Methodenartikel

Fluorescerende visualisatie van mango-Tagged RNA in Polyacrylamide gels via een Poststaining methode

DOI:

10.3791/59112

⸱

21 juni 2019

 ,  , 
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, Simon Fraser University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een gevoelige, snelle en discriminerende post-gel kleuring methode om image-ASE Tagged met RNA mango aptameren I, II, III, of IV, met behulp van een native of denaturerende Polyacrylamide gel elektroforese (pagina) gels. Na het runnen van standaard pagina gels, mango-gecodeerde RNA kan gemakkelijk worden gekleurd met TOT1-Biotine en vervolgens geanalyseerd met behulp van de meest beschikbare fluorescentie lezers.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Native en denaturerende Polyacrylamide gels worden routinematig gebruikt om ribonucleoproteã (RNP) complexe mobiliteit te karakteriseren en de grootte van RNA te meten, respectievelijk. Zoals veel gel-Imaging technieken gebruiken niet-specifieke vlekken of dure fluorophore sondes, gevoelige, discriminerende, en economische gel-Imaging methodologieën zijn zeer wenselijk. De de kern opeenvolgingen van RNA mango zijn kleine (19-22 NT) opeenvolgings motieven die, wanneer gesloten door een willekeurige Steel van RNA, eenvoudig en goedkoop aan een RNA van belang kunnen worden toegevoegd. Deze mango Tags binden met een hoge affiniteit en specificiteit van een Thiazole-Orange fluorophore ligand genaamd TOT1-biotine, die wordt duizenden malen meer fluorescerende op bindend. Hier laten we zien dat mango I, II, III, en IV kan worden gebruikt om specifiek beeld RNA in gels met een hoge gevoeligheid. Zo weinig zoals 62,5 fmol van RNA in inheemse gels en 125 fmol van RNA in het denatureren gels kan worden ontdekt door het weken gels in een beeldvormings buffer die kalium en 20 nM TOT1-Biotine voor 30 min bevat. We tonen de specificiteit van de mango-Tagged systeem door Imaging een mango-gecodeerde 6S bacteriële RNA in de context van een complex mengsel van totale bacteriële RNA.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mango is een RNA-tagging systeem bestaande uit een set van vier kleine fluorescerende RNA aptameren die stevig binden (nanomolar binding) aan eenvoudige derivaten van de Thiazole-Orange (TOT1-biotine, Figuur 1a)1,2,3 . Bij het binden wordt de fluorescentie van dit ligand verhoogd 1.000-naar 4.000-voudig afhankelijk van de specifieke aptamer. De hoge helderheid van het mango systeem, dat voor Mango III dat van verbeterde groene fluorescente proteïne (eGFP) overschrijdt, combineerde met de nanomolar bindende affiniteit van de mango aptameren van RNA, laat het toe om zowel in de beeldvorming als de reiniging van RNA worden gebruikt complexen2,4.

De X-Ray structuren van mango I5, II6, en III7 zijn bepaald aan hoge resolutie, en alle drie APTAMEREN gebruiken een RNA quadruplex om tot1-Biotine (Figuur 1b– D) te binden. De compacte kernen van alle drie de aptameren zijn geïsoleerd van de externe RNA sequentie via compacte adapter motieven. Mango I en II maken beide gebruik van een flexibele GNRA-achtige lus adapter om hun mango kernen aan te sluiten op een willekeurige RNA duplex (Figuur 1b, C). In tegenstelling, mango III maakt gebruik van een rigide triplex motief om de kern te verbinden met een willekeurige Helix (figuur 1d, paarse residuen), terwijl de structuur van de mango IV is momenteel niet bekend. Aangezien de ligand-bindende kern van elk van deze aptameren van de externe opeenvolging van RNA door deze spiraalvormige adapters wordt gescheiden, schijnt het waarschijnlijk dat zij allen eenvoudig in een verscheidenheid van ASE kunnen worden opgenomen. De bacteriële 6s Regulatory RNA (Mango i), componenten van de gist spliceosoom (Mango i), en de menselijke 5s RNA, U6 RNA, en een C/D scaRNA (Mango II en IV) zijn allemaal met succes gecodeerd in deze mode2,8, wat suggereert dat veel biologische ASE kan worden gelabeld met behulp van de RNA mango aptamer systeem.

