Methodenartikel

Manipulatie van de genfunctie in Mexicaanse Cavefish

DOI:

10.3791/59093

⸱

22 april 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University, 2Jupiter Life Science Initiative, Florida Atlantic University, 3Harriet L. Wilkes Honors College, Florida Atlantic University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven benaderingen voor het manipuleren van genen in het evolutionair modelsysteem Astyanax mexicanus. Drie verschillende technieken worden beschreven: Tol2-gemedieerde Transgenese, gerichte manipulatie van het genoom met behulp van CRISPR/Cas9 en knockdown van meningsuiting met behulp van morpholinos. Deze hulpmiddelen moeten vergemakkelijken het directe onderzoek van genen die ten grondslag liggen aan de variatie tussen oppervlak - en grot-woning vormen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grot dieren vormen een dwingende systeem voor onderzoek naar de evolutionaire mechanismen en genetische basis ten grondslag liggen aan veranderingen in talrijke complexe eigenschappen, met inbegrip van oog degeneratie, albinisme slaap verlies, hyperphagia en zintuiglijke verwerking. Soorten cavefish van over de hele wereld weergeven een convergente evolutie van morfologische en gedrags eigenschappen als gevolg van gedeelde belasting van het milieu tussen verschillende grot systemen Divers grot soorten hebben onderzocht in het laboratorium-omgeving. De Mexicaanse tetra, Astyanax mexicanus, met slechtzienden en blinden vormen, heeft unieke inzicht in biologische en moleculaire processen die ten grondslag liggen aan de evolutie van complexe eigenschappen en is goed klaar als een opkomende modelsysteem. Terwijl in A. mexicanus kandidaat-genen regulering van de evolutie van de verschillende biologische processen zijn vastgesteld, is de mogelijkheid voor het valideren van een rol voor afzonderlijke genen beperkt gebleven. De toepassingvan Transgenese en bewerken van gen technologie heeft het potentieel om te overwinnen deze aanzienlijke belemmering en te onderzoeken van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de evolutie van complexe eigenschappen. Hier beschrijven we een andere methode voor het manipuleren van genexpressie in A. mexicanus. Benaderingen omvatten het gebruik van morpholinos, Tol2 Transgenese, en gen-editing systemen, gebruikte in zebrafish en andere vissen huizen modellen, te manipuleren van de genfunctie in A. mexicanus. Deze protocollen bevatten gedetailleerde beschrijvingen van getimede fokken procedures, de collectie van bevruchte eieren, injecties en de selectie van genetisch gemodificeerde dieren. Voor het onderzoek naar de genetische en neurale mechanismen die ten grondslag liggen aan de evolutie van de diverse eigenschappen in A. mexicanustoestaat deze methodologische benaderingen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sinds Darwins Origin of Species1, hebben de wetenschappers diepgaande inzichten in hoe eigenschappen evolutionair worden gevormd in reactie op bepaalde milieu- en ecologische druk, dankzij grot organismen2opgedaan. De Mexicaanse tetra, A. mexicanus, bestaat uit eyed voorouderlijke 'oppervlak' populaties die bewonen rivieren in Mexico en Zuid-Texas en van ten minste 29 geografisch geïsoleerde populaties van afgeleide grot morphs bevolken de Sierra del Abra en andere gebieden van Noordoost Mexico3. Een aantal grot-geassocieerde kenmerken zijn geïdentificeerd in A. mexicanus, waaronder veranderde zuurstofverbruik depigmentatie, verlies van ogen en voeding en gedrag4,5,6, foerageren veranderd 7,8,9. A. mexicanus presenteert een krachtig model voor het onderzoek naar mechanismen van convergente evolutie als gevolg van een welomschreven evolutionaire geschiedenis, een gedetailleerde karakterisering van de ecologische omgeving en de aanwezigheid van onafhankelijk geëvolueerd grot populaties10,11. Veel van de grot-afgeleide eigenschappen die aanwezig zijn in cavefish, met inbegrip van verlies van het oog verlies slapen, verhoogde voederen, verlies van scholing, agressie, verminderd en verminderd stress reacties, geëvolueerd zijn meerdere malen door onafhankelijke oorsprong, vaak met behulp van verschillende genetische routes tussen grotten8,12,13,14,15. Dit herhaald evolution is een krachtige aspect van het systeem van A. mexicanus en bieden inzicht in de meer algemene kwestie van hoe genetische systemen voor het genereren van soortgelijke fenotypen kan worden verstoord.

Terwijl de toepassing van genetische technologie voor het mechanistisch onderzoek van de genfunctie heeft is beperkt in vele vissoorten (met inbegrip van A. mexicanus), vormen recente vooruitgang in de zebravis een basis voor de ontwikkeling van de genetische technologie in vis 16,17,18,19,20. Tal van hulpmiddelen worden veel gebruikt in zebrafish te manipuleren van genexpressie en de uitvoering van deze procedures lang zijn gestandaardiseerd. Bijvoorbeeld, de injectie van morfolino oligos (MOs) stadium de eencellige selectief blokkeert RNA en voorkomt de vertaling voor een korte tijd venster tijdens ontwikkeling21,22. Bovendien, bewerken van gene benaderingen, zoals geclusterd regelmatig korte palindromische herhaalt (CRISPR) interspaced / CRISPR-geassocieerde proteïne 9 (Cas9) en transcriptie activator-achtige effector nuclease (TALEN), toestaan voor de generatie van gedefinieerde verwijderingen of, in sommige gevallen, invoegingen door middel van een recombinatie in genomes19,,20,,23,24. Transgenese wordt gebruikt voor het manipuleren van stabiele genexpressie of functie in een celtype specifieke wijze. Het Tol2 systeem effectief wordt gebruikt voor het genereren van transgene dieren door coinjecting transposase mRNA met een Tol2 DNA plasmide met een transgenic25,26. Het Tol2 -systeem maakt gebruik van de Tol2 transposase van medaka voor het genereren van stabiele germline inlassingen uit transgene construct17. Genereren van Tol2 transgenics houdt een plasmide met een transgenic geflankeerd door Tol2 integratie sites en mRNA voor Tol2 transposase17coinjecting. Dit systeem is gebruikt voor het genereren van een matrix van transgene lijnen in de zebravis en het gebruik ervan heeft onlangs uitgebreid tot extra opkomende modelsystemen, waaronder cichliden killifish, de stekelbaars, en, meer recentelijk, de Mexicaanse cavefish27, 28,29,30.

