Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Magnetische resonantie beeldvorming beoordeling van carcinogeen-geïnduceerde lymfkliertest blaas tumoren

9.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59101

⸱

29 maart 2019

 ,  ,  , 
1Department of Surgery, Division of Urology, NorthShore University HealthSystem, 2Department of Radiology, Northwestern University Feinberg School of Medicine, 3Department of Urology, Northwestern University Feinberg School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Lymfkliertest blaas tumoren zijn geïnduceerd met de kankerverwekkende stof van N-butyl-N-(4-hydroxybutyl), nitrosamine (BBN). Blaas tumor generatie is heterogeen; Daarom is een nauwkeurige beoordeling van tumor last nodig voordat randomisatie aan experimentele behandeling. Hier presenteren we een snelle, betrouwbare MRI-protocol om de grootte van de tumor en stadium te beoordelen.

Samenvatting

Lymfkliertest blaas tumor modellen zijn van cruciaal belang voor de beoordeling van nieuwe therapeutische opties. Tumoren van de blaas geïnduceerde met de N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine (BBN) kankerverwekkend zijn voordelige over cel regel-gebaseerde modellen omdat ze nauw de genomic profielen van menselijke tumoren repliceren, en, in tegenstelling tot cel modellen en xenografts, ze bieden een goede gelegenheid voor de studie van immuuntherapie. Echter de blaas tumor generatie is heterogeen; Daarom is een nauwkeurige beoordeling van tumor last nodig voordat randomisatie aan experimentele behandeling. Hier beschreven is een muismodel van BBN en protocol blaas kanker tumor last om te evalueren in vivo met behulp van een snelle en betrouwbare magnetische resonantie (MR) volgorde (ware FISP). Deze methode is eenvoudig en betrouwbaar omdat, in tegenstelling tot ultrasound, MIJNHEER is exploitant-onafhankelijk en het mogelijk maakt eenvoudig na overname van de beeldverwerking en beoordeling. Met behulp van axiale beelden van de blaas, analyse van regio's van belang langs de wand van de blaas en de tumor toestaan voor de berekening van de blaas muur en tumor gebied. Deze meting correleert met ex vivo blaas gewicht (rs= 0.37, p = 0.009) en tumor stadium (p = 0.0003). Kortom, BBN genereert heterogeen tumoren die ideaal voor de evaluatie van immuuntherapie zijn en MRI kan snel en betrouwbaar beoordelen last van de tumor voorafgaand aan de randomisatie experimentele behandeling wapens op te pakken.

Inleiding

Blaaskanker is de vijfde meest voorkomende kanker algemene, verantwoordelijk voor ongeveer 80.000 nieuwe gevallen en 16.000 sterfgevallen in de Verenigde Staten in 20171. Na ongeveer 30 jaar zonder aanzienlijke vooruitgang in de systemische behandeling van blaas kanker2, recente anti-PD-1 en anti-PD-L1 checkpoint remmer proeven hebben aangetoond dat spannend en soms duurzaam reacties bij patiënten met geavanceerde urothelial carcinoom3,4,5. Echter, slechts ongeveer 20% van de patiënten tonen een objectief antwoord op deze behandelingen, en verdere studies zijn nodig om uit te breiden van het effectieve gebruik van immunotherapie bij patiënten met blaaskanker.

Lymfkliertest blaas kanker modellen zijn essentiële instrumenten in preklinische evaluatie van nieuwe behandelingen6,7. Om te controleren voor de grootte van de tumor als randomizing muizen op verschillende behandelingen, moet tumor lasten worden beoordeeld en gecontroleerd tussen behandelgroepen. Eerdere studies hebben echografie of bioluminescentie gebruikt om te evalueren van de orthotopic cel regel-gebaseerd blaas kanker modellen8,9,10,11. Echter, beide technieken presenteren verschillende nadelen. Echografie metingen kunnen worden beïnvloed door de vaardigheden van de operator en gebrek aan driedimensionale functies en hoge ruimtelijke resolutie. Bioluminescentie methoden kunnen alleen voorzien in semi-kwantitatieve evaluatie van de tumorcellen en sta niet voor visualisatie van blaas anatomie en morfologie. Bioluminescentie kan bovendien alleen worden gebruikt met cel regel-gebaseerde modellen, die bioluminescente genen in haarloze muizen of muizen met witte jassen uitdrukken.

