Methodenartikel

Toepassing van Biochip Microfluidic technologie te detecteren Serum allergeen-specifieke Immunoglobulin E (sIgE)

DOI:

10.3791/59100

⸱

21 april 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Guangzhou Institute of Respiratory Health, State Key Laboratory of Respiratory Disease, First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou Medical University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit document stelt een protocol voor het opsporen van serum specifieke immunoglobuline met een cartridge gebaseerde Chemoluminescentie-systeem van microfluidic en de evaluatie van het nut ervan in allergie diagnoses.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Allergische ziekte komt voor bij zowel volwassenen als kinderen. Identificatie van de oorzakelijke allergenen is belangrijk in het beheer van de ziekte en preventie. Een specifieke immunoglobulin E (IgE) meetsysteem met een hoge prijs / prestatie verhouding ontbreekt echter in vasteland China, vooral in de eerstelijnszorg ziekenhuizen. Deze paper beschrijft de procedures van het beginsel en de werking van het gebruik van een cartridge gebaseerde Chemoluminescentie-systeem van microfluidic te detecteren allergeen-specifieke IgE in het serum. De resultaten werden vergeleken met die van ImmunoCAP (systeem 1), de industriële standaard, en de reproduceerbaarheid van het systeem voor het detecteren van patiënten voor deze gemeenschappelijke allergenen gesensibiliseerde personen wordt geëvalueerd. De resultaten toonden aan dat in vergelijking met ImmunoCAP (systeem 1), het BioIC systeem (systeem 2) heeft goede precisie en gevoeligheid voor het opsporen van serum specifieke IgE tegen verschillende inhalant en voedsel allergenen, maar met een aanzienlijk lagere kosten. Het kan dienen als een goed alternatief voor System 1 in eerstelijnszorg ziekenhuizen in vasteland China hebben lagere financiële betaalbaarheid.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De prevalentie van allergieën in de afgelopen decennia gestaag is toegenomen en 20% - 30% van de wereldbevolking1treft. Identificatie van de oorzakelijke allergenen heeft grote betekenis bij het beheer van de ziekten. In China, aangezien geregistreerde in vivo huid lul proeven niet beschikbaar in het land zijn, in vitro bepaling van serum specifieke IgE de belangrijkste is en meest gebruikte hulpmiddel voor type ik allergie diagnoses2. Dit is vergelijkbaar met praktijken in de westerse wereld, maar hoewel ImmunoCAP systeem (systeem 1), een enzyme-linked immunosorbent basissysteem van fluorescentie, wordt beschouwd als de gouden standaard voor in vitro allergie diagnose3, het gebruik ervan in China is zeer beperkt wegens om de hoge prijs van apparatuur en reagens. Vandaar is een nieuwe alternatieve anti diagnose systeem met een hoge prijs / prestatie verhouding hard nodig.

Het BioIC systeem (systeem 2) is een microfluidic cartridge gebaseerde systeem gebaseerd op het beginsel van de Chemoluminescentie voor multiplexed testen van serum specifieke IgE. Met een grootte van 7 cm x 4 cm, de microfluidic-cartridge bestaat uit drie lagen van injectie-gegoten kunststof. Het bovenste deel is 3 mm dik transparant Polycarbonaat die draagt goede stabiliteit tijdens thermische assemblage processen. Samen met de 3 mm dikke onderlaag opgebouwd uit een copolymeer van acrylonitril, butadieen en styreen (ABS), sandwiches het de 0,5 mm dikke middelste laag gemaakt van siliconen rubber. Zwart van kleur biedt, de middelste laag lagere achtergrond tijdens Chemoluminescentie-detectie. Op de top van de silica gel, is een dun laagje nitrocellulose membraan (NC membraan) gespoten op de positie die overeenkomt met de zone van de reactie, waarmee het spotten van verschillende allergene eiwitten. Het doel van deze studie is om de klinische prestaties van het systeem van de microfluidic voor de multiplexed bepaling van allergeen-specifieke IgE in het serum te evalueren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie en het gebruik van menselijk serummonsters werden goedgekeurd door de ethische commissie van de eerste aangesloten ziekenhuis van Guangzhou medische universiteit (GYYY-2016-73). Alle deelnemers hebben hun schriftelijke toestemming gegeven, onafhankelijk of via hun ouders (in het geval van kinderen).