Terwijl de cavefish een fascinerende biologische systeem voor informatief mechanismen van trait evolutie is, heeft zijn volledige vermogen als een evolutionaire model niet zijn volledig benut. Dit is gedeeltelijk te wijten aan een onvermogen om te manipuleren genetische en cellulaire functie direct31. Kandidaat-genen regulering van complexe eigenschappen zijn geïdentificeerd met behulp van kwantitatieve trait loci (QTL) studies, maar de validatie van deze kandidaat-genen is moeilijk32,33,34. Onlangs, voorbijgaande knockdown met behulp van morpholinos, gene bewerken met behulp van systemen voor CRISPR en TALEN en het gebruik van Tol2-gemedieerde Transgenese zijn gebruikt voor het onderzoeken van de genetische basis ten grondslag liggen aan een aantal eigenschappen35,36,37 ,38. De uitvoering en de standaardisatie van deze technieken zal toestaan voor manipulaties die ondervragen van de moleculaire en neurale basis van biologische eigenschappen, met inbegrip van de manipulatie van de genfunctie, de etikettering van gedefinieerde cel populaties, en de expressie van functionele verslaggevers. Overwegende dat de succesvolle tenuitvoerlegging van deze genetische hulpprogramma's voor het manipuleren van genen of cellulaire functie is aangetoond in opkomende modelsystemen, zijn gedetailleerde protocollen nog steeds ontbreekt in A. mexicanus.

A. mexicanus kritisch inzicht geven in de mechanismen van de evolutie in antwoord op een veranderende omgeving en presenteren van de mogelijkheid om nieuwe genen regulering van diverse eigenschappen te identificeren. Een aantal factoren suggereren dat A. mexicanus een uiterst hanteerbare model is voor de toepassing van gevestigde genomic instrumentarium momenteel in gevestigde genetische modellen, inclusief de mogelijkheid om de vis in de laboratoria, groot brood formaat, gemakkelijk te onderhouden transparantie, een gesequenceerd genoom en gedefinieerde gedrags assays39. Hier beschrijven we een methodologie voor het gebruik van morpholinos, Transgenese en gene bewerken in oppervlakte en grot populaties van A. mexicanus. De bredere toepassing van deze instrumenten in A. mexicanus zal zorgen voor een mechanistisch onderzoek naar de moleculaire processen die ten grondslag liggen aan de evolutie van ontwikkelingsstoornissen, fysiologische en gedragsmatige verschillen tussen cavefish en oppervlakte vissen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. morfolino oligo ontwerp

Opmerking: A. mexicanus reeksen zijn beschikbaar via het nationale centrum van Biotechnology Information (NCBI) gen en NCBI SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov), alsook vanuit de Ensembl genoom browser (https://www.ensembl.org). Bij het ontwerpen van een morfolino voor gebruik in beide vormen van oppervlakte - en grot-woning, is het cruciaal voor het identificeren van een genetische variatie tussen de morphs in dit stadium, zodat deze genetische gebieden kunnen worden vermeden als doelen voor morpholinos. Polymorfe afwijkingen binnen een doelsite morfolino kan leiden tot inefficiënt bindend. Het ontwerp is vergelijkbaar met andere systemen, vis, zoals zebrafish, en is eerder aangetoond effectief te werken in A. mexicanus21,36,,40.