Magnetische resonantie beeldvorming (MRI), aan de andere kant, biedt unieke flexibiliteit in de verwerving van anatomische resolutieafbeeldingen, exposeert een breed scala van weefsel contrast waarmee nauwkeurige visualisatie en kwantitatieve beoordeling van tumor last zonder de noodzaak om het uiten van bioluminescente eigenschappen. MIJNHEER beelden zijn gemakkelijker kunnen worden gereproduceerd met de passende analyse pijpleidingen en gegarandeerd van 3D-visualisatie van de blaas. De grootste beperkingen van MRI zijn de lengte van de tijd die nodig is voor een onderzoek en bijbehorende hoge kosten die hoge throughput assays beperken. Verschillende studies hebben echter aangetoond dat MIJNHEER sequenties kunnen bieden kwalitatief hoogwaardige diagnostische afbeeldingen die gebruikt kunnen worden om effectief te detecteren en volgen van cel regel-gebaseerd blaas tumoren; Dus, ze mogen worden gebruikt voor hoge-doorvoer analyse9,12.

Hier beschrijven we een niet-invasieve heer gebaseerde methode betrouwbaar en efficiënt karakteriseren carcinogeen-geïnduceerde blaas tumoren in muizen. Om dit te bereiken, gebruiken we een snelle beeldbewerking met steady-state precessie heer techniek (ware FISP), dat korte scannen sessies garandeert terwijl nog het verstrekken van hoge kwaliteit en hoge ruimtelijke resolutie (~ 100 micron) voor de detectie en meting van de blaas tumoren13. Bovendien, om te bevestigen de juistheid van deze niet-invasieve test van de MRI, beschrijven we de correlatie tussen MRI-afgeleide parameters, evenals ex vivo blaas gewicht en pathologisch bevestigd tumor stadium.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Northwestern University.

1. de inductie van tumoren met BBN

  1. Verkrijgen van mannelijke C57/BL6 muizen, elk ten minste 6 weken oud.
    Opmerking: Mannelijke muizen ontwikkelen blaaskanker meer snel en consistent dan vrouwelijke muizen14,15.
  2. Toevoegen N-nitrosobutyl(4-hydroxybutyl) amine (BBN) in een dosis van 0,05% aan het drinkwater. Opslaan in een ondoorzichtige container en het ad libitum als drinkwater te muizen16verstrekken.
    Opmerking: De BBN-oplossing op te slaan in een duidelijke container zal degraderen de kankerverwekkende stof17.
  3. De 0,05% BBN water tweemaal per week veranderen.
  4. De dieren controleren door te inspecteren op tekenen van nood tumoren van de blaas met inbegrip van hematurie, stevige blaas en massa's zijn gekoppeld. Inspecteer de muizen tweemaal per week of in overeenstemming met lokale IACUC richtsnoeren.
  5. Verwachten dat de tumoren te ontwikkelen tussen de 16 en 24 weken van blootstelling18.

2. MRI setup

  1. Uitvoeren van een subcutane injectie van steriele zoutoplossing (0,1-0,2 mL met behulp van een naald en 1 mL spuit van 25-27 G) 10 minuten voordat de MRI om de vulling van de blaas.
  2. Anesthetize elke muis met een gasmengsel van 100% O2 en Isofluraan (2 – 4% als nodig). Controleer of u een voldoende vlak van verdoving door het testen van de terugtrekking reflex (Teen snuifje) voordat u verdergaat. Steriele oog zalf toepassen op het dier.
  3. Overdracht van de muis aan de beeldvorming houder uitgerust met een neuskegel voor levering van geïnhaleerde Isofluraan (0,5%-3%).
  4. Monitor lichaamstemperatuur en ademhaling met behulp van een rectale temperatuurvoeler aangesloten op de computer van de fysiologische opname.
    Opmerking: Normale lichaamstemperatuur (36 – 37 ° C) wordt bijgehouden met behulp van de recirculatie warm watercircuit ingebouwd in de dierlijke heer houder. Temperatuur is gemeten door een sensor in rectale en opgenomen op de fysiologische controle computer met behulp van speciale fysiologische monitoring software. Hetzelfde systeem wordt gebruikt voor het opnemen van de ademhaling en elektrocardiogram signalen gemeten door middel van een pneumatische kussen onder de ribbenkast en via 3-voorsprong elektrocardiogram elektroden geplaatst. Het ademhalingssignaal wordt ook gebruikt voor triggering MRI acquisitie en het verminderen van artefacten die is gekoppeld aan de beweging van de ademhaling.