1. basisgegevens van de studiegroep

Opmerking: Het allergie informatie-archief van de Braziliaanse sleutel laboratorium van respiratoire aandoeningen (lucht-SKLRD) is een grote serumbank opgericht binnen het Guangzhou Instituut van respiratoire ziekenhuis (GIRH). In de afgelopen tien jaar werd begonnen, de lucht-SKLRD reeds is begonnen te verzamelen en opslaan van serummonsters van patiënten met allergische aandoeningen, samen met hun klinische informatie (tabel 1)4,5. De huidige studie werd uitgevoerd met de sera van de lucht-SKLRD.

  1. De lucht-SKLRD database voor sera verzameld van januari 2015 tot juni 2018 zoeken en selecteren van de patiënten met allergisch ziekte, die bleken te zijn gevoelig voor de gemeenschappelijke allergenen in de regio.
  2. Ervoor zorgen dat alle geselecteerde patiënten allergisch-gerelateerde ziekten, zoals allergische rhinitis en astma, allergische dermatitis, en/of urticaria, en dat het serum van deze patiënten bevat meerdere serum allergeen-specifieke immunoglobuline (sIgE) sensitizations van gemeenschappelijke allergenen in deze regio, gedetecteerd door het systeem-1.
  3. Uitsluiten van patiënten met onvolledige medische dossiers, die verloor van follow-up, degenen die weigeren te geven geïnformeerde toestemming ten aanzien van het gebruik van hun serummonsters voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt, die met een geïdentificeerde immunodeficiëntie, die momenteel op immunotherapie of immunomodulerende agenten, of die gevonden te hebben van parasitaire infecties.
  4. Ervoor zorgen dat geen behandeling of medicijn voorschrift kreeg voorafgaand aan de serum-collectie om te minimaliseren van de storing van de bevindingen van het laboratorium. Alle serummonsters die de criteria niet vervullen verworpen.

2. studie van de stroming en metingen van belang

Opmerking: Het microfluidic-systeem moet 100 µL van de serum voor het bepalen van de 19 allergenen. Veneuze bloed (5 mL) werd bijeengezocht uit elke patiënt met behulp van een vacuüm bloedvat bevattende scheiden gel. Na centrifugeren voor 10 min op 1000 x gwordt werd de bovenste laag verzameld voor het testen. Ongebruikte serum werd opgeslagen bij-80 ° C. Vóór het testen, het serum werd gehouden bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten en was geschokt met een vortex-mixer. Herhaalde cycli van bevriezen en ontdooien werden vermeden.

  1. Vooral het serum testopnames voor sIgEs op hele allergenen van de huismijt pteronyssinus (d1), huismijt farinae (d2), Blomia tropicalis (d201), kat dander (e1), hond huidschilfers (e5), Bermuda gras (g2), timothy grass) G6), kakkerlakken (i6), Aspergillus fumigatus (m3), Candida albicans (m5), ragweed (w1), eiwit (f1), melk (f2), tarwe (f4), pinda (f13), sojabonen (f14), amandel (f20), krab (f23) en garnalen (f24). Volg de instructies die zijn gegeven in punt 3.
    Opmerking: sIgE bepaling werd gedaan met het allergeen-specifieke IgE assay kit (Zie de Tabel van materialen) en gemeten door een chemiluminescentie-analysator.
  2. Willekeurig selecteren drie monsters uit de monsters met genoeg serum (ten minste 900 µL) voor een studie van de reproduceerbaarheid. Houden van alle voorwaarden ongewijzigd, meten de drie sera voor allergeen sIgEs dagelijks voor 9 opeenvolgende dagen (dat wil zeggen, een totaal van 100 x 9 = 900 µL van de serum).