  1. Ontwerp van de vertaling-blocking morpholinos
    Opmerking: Vertaling-blocking morpholinos blokkeren vertaling door binding aan de site van de endogene start en belemmeren translationeel machines van de opeenvolging van mRNA via sterische huidkleur bindend.
    1. De codering regio van het target-gen beginnen met de ATG start site te identificeren.
    2. De eerste 25 baseparen van de doel-reeks opnemen door te kopiëren-en-plakken, wordt de volgorde in een tekst-editor of lab-notebook.
    3. Met online software (bijvoorbeeld http://reverse-complement.com) of handmatige vertaling, genereren de omgekeerde aanvulling van de doel-reeks. Sla de resulterende omgekeerde aanvulling in een teksteditor of lab notebook.
    4. Bestel een morfolino met de aanvulling van de omgekeerde volgorde bij een bedrijf dat morfolino oligonucleotides genereert. Zie Tabel van materialen voor bedrijven.
  2. Ontwerp van splice-blocking morpholinos
    Opmerking: Morpholinos Splice-blokkerende blokkeren splicing en, waardoor de vorming van een volwassen mRNA-molecuul. Dit voorziet in een alternatieve methode knockdown wanneer de start sites zijn niet goed gedefinieerde, of een meer optimale aanpak wanneer validatie van knockdown via de Kettingreactie van de polymerase (PCR) is gewenst. Dit voordeel van splice-blocking morpholinos (over ATG-blokkerende MOs) is dat uitsluiting van de exon of intron opneming kan gemakkelijk worden beoordeeld met reverse-transcriptase (RT)-PCR, vergroten en verkleinen van verschillen gevisualiseerd op een gel. RT-PCR en gel elektroforese te bepalen morfolino werkzaamheid moet worden gedaan met behulp van standaard laboratorium procedures.
    1. Identificeren van de opeenvolging van de pre-mRNA van het gen van de doelgroep. Gebruik maken van beschikbare informatie van het genoom van de A. mexicanus via NCBI of Ensembl om te bepalen van intron-exon grenzen33.
    2. Target exon-intron (splice donor) of intron-exon grens (splice acceptor) sites voor intron opname of exon uitsluiting.
      Opmerking: Het spliceosoom normaal richt zich op een reeks van "GU" (U1 doel) in het intron op de 5' splice site en een reeks AG" ""op de 3' (U2) intronic splice doelsite. Onder normale omstandigheden binden het spliceosoom U1 en U2 subeenheden deze doel-sites op de volgorde van de pre-mRNA voor juiste splicing te voorkomen. Echter, als een van deze doel-sequenties is geblokkeerd door een morfolino, het spliceosoom gaan over tot de volgende beschikbare U1 of U2 site, intron uitsluiting of exon veroorzaakt in de opeenvolging van mRNA. Hierbij zal de planning/optimalisatie, afhankelijk van de aard van de doelgroep gene21. In het algemeen, een interne U1 site blokkeren de splice omgeleid naar de volgende beschikbare U1 site, waardoor een exon besnijdenis. Anderzijds blokkeren van de eerste of laatste splice kruising zorgt ervoor dat een opname intron omdat er geen andere site voor het omleiden van de splice aan. Reeks software gebruiken voor het voorspellen van het effect van verschillende uitsluitingen versus insluitsels. Voorspellingen kunnen aangeven potentiële leesraamverschuiving of voortijdige stop codonen, die een meer effectieve doelsite voor mRNA verstoring aangeeft.
    3. Zodra de doelsite is geïdentificeerd, wordt de reeks opnemen in een tekst-editor of lab-boek. Controleer of dat de doelsite is 25 basenparen (bp) lang.
    4. Met online software (bijvoorbeeld http://reverse-complement.com) of handmatige vertaling, genereren de omgekeerde aanvulling van de doel-reeks. De reeks opnemen in een tekst-editor of lab-boek.
    5. Bestel een morfolino met de aanvulling van de omgekeerde volgorde bij een bedrijf dat morfolino oligonucleotides genereert. Zie Tabel van materialen voor bedrijven van de steekproef.

2. Morpholinos voor injectie