3. MRI Beeldacquisitie

  1. Gebruik een quadrature lichaam spoel voor excitatie.
  2. Een 4-kanaals ontvanger spoel plaats op de onderbuik van de muis wordt gescand zodat geoptimaliseerde detectie van signalen uit de regio van belang.
  3. Het starten van automatische aanpassingen via de geïntegreerde imaging software aan te schaffen een tri-axiale set van beelden van het hele muis lichaam. Identificeren van deze verwijzing set van beelden, de regio van belang (in dit geval, de regio van de blaas).
  4. Drie sets van orthogonale-gesneden beelden langs de axiale, coronale en Sagittaal vliegtuigen met behulp van radiologische referentiekaders verwerven.
  5. Gebruik maken van de ware FISP imaging sequentie (opgenomen als één van de functies van de geïntegreerde imaging software) met de volgende parameters van de heer: TR = 900 msec, TE = 2 ms, FA = 70, 14 gemiddelden.
    Opmerking: Deze set van parameters zorgt voor snelle weergave met hoge diagnostische kwaliteit, met inbegrip van T1/T2 weging in < 10 min per muis.
  6. Ruimtelijke resolutie en segment dikte worden bepaald door geometrische parameters geselecteerd door de gebruiker via de grafische interface van het geïntegreerde imaging platform. Dit resulteert in een aantal segmenten over de hele blaas van 0.5 mm dikte met een in-plane resolutie van 0.148 mm.

4. de heer beeldanalyse

  1. Het identificeren van de verzameling van segmenten van 0.5 mm dikte en in-plane resolutie van 0.148 mm die betrekking hebben op de hele blaas.
  2. Exporteren naar de software van de analyse van de medische beeldvorming door het selecteren van de map met bijbehorende afbeeldingen in de indeling analyseren.
  3. Selecteer "representatieve axiale weergave" in het midden van de blaas voor kwantitatieve analyse door scrollen door de gegenereerde beelden en het identificeren van een segment in het middelpunt van de blaas, die het mogelijk voor visualisatie van de muur van de blaas en de lumen maakt.
    Opmerking: Het midden-segment moet de uitverkorene met de grootste diameter.
  4. De regio van belang (ROI) zorgvuldig af te bakenen door het handmatig traceren de grenzen rond de buitenste rand van de blaas (BLAuit) en rond de binnenste lumen (BLAin) van de blaas (Zie schematische en representatieve cijfers in Figuur 2) in de geselecteerde representatieve axiale weergave.
  5. Aftrekken van de innerlijke lumen van de buitenste rand voor het berekenen van de oppervlakte van de wand van de blaas.
    BLAmuur = BLAuit - BLAin
    Opmerking: De oppervlakte van de blaas van een besturingselement met geen tumor moet kleiner zijn dan die met een blaas tumor.

5. euthanasie en dissectie van de blaas

  1. Na 20 weken van BBN blootstelling, euthanaseren de muizen met behulp van operationele standaardprocedures volgens lokale IACUC richtsnoeren.
  2. Reinig het gebied van de incisie met 70% ethanol, dan begrijpen en til de huid van de buikwand met een tang.
  3. Maak een incisie van de middellijn van de symphysis pubica aan het proces van de xiphoid.
  4. Scherp incise de peritoneale holte door grijpen met een tang en gebeuren met een schaar.
  5. Het identificeren van de blaas, die zich in de schouderstreek onderbuik bevindt.
  6. Identificeren en snijd het mediane navelstreng ligament aansluiten van de koepel van de blaas naar de navel en de buikwand.
  7. Pak de koepel van de blaas met een tang om countertraction en ontleden de blaas weg van omringende structuren, met inbegrip van de zaadblaasjes, endeldarm en vet.
  8. Identificeren van de urineleiders, de blaas invoeren en knippen met een schaar dicht bij de blaas.
  9. De blaas craniale tillen, snijd de urethra met een schaar en verwijderen van de blaas.
  10. Weeg onmiddellijk de blaas na het spoelen met PBS.

6. histologische onderzoek van weefsel van de blaas

  1. Corrigeer de blaas weefsel in 10% neutraal gebufferde formaline 36 – 48 uur bij kamertemperatuur (RT).
  2. Het weefsel inbedden in paraffineblokken, knippen van de dia's voor onderzoek achteraf plaatsvindt en vlekken van de dia's met haematoxyline en eosine voor microscopisch onderzoek zoals eerder beschreven19,20.
  3. Uitvoeren van een microscopisch onderzoek van de blaas van de muis bij lage (2,5 x en 10 x) en hoog (20 x en 40 x) vergrotingen, onderzoeken voor macroscopische letsels, hyperplasie, carcinoma in situ, papillomas, papillaire tumoren en invasieve gezwellen19 , 21.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Met behulp van het protocol beschreven (Figuur 1), zijn blaas tumoren geïnduceerd in C57/B6 mannelijke muizen. MRI werd uitgevoerd op 16 weken, en muizen werden euthanized bij 20 weken. Ex vivo blaas gewichten (BW) voor elke muis werden geregistreerd. Dia's werden gekleurd met haematoxyline en eosine en alle dia's van de histologie werden herzien voor tumor stadium.