Het denatureren en de inheemse gels worden algemeen gebruikt om ASE te bestuderen. Het denatureren gels worden vaak gebruikt om de grootte van RNA of de verwerking van RNA te beoordelen, maar typisch, in het geval van een noordelijke vlek, bijvoorbeeld, vereis verscheidene langzame en opeenvolgende stappen om een beeld te produceren. Terwijl andere RNA fluorogenic aptameren, zoals RNA spinazie en broccoli, zijn met succes gebruikt voor gel Imaging9, geen fluorogenic aptamer systeem tot op heden beschikt over de hoge helderheid en affiniteit van de mango-systeem, waardoor het van aanzienlijk belang om te onderzoeken mango gel-Imaging capaciteiten. In deze studie, vroegen we ons af of de RNA mango systeem kan eenvoudig worden uitgebreid tot gel beeldvorming, zoals de excitatie en emissie golflengten van TOT1-Biotine (510 Nm en 535 nm, respectievelijk) zijn geschikt voorbeeld vorming in de eGFP kanaal gemeenschappelijke voor de meeste fluorescerende gel-Scanning instrumentatie.

De post-gel kleuring protocol hier gepresenteerd biedt een snelle manier om specifiek te detecteren mango-gecodeerde RNA-moleculen in native en denaturerende Polyacrylamide gel elektroforese (pagina) gels. Deze kleuring methode omvat weken gels in een buffer met kalium en TOT1-biotine. RNA mango aptameren zijn G-quadruplex gebaseerd en kalium is nodig om dergelijke structuren te stabiliseren. Gebruikend RNA dat van minimale mango-codeert de malplaatjes van DNA wordt getranscribeerd (Zie de sectie van het Protocol), kunnen wij eenvoudig zo weinig zo weinig zoals 62,5 fmol van RNA in inheemse gels en 125 fmol van RNA in het denatureren gels ontdekken, gebruikend een ongecompliceerd Protocol van de kleuring. In tegenstelling tot gemeenschappelijke niet-specifieke Nucleic zure vlekken (Zie lijst van materialen, die naar SG van hierop wordt verwezen), kunnen wij mango-geëtiketteerde RNA duidelijk identificeren zelfs wanneer de hoge concentraties van totaal untagged RNA in de steekproef aanwezig zijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. voorbereiding van de reagentia