Opmerking: Verschillende concentraties of volumes van MO injectie zal moeten worden uitgevoerd om de optimale concentratie te injecteren. Typische injecties hoeveelheden zijn 400 – 800 pg van MO. Het effect van morfolino knockdown kan aanhouden gedurende maximaal 6 dagen postinjection.

  1. De voorraad morfolino verkrijgen. De voorraad morfolino arriveert gelyofiliseerd. Hydrateren het met steriele H2O voorafgaand aan het gebruik van op de gewenste voorraad concentratie (bijvoorbeeld 4 mM). Bewaren bij-20 °C tot gebruik.

3. CRISPR gRNA ontwerp, in vitro transcriptie en voorbereiding

  1. CRISPR gRNA ontwerp
    Opmerking: gRNAs werden gegenereerd met behulp van de eerder gepubliceerde onderzoek door Varshney et al.40 en Wierson et al.41.
    1. Een genoom-browser gebruikt, identificeren de codering regio van het gen van belang. Met behulp van de genomic volgorde, identificeren van de opeenvolging van de target gRNA binnen een exon door te zoeken naar een 20 bp nucleotide doel sequencing begint met GG en gevolgd door een reeks van PAM (NGG). Een gedeelte van het gen na de start (ATG) zal worden gericht.
      Opmerking: Als een opeenvolging van de doelgroep met GG eind 5' niet kan worden gevonden in de gewenste exon van het gen, een of beide van de G's kan worden vervangen voor de nucleotiden van het eerste en tweede op de 5' einde van de reeks. Echter, de twee G's moet worden opgenomen in de oligo, als deze vereist voor de Transcriptie T7 zijn.
    2. Ontwerpen en bestellen van een gen-specifieke oligonucleotide (oligo A: 5'-TAATACGACTCACTATAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3'). De gen-specifieke 20 bp gRNA doel volgorde (vet) toevoegen zonder de PAM-sequentie tussen een T7 promotor reeks (rood) en een reeks van de overlapping gebruikt om te ontharden aan een tweede oligonucleotide (blauw). Anneal en versterken (zie stap 3.2.1) deze oligo A en een tweede oligo (oligo B: 5'-GATCCGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTT-AACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3') voor het genereren van de gRNA-sjabloon gebruikt voor transcriptie.
      Opmerking: Oligo B is hetzelfde voor elke reactie en slechts 1 x moeten worden besteld.
  2. voorbereiding van de gRNA en transcriptie
    1. Anneal en versterken de oligos. Omvatten de volgende inleidingen om de gRNA te versterken teneinde de opbrengst: 5'-TAATACGACTCACTATA-3' (T7 primer) en 5'-GATCCGCACCGACTCGGTG-3' (3' gRNA primer). Het uitvoeren van een PCR polymerase van litoralis kodakaraensis (KOD) gebruiken.
      Opmerking: Voor beide inleidingen in oligo A en oligo B, 10 cycli wordt aanbevolen voor een goede opbrengst. Een gedetailleerd protocol kan worden gevonden in Wierson et al.41.
    2. Transcriberen van de gRNA met behulp van commercieel beschikbare in vitro transcriptie kits (Zie Tabel van materialen). Dit wordt gedaan door wijzigingen aan de fabrikant's-protocol gepubliceerd door Klaassen et al.42.
    3. Neerslaat, wassen en resuspendeer de gRNA zoals beschreven door Klaassen et al.42.
      Opmerking: De gRNA moet worden resuspended in RNase-gratis water ter voorkoming van de afbraak.
    4. De concentratie van de gRNA, die kan worden bepaald met behulp van een spectrofotometer geregistreerd. Beoordeling van de kwaliteit van het RNA door 2 µL uit te voeren op een agarose gel. Aliquot RNA voorkomen vorst/dooi en opslaan bij-80 °C tot vlak voor de injecties.
  3. Voorbereiding van de Cas9 en transcriptie
    1. Cas9 mRNA kan worden overgezet met behulp van commercieel beschikbare in vitro transcriptie kits (Zie Tabel van materialen) zoals eerder beschreven43. Gebruik de nls-Cas9-nls versie43.
    2. De concentratie van de gRNA wordt geregistreerd en beoordelen van de kwaliteit door het uitvoeren van 2 µL op een agarose gel. Aliquot RNA te vermijden ontleding die door meerdere ontstaat cycli bevriezen-ontdooien en sla de aliquots bij-80 °C.