Voor het analyseren van ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Nauwkeurige beeldvorming van tumor modellen is noodzakelijk voor de juiste pre euthanasie fasering en dierlijke randomisatie voorafgaand aan de inleiding van experimentele behandeling. Met behulp van de procedure die hier gepresenteerd, tonen wij methodologie om (1) het genereren van tumoren van de blaas met behulp van de BBN carcinogeen en (2) stratificeren blaas tumor last door middel van een heer MR. afkomstige gebied meting (BLAmuur) correlaten aanzienlijk met ex vivo blaas gewicht en wordt geasso...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

J. J. M. wordt gefinancierd door de Veterans Health Administration verdienste verlenen van BX0033692-01. J. J. M. wordt ook ondersteund door de John P. Hanson Foundation for Cancer Research aan de Robert H. Lurie uitgebreide kanker centrum van Noordwestelijke Universiteit. Wij danken het centrum voor translationeel Imaging voor de verlening van de MRI-acquisitie en verwerking. Financieringsbronnen had geen rol in het schrijven van het manuscript of de beslissing tot het indienen voor publicatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
C57BL/6 muizenThe Jackson Laboratory664Muizen
N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine carcinogeen (BBN)TCI AmericanB0938Carcinogeen
0,9% normale zoutoplossingHospira, IncNDC 0409-488-02
IsofluraanPiramal HealthCare60307-120-25Anesthetisch middel
7Tesla ClinScan MRIBrukerNAGespecialiseerde beeldvorming MRI voor kleine dieren
SyngoSiemensNAMR Integrated Imaging Software
Model 1030 Monitoring & Gating SystemSmall Animal Instruments, Inc. (SAII)NAFysiologisch monitoring van kleine dieren
Formaline, neutraal gebufferd, 10%SigmaHT501128Fixeermiddel
Eosine YFisher ScientificNC1093844Histologisch kleurmiddel
HematoxylinenFisher Scientific23-245651Histologisch kleurmiddel
Jim7Xinapse SystemsNAMedische beeldanalysesoftware
GraphPad Prism v7.04GraphpadNAGrafische software
R v3.4.2The R Project for Statistical ComputingNAStatistische software
R-pakket pROC v1.10.0.The R Project for Statistical ComputingNAROC-analyse