3. semi-automatisering testprocedure van het microfluidic-systeem

Opmerking: De systeem-2 is de integratie van automatische microfluidic technologie, eiwit microarray analyse van koude licht, parallelle IgE analyse en beeld processing technologie. Het test protocol is verdeeld in vier delen: voorbereiding van de apparatuur, monster laden incubatie en meting.

  1. Voorbereiding van de apparatuur
    1. Zet de PC en de macht van de analyzer.
      Opmerking: De aan-uitknop is op de links van de nullijn.
    2. Start het LabIT programma op de PC. Als de Donkere Frame waarschuwingsvenster opduikt, klik op OK als u wilt uitvoeren van de Test van de lek. Daarna, klik op het logo van de center voor het invoeren van de interface van de operatie.
      Opmerking: Het systeem herinnert de gebruiker lekkage Test uitvoeren als deze niet gebruikt gedurende meer dan 24 uur wordt.
    3. Controleer de Temp van de reactie en de CCD (charge - coupled apparaat) Temp in de rechteronderhoek van het scherm. De Temp van de reactie moet stijgen tot 37 ° C ± 1 ° C in ongeveer 10 minuten, en de CCD-Temp moeten dalen tot-15 ° C ± 1 ° C.
    4. Voer de Test van de lek na de CCD-Temp is gedaald tot-15 ° C ± 1 ° C. Voordat u de test van de lek, Controleer of er zijn geen andere objecten achtergelaten in het instrument en de deur dicht. Klik op extra | Systeem Test | Test van de lek. Niet open de deur tijdens het testen. Wanneer de test is voltooid, wordt het venster zal verschijnen.
  2. Monster laden
    1. Voeg 620 µL van was buffer, 120 µL van buffer met blokkerend, 60 µL van geconjugeerde A en B, 60 µL van substraat A en B, en 100 µL van de serummonsters aan de bijbehorende reagens tank op de microfluidic-cartridge.
  3. Incubatie
    1. Klik op Cartridge-ID, de barcodescanner kunt scannen van het serienummer van de cartridge, steken naar de voorbeeld Legitimatiebewijs, zet de cartridge in de analyzer en sluit de deur en op Analyzer en Voer om te beginnen met de analyse.
  4. Meting
    1. Exporteer de resultaten naar statistische software (bijvoorbeeld Excel) na de meting.
      Opmerking: Na 30 min van incubatie, de analyzer automatisch voert de meting en rapporteert het resultaat.
  5. Schakelen tussen off van de analyzer
    1. Voor routineonderhoud, na het beëindigen van de test, verwijder de cassette en veeg de analyzer van interne verwarming ijzer en elektromagneet lichtjes met 75% alcohol.
      Opmerking: Niet hard drukken of schudden van de elektromagneet.
    2. Sluit het venster LabIT. De temperatuur controle venster zal verschijnen. Het zal automatisch sluiten wanneer de CCD tot de 5 ° C protectie modus opwarmt. Tegen die tijd zal het uitschakelen van de kracht van de analysator en PC.
      Opmerking: Sluit niet handmatig de temperatuur waterkanon van venster voordat de CCD-Temp is gestegen tot 5 ° C en zet niet uit de macht van de analyzer, noch de PC tijdens de CCD-warming-up.

4. definitie van sIgE reactiviteit

Opmerking: Voor een onverdund serum specimen, het detectiebereik van de systeem-2 is 0.21-100 IU/mL.

  1. Gebaseerd op de drempelwaarde voor 0.35 IU/mL, rekening houden met een sIgE meer dan 0,35 IU/mL te positieve6,7. Stem op de reactiviteit van de sIgE tests als8: klasse 1 (≥0.35 en < 0.70 IU/mL), klasse 2 (≥0.70 en < 3,50 IU/mL), klasse 3 (≥3.50 en < 17,50 IU/mL), klasse 4 (≥17.50 en < 50.00 IU/mL), klasse 5 (≥50.00 en < 100.00 IU/mL) , en klasse 6 (≥100.00 IU/mL).