  1. TOT1-Biotine poststaining oplossing (gel kleuring oplossing)
    1. Maak 1 L van 1 M fosfaatbuffer bij pH 7,2 bij 25 °C door 342 mL van 1 M na2HPO4 en 158 ml van 1 m Nah2po4toe te voegen. Pas pH aan 7,2 bij 50 mM aan door de aangewezen fosfaat oplossing toe te voegen. Steriel-filter met behulp van een 0,2 µm filter en bewaar de oplossing in plasticware bij kamertemperatuur.
    2. Bereid 5x gel kleuring oplossing (zonder TOT1-Biotine) als volgt. Maak een 1 L oplossing door het mengen van 247,5 mL ddH2O, 700 ml 1 m KCl, 50 ml 1 m fosfaatbuffer (pH 7,2), en 2,5 ml tween 20. Steriel-filter met behulp van een 0,2 µm filter en bewaar de oplossing in plasticware. Het kan worden opgeslagen bij kamertemperatuur.
      Nota: MgCl2 kan aan deze oplossing worden toegevoegd indien vereist aangezien het de complexen van RNA kan potentieel stabiliseren. Dit zal een bescheiden impact hebben op het fluorescerende signaal2.
    3. Make-up een 1x gel kleuring oplossing met behulp van de 5x gel kleuring oplossing van stap 1.1.2 en, onmiddellijk voorafgaand aan het gebruik, aan te vullen met TOT1-Biotine fluorophore (Zie tabel van materialen) tot een definitieve concentratie van 20 Nm. Bijvoorbeeld, Voeg 20 mL van 5x gel kleuring oplossing om 80 mL van deioniseerde water tot 100 mL van 1x gel kleuring oplossing te maken, en voeg 2 µ L van een 1 mM TOT1-Biotine voorraad (bereid in dimethylformamide).
      Opmerking: de extinctiecoëfficiënt voor de TOT1-Biotine kleurstof op 500 nm is 63.000 M-1· cm-1, gemeten in kleuring oplossing1.
  2. Denaturerende pagina (2x denaturerende gel loading oplossing en oplossingen A, B, C, ammonium persulfate, en tetramethylethylenediamine)
    1. Bereid 50 mL van 2x denaturerende gel loading oplossing door het mengen van 40 mL formamide, 0,5 mL van 0,5 M ethylenediaminetetraacetic zuur (EDTA, pH 8,0), en 9,5 mL ddH2O. De oplossing kan bij kamertemperatuur worden opgeslagen. Het laden van kleurstoffen worden niet toegevoegd aan deze oplossing als het kan verduisteren fluorescerende beeldvorming.
    2. Bereid 2x denatureren gel laden kleurstof als volgt. Bij het zuiveren van RNA en DNA oligonucleotides, Voeg 0,5 mL 2,5% (w/v) bromophenol blauw (BB) en 0,5 mL 2,5% (w/v) xyleen cyanol (XC) toe aan de oplossing zoals beschreven in stap 1.2.1, en voeg 8,5 mL ddH2O toe in plaats van 9,5 ml. De oplossing kan bij kamertemperatuur worden opgeslagen.
    3. Bereid 100 mL van de oplossing A door het afwegen van 200,2 g ureum (formule gewicht: 60,06 g/mol) en toe te voegen aan 312,5 mL van 40% 19:1 acrylamide: N, N '-methylenebisacrylamide. Roer het met een magnetische roerstaaf op maximale snelheid tot opgelost (ongeveer 3 uur) en make-up de oplossing voor 500 mL met behulp van ddH2O. Merk op dat de uiteindelijke concentraties 6,667 M ureum en 25% 19:1 acrylamide zijn: N, n '-methylenebisacrylamide. Opslag bij 4 °C in schone plasticware.
    4. Bereid 1 L oplossing B voor met een gewicht van 400,4 g ureum en vul de oplossing in op 1 L met ddH2O; roer tot het ureum is opgelost. Oplossing B kan bij kamertemperatuur worden bewaard.
    5. Bereid oplossing C (10x tris-borate-EDTA [TBE]) als volgt. Bereid 4 L van 10x TBE door 432 g van tris basis en 220 g van boorzuur af te wegen, toevoegend 160 mL van 0,5 M EDTA met een pH van 8 (gefiltreerd), en omhoog het maken van de oplossing aan 4 L met ddH2O. Een grote voorraad van deze buffer wordt gemaakt aangezien het ook als gel lopende buffer wordt gebruikt.
    6. Bereid 10% ammonium persulfate (APS) voor door 1 g APS op te lossen in een totaal volume van 10 mL ddH2O. opslag bij 4 °c.
    7. Houd tetramethylethylenediamine (TEMED) handig. Bewaar het bij 4 °C samen met de APS oplossing.
  3. Native PAGE (2x native gel loading oplossing)
    1. Bereid 50 mL van 2x native gel loading oplossing door het mengen van 25 mL 100% glycerol, 10 mL van 5x gel kleuring oplossing, en 15 mL van ddH2O om de oplossing te maken tot 50 ml.
      Opmerking: zoals in de denaturering gel sectie, kan het laden van kleurstoffen worden toegevoegd aan dit bestand, maar hun toevoeging kan potentieel obscure het fluorescerende signaal in de gel en, dus, moet worden vermeden.