Referenties

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
  2. Abdollah, F., et al. Incidence, survival and mortality rates of stage-specific bladder cancer in United States: a trend analysis. Cancer Epidemiology. 37 (3), 219-225 (2013).
  3. Rosenberg, J. E., et al. Atezolizumab in patients with locally advanced and metastatic urothelial carcinoma who have progressed following treatment with platinum-based chemotherapy: a single-arm, multicentre, phase 2 trial. The Lancet. 387 (10031), 1909-1920 (2016).
  4. Sharma, P., et al. Nivolumab monotherapy in recurrent metastatic urothelial carcinoma (CheckMate 032): a multicentre, open-label, two-stage, multi-arm, phase 1/2 trial. The Lancet Oncology. 17 (11), 1590-1598 (2016).
  5. Bellmunt, J., et al. Pembrolizumab as Second-Line Therapy for Advanced Urothelial Carcinoma. New England Journal of Medicine. 376 (11), 1015-1026 (2017).
  6. Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse orthotopic models for bladder cancer research. BJU International. 104 (9), 1286-1291 (2009).
  7. Zhang, N., Li, D., Shao, J., Wang, X. Animal models for bladder cancer: The model establishment and evaluation (Review). Oncology Letters. 9 (4), 1515-1519 (2015).
  8. Patel, A. R., et al. Transabdominal micro-ultrasound imaging of bladder cancer in a mouse model: a validation study. Urology. 75 (4), 799-804 (2010).
  9. Chin, J., Kadhim, S., Garcia, B., Kim, Y. S., Karlik, S. Magnetic resonance imaging for detecting and treatment monitoring of orthotopic murine bladder tumor implants. The Journal of Urology. 145 (6), 1297-1301 (1991).
  10. Jurczok, A., Fornara, P., Soling, A. Bioluminescence imaging to monitor bladder cancer cell adhesion in vivo: a new approach to optimize a syngeneic, orthotopic, murine bladder cancer model. BJU International. 101 (1), 120-124 (2008).
  11. Vandeveer, A. J., et al. Systemic Immunotherapy of Non-Muscle Invasive Mouse Bladder Cancer with Avelumab, an Anti-PD-L1 Immune Checkpoint Inhibitor. Cancer Immunology Research. 4 (5), 452-462 (2016).
  12. Kikuchi, E., et al. Detection and quantitative analysis of early stage orthotopic murine bladder tumor using in vivo magnetic resonance imaging. Journal of Urology. 170, 1375-1378 (2003).
  13. Chung, H. W., et al. T2-weighted fast MR imaging with true FISP versus HASTE: comparative efficacy in the evaluation of normal fetal brain maturation. American Journal of Roentgenology. 175 (5), 1375-1380 (2000).
  14. Miyamoto, H., et al. Promotion of bladder cancer development and progression by androgen receptor signals. Journal of the National Cancer Institute. 99 (7), 558-568 (2007).
  15. Bertram, J. S., Craig, A. W. Specific induction of bladder cancer in mice by butyl-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine and the effects of hormonal modifications on the sex difference in response. European Journal of Cancer. 8 (6), 587-594 (1972).
  16. Nagao, M., et al. Mutagenicity of N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine, a bladder carcinogen, and related compounds. Cancer Research. 37, 399-407 (1977).
  17. Hirose, M., Fukushima, S., Hananouchi, M., Shirai, T., Ogiso, T. Different susceptibilities of the urinary bladder epithelium of animal species to three nitroso compounds. Gan. Gann; The Japanese Journal of Cancer Research. 67 (2), 175-189 (1976).
  18. Shin, K., et al. Cellular origin of bladder neoplasia and tissue dynamics of its progression to invasive carcinoma. Nature Cell Biology. 16 (5), 469-478 (2014).
  19. Epstein, J. I. Chapter 17: Immunohistology of the Bladder, Kidney, and Testis. Diagnostic Immunohistochemistry. , Fifth Edition, 624-661 (2019).
  20. Cohen, S. M., Ohnishi, T., Clark, N. M., He, J., Arnold, L. L. Investigations of rodent urinary bladder carcinogens: collection, processing, and evaluation of urine and bladders. Toxicologic Pathology. 35 (3), 337-347 (2007).
  21. Wood, D. P. Jr Tumors of the bladder. Campbell-Walsh Urology. 11 (92), 2184-2204 (2016).
  22. Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillere, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. Mouse models in oncoimmunology. Nature Reviews Cancer. , (2016).
  23. Kaneko, S., Li, X. X chromosome protects against bladder cancer in females via a KDM6A-dependent epigenetic mechanism. Science Advances. 4 (6), eaar5598(2018).
  24. Smilowitz, H. M., et al. Biodistribution of gold nanoparticles in BBN-induced muscle-invasive bladder cancer in mice. International Journal of Nanomedicine. 12, 7937-7946 (2017).
  25. Dai, Y. C., et al. The interaction of arsenic and N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine on urothelial carcinogenesis in mice. PLoS One. 12 (10), e0186214(2017).
  26. Williams, P. D., Lee, J. K., Theodorescu, D. Molecular Credentialing of Rodent Bladder Carcinogenesis Models. Neoplasia. 10 (8), (2008).
  27. Fantini, D., et al. A Carcinogen-induced mouse model recapitulates the molecular alterations of human muscle invasive bladder cancer. Oncogene. 37 (14), 1911-1925 (2018).
  28. Network, N. C. C. NCCN Guidelines in Clinical Oncology - Bladder Cancer 5.2018. , Available from: https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/bladder.pdf (2018).
  29. Costa, M. J., Delingette, H., Novellas, S., Ayache, N. Automatic segmentation of bladder and prostate using coupled 3-D deformable models. Medical Image Computing and Computer-Assisted Intervention. 10 (Pt 1), 252-260 (2007).
  30. Rosenkrantz, A. B., et al. Utility of quantitative MRI metrics for assessment of stage and grade of urothelial carcinoma of the bladder: preliminary results. American Journal of Roentgenology. 201 (6), 1254-1259 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

BlaastumorBBN-carcinogeenmuismodeltumorlasttrue FISP-sequentiedikte van de blaaswandex vivo blaasgewichttumorstadiumbeoordelingevaluatie van immunotherapie
Magnetische resonantie beeldvorming beoordeling van carcinogeen-geïnduceerde lymfkliertest blaas tumoren
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.