4. bereiding van Tol2 constructies, Tol2 transposase en Transgenese

  1. Voorbereiden Tol2 transgenic constructies voor injectie.
    Opmerking: We hebben met succes gebruikt gepubliceerd/beschikbare zebravis en medaka construeert in A. mexicanus. Deze constructies zijn volledig functioneel in A. mexicanus, waarschijnlijk vanwege het hoge niveau van reeks homologie (verwijzen naar de repository AddGene en het informatienetwerk van de zebravis [ZFIN] databases voor beschikbaar constructies). De zebravis promotor fragmenten geuit de transgenen in de verwachte weefsels wanneer gebruikt in A. mexicanus.
    1. Verwerven van Tol2 constructies of Genereer plasmide met een weefsel-specifieke promotor, de gewenste transgenic en Tol2 wapens (Zie Kwan et al.44). Na ontvangst, volgorde van de constructie voor het valideren van de plasmide.
    2. Uitvoeren van een midiprep voor constructies volgens de fabrikant's richtsnoeren. Elueer de definitieve plasmide in RNase-vrije H2O, bepalen van de concentratie met een spectrofotometer, Verdun de concentratie aan 100-300 ng /μL, en aliquot en winkel de constructies bij-20 °C.
  2. Tol2 transposase plasmide verteren en synthetiseren van mRNA.
    1. Een kopie krijgen van het Tol2 transposase plasmide (PC-zT2TP) als een sjabloon voor het genereren van Tol2 mRNA45.
    2. Midiprep de pCS-zT2TP bouwen volgens de fabrikant's richtsnoeren. Elueer het in een lage hoeveelheid RNase-gratis water of buffer (~ 50 μl). Opslaan van de aliquots bij-20 °C.
    3. Verteren de plasmide van de Tol2 met behulp van een restrictie-enzym.
      1. Een samenvatting van de beperking op 10 µg circulaire pCS-zT2TP plasmide met behulp van tabel 1uitvoeren.
      2. Splitsen van de reactie in 2-50 μl reacties en de reacties op 37 °C in een thermische cycler's nachts uit te broeden.
      3. De volgende dag, inactivering van het enzym door verhitting het tot 65 °C gedurende 20 min.
      4. Zuiveren van gelineariseerde plasmide onmiddellijk na de digest, met behulp van commercieel beschikbare PCR reiniging kits (Zie Tabel van materialen) per de fabrikanten' -richtsnoeren. Elueer de plasmide in 15 μL van RNase-vrije H2O en bepaal de concentratie van het product met behulp van een spectrofotometer.
      5. Voer 1 μL van verteerd plasmide en 1 μL van Onbesneden plasmide op een 1,5% agarose gel te bevestigen gelineariseerde plasmide.
    4. Het uitvoeren van een in vitro transcriptie van mRNA van Tol2.
      1. 1 µg gelineariseerde pCS-zT2TP plasmide gebruiken als een sjabloon voor transcriptie. Volg de fabrikant's richtsnoeren voor in vitro transcriptie (Zie Tabel van materialen) zoals beschreven in tabel 2.
      2. Incubeer bij 37 °C in een thermische cycler per de fabrikant's richtsnoeren.
      3. Voeg 1 µL van DNase, het Incubeer bij 37 °C in een thermische cycler per de fabrikant's richtsnoeren.
      4. Lithium chloride neerslag per transcriptie kit protocol uit te voeren. Resuspendeer de pellet RNA in ~ 20-30 μL van RNase-vrije H2O.
      5. Bepaal de concentratie van het product met behulp van een spectrofotometer en de RNA-kwaliteit opnemen.
      6. Verdun het product te ~ 100-300 ng/µL aliquot in 5-10 μL monsters om te voorkomen dat herhaalde bevriezen-ontdooien. Bewaren ze op-80 °C tot gebruik.
        Opmerking: Het is mogelijk om te controleren van 1-2 µL van gezuiverde Tol2 mRNA van uitstrijkjes/band met gelelektroforese.

