuclease INEBM0302
Plasmid DNA Extractie Miniprep KitFavorgenFAPDE 300
Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM), Hoge GlucoseHycloneSH30081.014,5 g/L Glucose, geen L-glutamine, HEPES en Sodium Pyruvaat
L-Glutamine, 200mMGibco25030
Penicilline-Streptomycine, 10.000U/mLGibco15140
0,25% Trypsin-EDTA, 1XGibco25200
Fetaal Rund SerumHycloneSV30160FBS wordt voor gebruik gedurende 30 min bij 56 oC verhit en inactief gemaakt
Fosfaat Gebufferde Saline, 1XGibco20012
jetPRIME transfectiereagensPolyplus Transfection114-75
QuickExtract DNA Extractie Oplossing, 1.0EpicentreLUCG-QE09050
ISOLATE II Genomic DNA KitBiolineBIO-52067Een alternatief voor QuickExtract
Q5 High-Fidelity DNA PolymeraseNEBM0491
Deoxynucleotide (dNTP) Oplossing MixNEBN0447
6X DNA Loading DyeThermo ScientificR061110 mM Tris-HCl (pH 7,6) 0,03% broomfenolblauw, 0,03% xyleen cyaan FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA
Protease Inhibitor Cocktail, Set3Merck539134
Nitrocellulose membraan, 0,2µmBio-Rad1620112
Tris-glycine-SDS buffer, 10XBio-Rad1610772Verdunn tot 1X voor gebruik. De 1x oplossing bevat 25 mM Tris, 192 mM glycine en 0,1% SDS.
Tris-glycine buffer, 10X1st baseBUF-2020Verdunn tot 1X voor gebruik. De 1x oplossing bevat 25 mM Tris en 192 mM glycine.
Ponceau S oplossingSigma AldrichP7170
TBS, 20X1st baseBUF-3030Verdunn tot 1X voor gebruik. De 1x oplossing bevat 25 mM Tris-HCl (pH 7,5) en 150 mM NaCl.
Tween 20Sigma AldrichP9416
Skim Milk voor immunoassayNacalai Tesque31149-75
WesternBright Sirius-femtogram HRPAdvanstaK12043
Antilichaam voor β-actine (C4)Santa Cruz Biotechnologysc-47778Lotnummer: C0916
MiSeq systeemIlluminaSY-410-1003
NanoDrop spectrofotometerThermo ScientificND-2000
Qubit fluorometerThermo ScientificQ33226
EVOS FL CelbeeldingsysteemThermo ScientificAMF4300
CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)Addgene48138Single vector systeem: De gRNA wordt uitgedrukt vanuit hetzelfde plasmide.
CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpAAddgene61591Single vector systeem: De gRNA wordt uitgedrukt vanuit hetzelfde plasmide.
CRISPR plasmid: xCas9 3.7Addgene108379Dual vector systeem: De gRNA wordt uitgedrukt vanuit een ander plasmide.
CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9Addgene42230Single vector systeem: De gRNA wordt uitgedrukt vanuit hetzelfde plasmide.
CRISPR

Referenties

  1. Epinat, J. C., et al. A novel engineered meganuclease induces homologous recombination in yeast and mammalian cells. Nucleic Acids Research. 31 (11), 2952-2962 (2003).
  2. Arnould, S., et al. Engineered I-CreI derivatives cleaving sequences from the human XPC gene can induce highly efficient gene correction in mammalian cells. Journal of Molecular Biology. 371 (1), 49-65 (2007).
  3. Chapdelaine, P., Pichavant, C., Rousseau, J., Paques, F., Tremblay, J. P. Meganucleases can restore the reading frame of a mutated dystrophin. Gene Therapy. 17 (7), 846-858 (2010).
  4. Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188 (4), 773-782 (2011).
  5. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
  6. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nature Biotechnology. 29 (2), 143-148 (2011).
  7. Zhang, F., et al. Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription. Nature Biotechnology. 29 (2), 149-153 (2011).
  8. Boch, J., et al. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).
  9. Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501(2009).
  10. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  11. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
  12. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  13. Nishimasu, H., et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell. 156 (5), 935-949 (2014).
  14. Yamano, T., et al. Crystal Structure of Cpf1 in Complex with Guide RNA and Target DNA. Cell. 165 (4), 949-962 (2016).
  15. Swarts, D. C., Mosterd, C., van Passel, M. W., Brouns, S. J. CRISPR interference directs strand specific spacer acquisition. PLoS One. 7 (4), e35888(2012).
  16. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  17. Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).
  18. Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
  19. Kleinstiver, B. P., et al. Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition. Nature Biotechnology. 33 (12), 1293-1298 (2015).
  20. Kleinstiver, B. P., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).
  21. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  22. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  23. Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, e00471(2013).
  24. Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).
  25. Wang, Y., et al. Systematic evaluation of CRISPR-Cas systems reveals design principles for genome editing in human cells. Genome Biology. 19 (1), 62(2018).
  26. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
  27. Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (39), 15644-15649 (2013).
  28. Kim, E., et al. In vivo genome editing with a small Cas9 orthologue derived from Campylobacter jejuni. Nature Communications. 8, 14500(2017).
  29. Edraki, A., et al. A Compact, High-Accuracy Cas9 with a Dinucleotide PAM for In Vivo Genome Editing. Molecular Cell. , (2018).
  30. Chatterjee, P., Jakimo, N., Jacobson, J. M. Minimal PAM specificity of a highly similar SpCas9 ortholog. Science Advances. 4 (10), (2018).
  31. Muller, M., et al. Streptococcus thermophilus CRISPR-Cas9 Systems Enable Specific Editing of the Human Genome. Mol Therapy. 24 (3), 636-644 (2016).
  32. Esvelt, K. M., et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nature Methods. 10 (11), 1116-1121 (2013).
  33. Boratyn, G. M., et al. BLAST: a more efficient report with usability improvements. Nucleic Acids Research. 41 (Web Server issue), W29-W33 (2013).
  34. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  35. Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
  36. Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nature Methods. 11 (2), 122-123 (2014).
  37. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148(2016).
  38. Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).
  39. Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
  40. Richardson, C. D., Ray, G. J., Bray, N. L., Corn, J. E. Non-homologous DNA increases gene disruption efficiency by altering DNA repair outcomes. Nature Communications. 7, 12463(2016).
  41. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  42. Zhang, J. P., et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biology. 18 (1), 35(2017).
  43. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  44. Shmakov, S., et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).
  45. Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPR-Cpf1 mediates efficient homology-directed repair and temperature-controlled genome editing. Nature Communications. 8 (1), 2024(2017).
  46. Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766(2014).
  47. Yang, L., et al. Optimization of scarless human stem cell genome editing. Nucleic Acids Research. 41 (19), 9049-9061 (2013).
  48. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

CRISPR Cas9zoogdiercellenceltransfectieflowcytometrieT7 endonucleasedetectiekolonie PCRWestern blotDNA extractiecelklonering

Gerelateerde artikelen