2. voorbereiding en laden van denaturerende gels

  1. Bereid een denaturerende gel met een passend percentage door de volgende tabel 1. Overweeg de specifieke gel gieten systeem; 30 mL gels worden vaak gebruikt. De juiste gel percentage kan worden geschat met behulp van tabel 2: Selecteer de Polyacrylamide percentage waar de BB en XC kleurstoffen hebben motilities sneller en langzamer, respectievelijk, dan het RNA van belang, om te zorgen voor high-band scheiding in de relevante grootte Bereik.
  2. Mix oplossingen A, B en C volgens tabel 1 en voeg APS en TEMED onmiddellijk voorafgaand aan het gieten van de gel. Meng de oplossingen goed in schone plasticware.
  3. Giet de gel-oplossing in een geschikte gel giet apparaat, na ervoor te zorgen dat alle componenten zijn nauwgezet schoon. Til de ene kant van het apparaat, zodat de gel is licht gekanteld bij het gieten, om te voorkomen dat luchtbellen steeds opgesloten in de gel zelf.
  4. Plaats de gewenste kam en laat deze naar polymeriseren (ongeveer 30 min). Observeer de polymerisatie door te kijken naar een verandering in de index van breking rond de gel putten. Maak de gel tank met behulp van 1x oplossing C (1x TBE) en verwijder voorzichtig de kam. Met behulp van een spuit, aspireren uit de putten onmiddellijk voorafgaand aan het monster laden.
  5. Bereid denaturerende monsters als volgt. Voeg 2x denaturerende gel loading oplossing om de RNA monsters van belang te maken van de denaturerende gel laad-oplossing 1x en warmte-denatuur bij 95 ° c voor 5 min met behulp van een Thermocycler of een waterbad.
  6. Voorafgaand aan het laden van de monsters, Air-cool ze enkele minuten totdat ze zijn cool om aan te raken. Laad de monsters door gelaagdheid ze op de bodem van elk goed, met behulp van gel-loading tips.
    Opmerking: rond tips kunnen gebruikt worden voor gels van 1 mm dikte of meer; gebruik platte tips voor dunnere gels.
  7. Voer de denaturerende gels bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat het wattage voldoende laag is, zodat de glazen platen van het gel-systeem niet kraken.
    Opmerking: in ons laboratorium was 28 W voor 20 cm x 16 cm platen voldoende voor dit doel.

3. voorbereiding en laden van native gels

  1. Bereid een native gel met een passend percentage door te verwijzen naar tabel 3. Overweeg de specifieke gel gieten systeem, maar houd in gedachten dat 30 mL gels worden vaak gebruikt. Meng de oplossingen van 1x TBE, 40% 29:1 acrylamide: N, N '-methylenebisacrylamide, en glycerol volgens tabel 3, en voeg APS en TEMED onmiddellijk voorafgaand aan het gieten van de gel. Ga verder zoals beschreven in stap 2,3 en 2,4.
  2. Bereid inheemse steekproeven door toe te voegen 2x inheemse de ladings oplossing van het gel aan de steekproeven van RNA van belang om de oplossing 1x te maken en het toe te laten om bij kamertemperatuur voor 100 min voorafgaand aan het runnen van het gel te incuberen om het volledige RNA vouwen
  3. Voer de native gel in een 4 ° c koude kamer, ervoor te zorgen dat het wattage voldoende laag is om niet warmte van de gel.
    Opmerking: in ons laboratorium is 14 W voor 20 cm x 16 cm platen voldoende voor dit doel.

4. RNA voorbereiding door run-off de transcriptie van

Opmerking: DNA-sequenties gebruikt voor de run-off transcriptie10 van RNA mango constructen werden commercieel besteld. In deze methode, DNA-oligonucleotides met de omgekeerde complement (RC) van zowel de sequentie te worden getranscribeerd en de doel promotor worden gekruist aan een deel van de deelnemers van de top strand volgorde en vervolgens getranscribeerd in vitro. Hieronder wordt voor elke Oligonucleotide de RC van de mango kern sequentie vetgedrukt weergegeven en wordt de RC van de regio van de deelnemer in het gebied cursief weergegeven. Residuen in de reguliere lettertype komen overeen met anders willekeurige complementaire spiraalvormige gebieden die nodig zijn om de mango kern goed vouwen.