5. microinjections

  1. Voorbereiding van algemene hulpmiddelen voor injecties
    Opmerking: De procedures in deze sectie zijn in detail beschreven door Kowalko et al.,46, en een overzicht met kleine aanpassingen hier wordt gepresenteerd.
    1. Genereren injectie platen door gieten warme 3% agarose opgelost in vis systeem water in een 100 mL petrischaal. Zorgvuldig plaatst een ei injectie schimmel in de vers gegoten agarose te maken van putten voor de kuit. Plaats de zijde van de schimmel in agar in een hoek van 45° en dan langzaam lager het in de agarose; langzaam het verlagen van de mal op een hoek vermijdt lucht krijgen gevangen onder de schimmel. Voorzichtig de mal te verwijderen zodra de agarose is gestold. De platen kunnen worden opgeslagen, verzegeld, bij 4 °C voor maximaal 1 week.
    2. Trekken verder breinld zonder knop van borosilicaatglas haarvaten voor injectie in de trekker van een elektrode/naald volgens de fabrikant's richtsnoeren. Dit protocol zal variëren per pipet trekker; echter kan een steekproefprogramma naald-pulling worden gevonden in tabel 3.
      Opmerking: Optimaliseren van de naald is belangrijk voor injecties, zoals naalden die te lang zal buigen in plaats van netjes de eicel te doordringen.
    3. Groot-boring glas pipetten maken voor de overdracht van het ei door het breken van standaard glas pipetten, dus de opening groot genoeg voor de eieren is. Met behulp van een Bunsenbrander, Pools gebroken ultimo het glas door het einde van de gebroken pipetten aan de vlam bloot te leggen totdat het is glad.
  2. Fokken van setup
    Opmerking: Er zijn veel verschillende protocollen gebruikt voor het kweken van A. mexicanus. Zie voor een gedetailleerde protocol, Borowsky39. Start fokkerij setup 1 week vóór de injecties.
    1. Op dag 1, plaatst u twee tot drie vrouwen en drie tot vier mannen in een interne 10-gallon tank onderhouden bij 24 ± 1 °C.
    2. Op de dagen 1-7, verhogen het vervoederen aan ~ 3 x per dag. Controleer dat de voeding bevat levende voedsel, zoals zwarte wormen en Artemia.
    3. Op dag 6, het toevoegen van een enkele tankverwarming ingesteld op 27 °C.-Lab tank temperaturen kunnen variëren; Dit zal dus een stijging van 2-3 °C ten opzichte van de normale tank temperatuur.
    4. Op de avond van dag 7, oftewel de avond (zeitgeber [ZT] 9-11) van injectie nacht, grondig de tanks met een water gedrenkte spons schoon en verwijder eventuele overtollig voedsel of puin met een fijne maaswijdte net of een sifon.
    5. Start zoeken oppervlakte kuit op ZT15 op de nacht van dag 7, en blijven controleren elke 15-30 min tot ZT18. Voor cavefish, start zoeken eieren op ZT17 en blijven controleren elke 15-30 min tot ZT20.
      Opmerking: De tijden zijn gebaseerd op een 14:10 h licht: donker cyclus met gebruikmaking van zeitgeber tijd. Fok tijden zijn schattingen en individuele labs exacte tijden moeten bepalen. Het is van cruciaal belang voor het verzamelen van eieren, zodra ze vrijgegeven/bevrucht zijn teneinde injecteert ze eencellige stadium.
  3. Collectie van eencellige fase eieren
    1. De nacht waarin fokken verwachting, onderzoeken de tanks elke 15-30 min en monitor voor eieren aan de onderkant van de tank. Eieren verschijnen doorschijnend, meten van ongeveer 1 mm in diameter.
    2. Gebruik een fijne mesh vis net voor het verzamelen van eieren en hen overbrengen in een glazen kom gevuld met verse vis systeem water. Onderzoeken de eieren onder een microscoop om te bevestigen dat de eieren in de een-cel-stadium.
    3. Met behulp van glas pipetten, eencellige eieren naar de injectie platen overbrengen. Glas pipetten dienen in dit stadium als de eieren aan kunststof vasthouden zal.
    4. Met behulp van een precisiepipet, zorgvuldig laat de eieren in de putjes van de plaat agarose injectie van punt 5.1. Vul de rijen van de plaat voorverwarmde (op kamertemperatuur) injectie met het maximum aantal eieren (30-40 per rij, en maximaal vijf rijen). Volledige rijen helpen voorkomen dat de eieren bewegen tijdens de injecties. De eieren tot de prestaties van de injecties op de plaat van de injectie met een kleine hoeveelheid vis systeem water gehydrateerd te houden.
  4. Pico-injectie setup en Algemeen inspuitpomp optimalisatie richtsnoeren
    1. Aanvulling van de funderingsput de naalden van de injectie met behulp van een precisiepipet gel-laden tips die passen binnen de capillaire of met behulp van standaard micropipet tips en een 2-4 µL bolus toe te voegen aan het einde. Zodra de naald wordt gevuld, gebruik pincet om trim de lengte van de overtollige vanaf de injectie naald.
    2. Uitvoeren van microinjections met behulp van een naald in een micromanipulator, aangesloten op een picoliter microinjector gemonteerd.
    3. De injectie tijd ingesteld op 0.03 s en de druk uit op ~0.0 psi. De druk van de injectie zal variëren dienovereenkomstig met kleine verschillen tussen naalden, zo optimaliseren om een ~1.0 nL injectie bolus.
      Opmerking: De druk van de injectie is vaak in het bereik van ~ 10-30 psi.
    4. Standaardiseren van de bolus injectie door injecteren in minerale olie en het meten van de bolus maat met een dia micrometer tot een ~ 1-1.5 nL geïnjecteerde volume. Aanpassen van de druk van de injectie (psi) u verhoogt of verlaagt het volume van de bolus.
    5. Tekenen van water op de top van de eieren met behulp van een lab weefsel.
      Opmerking: De Astyanax ei chorion is iets moeilijker om te penetreren dan zebrafish eieren. Wij vinden dat het water off van de bovenkant van de eieren tekening helpt penetratie van de naald in de eicel vergemakkelijken. Optimalisatie van de plaat kan zorgen voor ~ 200 eieren op een enkele plaat.
    6. Gebruik de micromanipulator om elk ei met de naald doordringen, en injecteert direct in de dooier. Zodra gepositioneerd in de dooier, injecteren de eicel door te drukken op de invoeren-knop of injectie voetpedaal.
      Opmerking: Een volledige plaat kan worden geïnjecteerd binnen ~ 15 min. De eencellige fase duurt ~ 40 min.
  5. Injectie van morpholinos
    Opmerking: De hoeveelheid morfolino die nodig zijn voor knockdown zonder toxiciteit moet worden geoptimaliseerd per gene doel; een concentratie van 400 pg is echter een goede plek om te beginnen.
    1. Morfolino voor te bereiden zodat 400 pg van morfolino zullen worden ingespoten per ei. Morfolino op ijs ontdooien. De injectie-oplossing bestaat uit morfolino (op de gewenste concentratie), RNase-vrije H2O of Danieau's oplossing, en fenol rood (10% van het uiteindelijke volume). Voor een voorbeeld, Zie tabel 4.
    2. Injecteren van 1 nL per embryo.
  6. CRISPR injecties
    1. Bereiden RNA zodat 25 pg van gRNA en 300 pg van Cas9 mRNA totale zullen per embryo worden ingespoten. Zie voor een voorbeeld CRISPR/Cas9 injectie mengsel, tabel 5.
    2. Injecteren van 2 nL van gRNA/Cas9 mRNA per embryo rechtstreeks in het embryo.
  7. Injectie van Tol2 transposase en Tol2-geflankeerd plasmide voor Transgenese
    1. Ontdooien transposase mRNA en Tol2 plasmide op ijs. Combineer Cas9 mRNA (bij 25 ng/µL), gewenste Tol2 construct (bij 25 ng /μL), en fenol rood (≤10% van het uiteindelijke volume) in RNase-gratis water. Voor een monster Tol2 Transgenese injectie mengsel, Zie tabel 6.
    2. Houd de injectie oplossing en naalden op ijs om te voorkomen dat de afbraak van mRNA. Injecteren op 1 nL in volume per embryo.