5. statistische analyse

  1. Gebruik een histogram te tonen de positieve tarief van de 19 allergenen (Figuur 1) en de curve Levey-Jennings gebruiken om aan te tonen van de herhaalbaarheid van de detectie systeem (Figuur 2)9.
  2. De drie meest voorkomende inhalant allergenen en voedselallergenen (in totaal zes allergenen) selecteren en vergelijken de resultaten naar de I System 1 te evalueren van de klinische diagnostische prestaties10,11. Omvatten de stemmen concordance, gevoeligheid, specificiteit, positieve en negatieve voorspellende waarden en het gebied onder de ontvanger karakteristiek (ROC) curve (AUC) fungeert als de beoordelingscriteria.
  3. Toepassing van Spearman correlatie analyse12 om correlaties tussen de twee systemen beschrijven en gebruiken van kappa waarde van consistentie. Categoriseren van de kappa waarde als bijna perfect (0.8-1.0), ingrijpende (0,6-0,8), matig (0,4-0,6), fair (0,2-0,4) of armen (< 0.2)13. Gebruik PASW 23,0 en MedCalc 11.0 statistische analyse en definiëren van P < 0.05 als statistische significantie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Positieve tarieven voor 19 gemeenschappelijke allergenen
De resultaten op 293 sera zijn afgebeeld in Figuur 3. Onder alle inhalant allergenen, D. farinae had de hoogste positieve percentage (80.89%, 273/293), gevolgd door D. pteronyssinus (78.84%, 231/293). Onder de voedselallergenen, krab heeft het hoogste percentage van de positieve (20.48%, 60/293), gevolgd door 13.65% (40/293) voor garnalen. De totale positie...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vergelijkbaar met de resultaten van veel andere studies15,16,17, de resultaten van het systeem van de microfluidic gebaseerd op sera van 293 allergische patiënten bleek dat huis huisstofmijt (met inbegrip van D. pteronyssinus, D. farinae, en B. tropicalis) zijn de belangrijkste inhalant allergenen leiden tot allergische aandoeningen in Zuid-China, terwijl voor voedsel, melk, pinda, garnalen en krab zi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken Professor Mei Jiang voor haar hulp bij de statistische analyse en Mr. Hammer Tsui bij de voorbereiding van het manuscript. Deze studie werd ondersteund door de Guangzhou Science en technologie Foundation (201804020043) en de nationale Natural Science Foundation van China (NSFC 81572063 en NSFC 81802076). De financiering van de fracties overeengekomen met de studie ontwerp, gegevensanalyse, manuscript voorbereiding en besluit te publiceren. Geen andere financiering werd ontvangen voor deze studie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Agnitio BioIC AnalyzerAgnitio Science & Technology(Taiwan, China)BA-G2000
BioIC Allergen specific-IgE Detection KitAgnitio Science & Technology(Taiwan, China)DR17A12
BioIC Cartridge PlaatsingsplaatAgnitio Science & Technology(Taiwan, China)T20SET
BioIC Reagent DispenserAgnitio Science & Technology(Taiwan, China)DS-1
Afbeelding twee-dimensionale streepjescodemachineAgnitio Science & Technology(Taiwan, China)NLS-HR200
Softwarepakket, LabITAgnitio Science & Technology(Taiwan, China)Versie 2.4.12
VORTEX-5 Vortex MixerHaimen Kylinbell Lab Lastruments Co., Ltd.VORTEX-5