Mango I: GCA CGT ACT CTC CTC TCC GCA CCG tcc CTT cgt ACG TGC cta tag TGA GTC GTA TTA AAG
Mango II: GCA CGT ACT CTC CTC TTC CTC tcc tct Cao cgt ACG TGC Cta tag TGA GTC GTA TTA AAG
Mango III: GGC ACG TAC GAA tat ACC ACA TAC CARDOEN tcc TTC CTT CGT ACG TGC Cta tag TGA GTC GTA TTA AAG
Mango IV: GCA CGT ACT CGC CTC ATC CTC ACC Act CCC TCG GTA CGT gcc tat AGT gag TCG tat Terry AG
De Top strand: CTT TERRY TAC GAC TCA CTA TAG G

  1. Voorbereidende gel zuivering van DNA oligonucleotides
    1. Voor een 0,2 µmol DNA-synthese, opnieuw op te schorten de onbeschermde DNA-oligonucleotide in 100 µ L van ddH2O en 100 µ l van 2x denatureren laden kleurstof (vanaf stap 1.2.2). In dit geval, met inbegrip van gel laden kleurstoffen in de laad-oplossing op dezelfde concentratie als in stap 1.2.2 heeft de voorkeur.
    2. Zuiveren van de DNA-oligonucleotide met behulp van een 50 mL voorbereidende schaal denaturering gel van de juiste Polyacrylamide percentage; Gebruik tabel 2 om het gel percentage te kiezen. Gebruik bijvoorbeeld een 8% gel voor een 50 NT sequentie. Idealiter moet bromophenol Blue sneller dan de oligonucleotide, en xyleen cyanol moet langzamer draaien.
      Nota: in ons laboratorium, werden dergelijke gels gegoten gebruikend het gieten van afstandhouders die 1,5 mm dik waren en een gel-ladende kam met putten die 2-2.5 cm breed waren.
    3. Laad 100 µ L van de DNA oligonucleotide oplossingen voorbereid in stap 4.1.2 per voorbereidende gel en beschreven in stappen 2.4 – 2.7.
    4. Voorzichtig droog de buitenkant van de gel, verwijder de glazen platen, en bedek beide zijden van de gel in plastic folie. Plaats het op een fluorescerende beeldscherm (aluminium-backed dun-laag chromatografie platen geïmpregneerd met fluorophore zijn een economische oplossing) en gebruik een korte golflengte UV hand-held lamp om de DNA-bands visualiseren door UV-shadowing.
    5. Een heldere, goed gedefinieerde schaduw moet worden waargenomen als de DNA-synthese is van hoge kwaliteit. Markeer de bands op de plastic wrap, met behulp van een permanent marker.
      Opmerking: Bescherm de huid en de ogen tegen UV-licht en houd de blootstelling kort om beschadiging van het nucleïnezuur monster te voorkomen.
    6. Het plaatsen van de gel op een schone glazen plaat, zorgvuldig Knip de gemarkeerde bands en plaats elk gel fragment in 400 µ L van 300 mM NaCl. Elueer het DNA 's nachts, met behulp van een Rotator bij kamertemperatuur.
    7. Recover de eluens in een schone centrifugebuis en voeg 2,5 equivalenten van ethanol aan het DNA neerslag. Draai de buis goed en plaats de tube bij-20 °C gedurende 30 minuten.
    8. Pellet het monster in een bankje top centrifuge op 156.000 x g voor 30 min bij 4 ° c. Verwijder voorzichtig de bovendrijvende en hersuspendeer de pellet in ddH2O. gebruik een spectrofotometer om de DNA-oligonucleotide concentratie nauwkeurig te bepalen. Bewaar het monster als een 10 μM voorraad voor het gemak bij-20 ° c.
  2. Run-off transcriptie en gel zuivering van RNA monsters
    1. Bereid 5x nucleoside trifosfaat (NTP) voorraad door het mengen van vloeibare NTP voorraden samengesteld uit een definitieve concentratie van 40 mM Guanosine trifosfaat (GTP, 11.400 M-1· cm-1), 25 mm Cytidine trifosfaat (CTP, 7.600 M-1· cm-1), 25 mm adenosine trifosfaat (ATP, 5.000 M-1· cm-1), en 10 mm Uridine trifosfaat (UTP, 10.000 m-1· cm-1); alle extinctie coëfficiënten op 260 nm.