6. fok- en screening geïnjecteerd vis

  1. Ingespoten vis veehouderij
    1. Nadat de eieren zijn geïnjecteerd, onmiddellijk overbrengen naar glazen kommen (10 x 5 cm), gevuld met ~ 200 mL vis systeem water. Eieren zijn gemakkelijk gespoeld door dompelen de injectie platen in kommen gevuld met vis, water en spoelen de eitjes met een pipet.
    2. Plaats van ~ 50-80 ingespoten embryo's per kom en ze aan de achterkant bij 22-24 °C.
    3. Reinigen van de kommen met ingespoten vissen 2 x per dag te verwijderen dode embryo's en veranderen van ~ 20% van het water op een dagelijkse basis.
    4. Extra fokken is verricht overeenkomstig de eerder gepubliceerde protocollen39.
  2. Screening van morfolino-geïnjecteerd individuen
    1. Visualiseer de dieren onder een stereomicroscoop aan het scherm voor fenotypen. Het effect van morpholinos kan aanhouden tot ~ 5 dagen postinjection21.
    2. Maatregel gedrags fenotypen op 4 dagen postinjection.
  3. Screening voor CRISPR microdeleties
    1. Het ontwerpen van inleidingen om genomic DNA rond de doelsite te vergroten. Inleidingen zo ontwerpen dat het PCR-product van target ongeveer 100-is 125 bp.
      Opmerking: bijvoorbeeld, voor de oca2 locus, de regio rondom de doelsite gRNA werd versterkt met behulp van de voorwaartse primer 5'-CTCCTCTGTCAGGCTGTGC-3' en de omgekeerde primer 5'-GAAGGGGATGTTGTCTATGAGC-3' voor een PCR product lengte van 105 bp.
    2. Offeren van embryo's of fin clip volwassen vis volgens het institutionele protocol van het dier.
    3. Verzamelen van de embryo's of ontleed vinnen in PCR buizen en DNA uitpakken en uitvoeren van PCRs. monster PCR protocollen voor gen-specifieke primers kunnen worden gevonden in Ma et al.35.
    4. Om te beoordelen voor de mutagenese, voeren 5 zal µL van het PCR-product op een 3% agarose gel bij 70 V voor 3 h. Wild-type (nonmutagenized) DNA resulteren in een PCR product als een duidelijke band. Mutant DNA zal resulteren in een smeary band op de gel.
    5. Om te bepalen van de volgorde van de mutant allelen, TA kloon het PCR-product volgens de fabrikant's instructies, kiest u kolonies en miniprep culturen. De resulterende DNA voor het rangschikken verzendt.
    6. Treffen en handhaven van de lijnen van vis toezending van mutant allelen, door volwassen ingespoten vis te steken naar de wild-type vis en scherm 5-10 embryo's om te bepalen als een van de nakomelingen een mutant allel van de volgende stappen 6.3.1-6.3.6 gen dragen.
      Opmerking: Verschillende F1 personen uit de dezelfde F0 oprichter vis kunnen het dragen van verschillende mutaties. Zorgen mutant lijnen zijn sequenced om te verkrijgen van mutaties voorspeld voor de productie van allelen die buiten het frame.
    7. Vis met een mutant allel door PCR met behulp van de smeary band assay (stappen 6.3.1-6.3.6) of door het ontwerpen van allele-specifieke PCR inleidingen die mutant en wild-type bands (figuur 2C versterken zal) te identificeren.
    8. Zodra een lijn van vis wordt gevestigd, de mutant allelen homozygose om te testen voor recessief fenotypen.
  4. Screening voor transgene positieve personen
    Opmerking: Met behulp van constructies met een fluorescerende maker wordt aanbevolen om het stroomlijnen van de screening voor transgene positieve personen. Standaardpcr screeningmethoden kan echter worden gebruikt aan het scherm voor transmissie.
    1. Visualiseer weefsel-specifieke fluorescente proteïnen in F0 vis zo spoedig 2 dagen postinjection, met een epifluorescence ontleden toepassingsgebied.
      Opmerking: De expressie in F0 larven is mozaïek en positieve individuen kunnen een scala van expressie fenotypen hebben.
    2. Oprichter vis positieve individuen als F0 houden.
    3. Wanneer F0s geslachtsrijp, backcross stichtende vis aan nontransgenic personen afkomstig uit de dezelfde populatie/lab voorraad. Scherm F1 nakomelingen met hetzelfde protocol, zoals beschreven in stap 6.2.
      Opmerking: De expressie in F1 larven is uniform en zorgt voor consistentie tussen F1 broers en zussen.
    4. Aangezien Tol2 integratie geen site-gemedieerde is en integratie kan variëren tussen oprichters, selecteer F1 broers en zussen afgeleid van een enkele F0 oprichter en uiten van positieve F1 broers en zussen voor het genereren van F2s interbreed. Deze nakomelingen zullen de basis voor een stabiele lijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Meerdere populaties van grot-woning A. mexicanus Toon verminderde slaap en verhoogde wakkerheid/activiteit ten opzichte van hun oppervlakte-woning soortgenoten14. Hypocretin/orexine (HCRT) is een zeer geconserveerde neuropeptide, die fungeert toe wakker, en afwijkingen in de HCRT-pathway narcolepsie veroorzaken bij mensen en andere zoogdieren47,48. Wij hebben eerder aangetoond dat grot A. mexicanus gestegen expressie van ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier, verstrekt wij een methodologie voor het manipuleren van de genfunctie met morpholinos, CRISPR/Cas9 gene bewerken en Transgenese methodologie. De rijkdom van de genetische technologie en het optimaliseren van deze systemen in zebrafish zal waarschijnlijk zorgen voor de overdracht van deze tools in A. mexicanus met gemak52. Recente bevindingen hebben gebruikt deze benaderingen in A. mexicanus, maar ze blijven onderbenutte in het onderzoek van verschillende morfologische, ontw...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken Sunishka Thakur voor haar hulp bij genotypering en beeldvorming van de oca2 mutant vis afgebeeld in Figuur 2. Dit werk werd gesteund door de National Science Foundation (NSF) award 1656574 naar A.C.K., NSF award, 1754321, J.K. en A.C.K. en National Institutes of Health (NIH) award R21NS105071 A.C.K. en E.R.D.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Viskoppeling & eiervoorraden
Fijnmazige visnetPenn PlaxBN4
Verwarming aquariumAqueon100106108
EiervallenOp maat gemaaktNAOntwerp en maak een plastic rooster om op de bodem van het aquarium te plaatsen om de eieren te beschermen
Glazen pipettenFisher Scientific13-678-20C
PipetbulbenFisher Scientific03-448-21
AgaroseFisher ScientificBP160-500
EiervormpjesAdaptive Science ToolsTU-1
Morpholino benodigdheden
Controle MorpholinoGene Tools, LLCStandaard controle olio
Op maat gemaakte MorpholinoGene Tools, LLCNA
Phenol RoodSigma AldrichP0290-100ML
CRISPR benodigdheden
Cas9 PlasmidAddGene46757
GoTaq DNA PolymerasePromegaM3001
KOD Hot Start TaqEMD Millipore71-842-3
PrimersIntegrated DNA TechnologiesAangepast
T7 Megascript KitAmbion/ThermofisherAM1333
miRNeasy KitQiagen217004
mMessage mMachine T3 kitAmbion/ThermofisherAM1348
MinElute KitQiagen28204
Tol2 transgenese benodigdheden
pCS-zT2TP plasmidKawakami et al., 2004Vraag het aan de senior auteur
CutSmart BufferNew England BiolabsB7204
NotI-HF restrictie-enzymNew England BiolabsR3189
PCR zuiveringskitQiagen28104
SP6 mMessenger KitAmbion/ThermofisherAM1340
Micro-injectie benodigdheden
Glazen capillaire buizenSutter InstrumentsBF100-58-10
Pipet pullerSutter InstrumentsP-97
PicoinjectorWarner InstrumentsPLI-100A
MicromanipulatorWorld Precision InstrumentsM3301R
Micromanipulator standWorld Precision InstrumentsM10
Micromanipulator basisWorld Precision InstrumentsStalen plaatbasis, 10 lbs