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kamble, S., Bharmal, M. Incremental Direct Expenditure of Treating Asthma in the United States. Journal of Asthma Research. 46 (1), 73-80 (2009).
  2. Paganelli, R., et al. Specific IgE antibodies in the diagnosis of atopic disease. Clinical evaluation of a new in vitro test system, UniCAP, in six European allergy clinics. Allergy. 53 (8), 763-768 (1998).
  3. Wang, J., Godbold, J. H., Sampson, H. A. Correlation of serum allergy (ige) tests performed by different assay systems. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121 (5), 1219-1224 (2008).
  4. Sun, B., Zheng, P., Wei, N., Huang, H., Zeng, G. Co-sensitization to silkworm moth (Bombyx mori) and 9 inhalant allergens among allergic patients in Guangzhou, Southern China. PLoS ONE. 9 (5), e94776(2014).
  5. Zeng, G., et al. Component-Resolved Diagnostic Study of Dermatophagoides Pteronyssinus Major Allergen Molecules in a Southern Chinese Cohort. Journal of Investigational Allergology & Clinical Immunology. 25 (5), 343-351 (2015).
  6. Luo, W., et al. grass pollen allergens and components detected in a southern Chinese cohort of patients with allergic rhinitis and/or asthma. Molecular Immunology. 78 (2016), 105-112 (2016).
  7. Zeng, G., et al. Longitudinal profiles of serum specific IgE and IgG4 to Dermatophagoides pteronyssinus allergen and its major components during allergen immunotherapy in a cohort of southern Chinese children. Molecular Immunology. 74 (2016), 1-9 (2016).
  8. Lee, J. H., et al. Specific IgE measurement using AdvanSure(R) system: comparison of detection performance with ImmunoCAP(R) system in Korean allergy patients. Clinica Chimica Acta. (9-10), 914-919 (2012).
  9. Eckels, J., et al. Quality control, analysis and secure sharing of Luminex(R) immunoassay data using the open source LabKey Server platform. Bmc Bioinformatics. 14 (1), 145(2013).
  10. Bland, J. M., Altman, D. G. Statistical methods for assessing agreement between two methods of clinical measurement. Lancet. 327 (8476), 307-310 (1986).
  11. Carletta, J. Assessing Agreement on Classification Tasks: The Kappa Statistic. Computational Linguistics. 22 (2), 249-254 (1996).
  12. Shyur, S. D., et al. Determination of multiple allergen-specific IgE by microfluidic immunoassay cartridge in clinical settings. Pediatric Allergy and Immunology. 21, 623-633 (2010).
  13. Cesana, B. M., Antonelli, P., Gallazzi, E., Marino, A. Comparison of measurement methods: an endless application of wrong statistical methods. Intensive Care Medicine. 37 (6), 1038-1040 (2011).
  14. Park, K. H., Lee, J., Sim, D. W., Lee, S. C. Comparison of Singleplex Specific IgE Detection Immunoassays: ImmunoCAP Phadia 250 and Immulite 2000 3gAllergy. Annals of Laboratory Medicine. 38 (1), 23-31 (2018).
  15. Teppo, H., Revonta, M., Haahtela, T. Allergic rhinitis and asthma have generally good outcome and little effect on quality of life - a 20-year follow-up. Allergy. 66 (8), 1123-1125 (2011).
  16. Fischer, J., et al. Prevalence of type I sensitization to alpha-gal in forest service employees and hunters. Allergy. 72 (10), 1540-1547 (2017).
  17. Li, J., et al. A multicentre study assessing the prevalence of sensitizations in patients with asthma and/or rhinitis in China. Allergy. 64 (7), 1083-1092 (2009).
  18. Ahlstedt, S. Understanding the usefulness of specific IgE blood tests in allergy. Clinical & Experimental Allergy. 32 (1), 11-16 (2002).
  19. Wood, R. A., Segall, N., Ahlstedt, S., Williams, P. B. Accuracy of IgE antibody laboratory results. Annals of Allergy Asthma & Immunology. 100 (2), 288-289 (2008).
  20. Aberer, W., Kränke, B., Hager, A., Wick, G. In vitro allergy testing needs better standardization--test results from different laboratories lack comparability mostly due to missing effective standards. International Archives of Allergy & Immunology. 108 (1), 82-88 (1995).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Detectie van allergeenspecifiek IgE in serumchemiluminescentiesysteemmicroflu dische cartridgevergelijking met ImmunoCAPanalyse van allergeensensibilisatietemperatuurbewakingsprotocolprocedure voor het laden van reagentiaklinische foutbeoordelingtoepassing bij allergiediagnostiek

Gerelateerde artikelen