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Darwin, C. On the Origin of Species by Means of Natural Selection. , D. Appleton and Company. (1859).
  2. Culver, D. C., Pipan, T. The Biology of Caves and Other Subterranean Habitats. , Oxford University Press. New York, NY. (2009).
  3. Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R. Mexican Eyeless Characin Fishes, Genus Astyanax: Environment, Distribution, and Evolution. , (1977).
  4. Huppop, K. Oxygen consumption of Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces): A comparison of epigean and hypogean populations. Environmental Biology of Fishes. 17, 299-308 (1986).
  5. Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican Cavefish Save Energy by Eliminating the Circadian Rhythm in Metabolism. PLoS ONE. 9 (9), e107877(2014).
  6. Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature genetics. 38, 107-111 (2006).
  7. Wall, A., Volkoff, H. Effects of fasting and feeding on the brain mRNA expressions of orexin tyrosine hydroxylase (TH), PYY and CCK in the Mexican blind cavefish (Astyanax fasciatus mexicanus). General and Comparative Endocrinology. 183, 44-52 (2013).
  8. Aspiras, A., Rohner, N., Marineau, B., Borowsky, R., Tabin, J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9668-9673 (2015).
  9. Yoshizawa, M., Gorički, Š, Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Current Biology. 20 (18), 1631-1636 (2010).
  10. Jeffery, W. R. Regressive Evolution in Astyanax Cavefish. Annual Review of Genetics. 43, 25-47 (2009).
  11. Gross, J. B. The complex origin of Astyanax cavefish. BMC Evolutionary Biology. 12, 105(2012).
  12. Elipot, Y., Hinaux, H., Callebert, J., Rétaux, S. Evolutionary shift from fighting to foraging in blind cavefish through changes in the serotonin network. Current Biology. 23 (1), 1-10 (2013).
  13. Kowalko, J. E. J., et al. Loss of schooling behavior in cavefish through sight-dependent and sight-independent mechanisms. Current Biology. 23 (19), 1874-1883 (2013).
  14. Duboué, E. R. E. R., Keene, A. C. A. C., Borowsky, R. L. R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21 (8), 671-676 (2011).
  15. Chin, J. S., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Developmental Biology. , (2018).
  16. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
  17. Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (21), 11403-11408 (2000).
  18. Balciunas, D., et al. Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. BMC Genomics. , (2004).
  19. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
  20. Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. I. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4, (2014).
  21. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A Primer for Morpholino Use in Zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
  22. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene “knockdown” in zebrafish. Nature Genetics. , (2000).
  23. Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nature Biotechnology. , (2011).
  24. Huang, P., et al. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nature Biotechnology. , (2011).
  25. Kawakami, K. Transposon tools and methods in zebrafish. Developmental Dynamics. 234 (2), 244-254 (2005).
  26. Urasaki, A., Morvan, G., Kawakami, K. Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition. Genetics. 174 (2), 639-649 (2006).
  27. Juntti, S. A., Hu, C. K., Fernald, R. D. Tol2-Mediated Generation of a Transgenic Haplochromine Cichlid, Astatotilapia burtoni. PLoS ONE. 8 (10), (2013).
  28. Harel, I., Valenzano, D. R., Brunet, A. Efficient genome engineering approaches for the short-lived African turquoise killifish. Nature Protocols. 11 (10), 2010-2028 (2016).
  29. Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks. Journal of Visualized Experiments. (111), e54055(2016).
  30. Elipot, Y., Legendre, L., Père, S., Sohm, F., Rétaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).
  31. Keene, A., Yoshizawa, M., McGaugh, S. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , Academic Press. New York, NY. (2015).
  32. Casane, D., Rétaux, S. Evolutionary Genetics of the Cavefish Astyanax mexicanus. Advances in Genetics. 95, 117-159 (2016).
  33. Mcgaugh, S., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nature Communications. 5, 5307(2014).
  34. Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13 (1), (2015).
  35. Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican cavefish, Astyanax mexicanus. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
  36. Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. PLoS ONE. 8 (11), e80823(2013).
  37. Alie, A., et al. Developmental evolution of the forebrain in cavefish: from natural variations in neuropeptides to behavior. eLife. 7, e32808(2018).
  38. Jaggard, J. B., et al. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. eLife. 7, e32637(2018).
  39. Borowsky, R. Handling Astyanax mexicanus eggs and fry. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (11), (2008).
  40. Varshney, G. K., Sood, R., Burgess, S. M. Understanding and Editing the Zebrafish Genome. Advances in Genetics. 92, 1-52 (2015).
  41. Wierson, W. A., et al. GeneWeld: a method for efficient targeted integration directed by short homology. BioRxiv. , (2018).
  42. Klaassen, H., Wang, Y., Adamski, K., Rohner, N., Kowalko, J. E. CRISPR mutagenesis confirms the role of oca2 in melanin pigmentation in Astyanax mexicanus. Developmental Biology. , (2018).
  43. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  44. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  45. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  46. Kowalko, J., Ma, L., Jeffery, W. Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs). Journal of Visualized Experiments. (112), e54113(2016).
  47. Nishino, S., Ripley, B., Overeem, S., Lammers, G. J., Mignot, E. Hypocretin (orexin) deficiency in human narcolepsy. Lancet. , (2000).
  48. Lin, L., et al. The sleep disorder canine narcolepsy is caused by a mutation in the hypocretin (orexin) receptor 2. Cell. , (1999).
  49. Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic Zebrafish with fluorescent neurons. Developmental Biology. 227 (2), 279-293 (2000).
  50. Higashijima, S., Masino, M. A., Mandel, G., Fetcho, J. R. Imaging Neuronal Activity During Zebrafish Behavior With a Genetically Encoded Calcium Indicator. Journal of Neurophysiology. , (2003).
  51. Vladimirov, N., et al. Light-sheet functional imaging in fictively behaving zebrafish. Nature Methods. 11 (9), 883-884 (2014).
  52. Halpern, M. E., et al. Gal4/UAS transgenic tools and their application to zebrafish. Zebrafish. 5 (2), 97-110 (2008).
  53. Jaggard, J. B., Stahl, B. A., Lloyd, E., Prober, D. A., Duboue, E. R., Keene, A. C. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. bioRxiv. 7, e32637(2018).
  54. Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. Lessons from morpholino-based screening in zebrafish. Briefings in Functional Genomics. , (2011).
  55. Robu, M. E., et al. p53 activation by knockdown technologies. PLoS Genetics. , (2007).
  56. Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Scientific reports. 5, 8841(2015).
  57. Prykhozhij, S., et al. Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9. Nucleic Acids Res. 46 (17), (2018).
  58. Tessadori, F., et al. Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders. Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).
  59. Armstrong, G., Liao, M., You, Z., Lissouba, A., Chen, B., Drapeau, P. Homology Directed Knockin of Point Mutations in the Zebrafish tardbp and fus Genes in ALS Using the CRISPR/Cas9 System. PLoS ONE. 11 (3), (2016).
  60. Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. Circuit Neuroscience in Zebrafish. Current Biology. 20 (8), (2010).
  61. Friedrich, R. W., Genoud, C., Wanner, A. A. Analyzing the structure and function of neuronal circuits in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
  62. Scott, E. K., et al. Targeting neural circuitry in zebrafish using GAL4 enhancer trapping. Nature Methods. 4 (4), 323-326 (2007).
  63. Asakawa, K., Kawakami, K. Targeted gene expression by the Gal4-UAS system in zebrafish. Development Growth and Differentiation. , (2008).
  64. Lloyd, E., et al. Evolutionary shift towards lateral line dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. Developmental Biology. , (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

GenmanipulatieMorpholino injectieCRISPR genbewerkingTol2 transgenesemicro injectieprocedureembryo verzamelingfenotype screeningDNA extractiecalcium imaging

Gerelateerde artikelen