      Opmerking: vloeibare of gepoederde voorraden kunnen commercieel worden verkregen. Als het voorbereiden van primaire voorraden van poeder, pas zorgvuldig de pH aan een definitieve pH van 7,9, gebruikend 1 M NaOH aan. De Bouillon in 1,5 mL microcentrifuge tubes en bewaar deze bij-20 °C.
    2. Bereid 100 mL van 10x de transcriptie buffer voorraad door het mengen van 25,6 mL van 1 M Tris-HCl, 14,4 mL van 1 M Tris basis, 26 mL van 1 M MgCl2, 10 ml van 10% Triton X-100, en 0,637 g van acetyltransferase. Maak de voorraad tot een eindvolume van 100 mL door toevoeging van ddH2O.
      Opmerking: een definitieve pH van 7,9 van de 1x oplossing moet worden bevestigd met behulp van een geijkte pH-meter. De 10x moet worden steriel gefilterd en opgeslagen bij-20 ° c in voldoende grote hoeveelheid.
    3. Voer transcriptie als volgt uit.
      1. Voeg de volgende reagentia toe om een eindconcentratie van 1x de transcriptie buffer te maken met behulp van de 10x tempels transcriptie buffer Stock en ddH2O (vanaf stap 4.2.2), 1x NTPs, 10 mm DITHIOTHREITOL (DTT), 1 μM de top strand sequentie (zie sectie 4 Opmerking sequentie), 1 μM gel-gezuiverde mango DNA-sequentie (stap 2,1), en het het polymerase enzym van de RNA (1 U/µ L).
      2. Vortex, spin down, en Incubeer de oplossing bij 37 °C voor 2 uur of tot het troebel wordt en een witte neerslag vormt aan de onderkant van de buis. Een 50 µ L transcriptie moet resulteren in 50 µ L van ~ 50 µ M RNA na gel zuivering. Voeg een gelijk volume van 2x denaturerende kleurstof toe en bewaar het bij-20 °C tot klaar voor de reiniging van het gel.
    4. Gel-zuivert het resulterende RNA zoals beschreven in de sectie van de reiniging van het gel van DNA oligonucleotides door stappen te volgen 4.1.2 \ u 20124.1.8, vervangend de steekproef van RNA voor DNA.
      Nota: RNA is uiterst gevoelig voor ASE degradatie, zodat ervoor zorgt dat in alle stappen, de handschoenen en een schone laboratorium laag te allen tijde worden gedragen. Zorg ervoor dat alle monsters worden bereid en opgeslagen in plasticware voor eenmalig gebruik om te beschermen tegen de opofferings-ASE besmetting, en wassen glasplaten zorgvuldig met hete zeep en water voorafgaand aan het gebruik, spoel ze grondig met ddH2O, en droog het glaswerk met de hulp van ethanol toegepast vanuit een knijpfles.
    5. Gebruik 1 l van het uiteindelijke RNA-monster en bepaal met behulp van een op druppels gebaseerde spectrofotometer de absorptie op 260 nm. Met behulp van een extinctiecoëfficiënt bepaald door de dichtstbijzijnde buurman methode, bereken de concentratie van RNA en pas de monster concentratie tot 10 μM met ddH2O voor het gemak. Bewaar de RNA samples bij-20 °C.
  3. Escherichia coli totale ruwe nucleïnezuur extractie
    Opmerking: het volgende protocol is een voorbeeld. Dit protocol maakt gebruik van endogene uitgedrukt mango I-Tagged 6S RNA uit een plasmide in E. coli, en inductie van deze plasmide is elders beschreven in detail4.
    1. Voor de toepassing van deze studie, bereiden 500 mL van geïnduceerde cellen voor zowel de pEcoli-RNA mango en de pEcoli-T1 plasmiden (de cellen worden geïnduceerd bij een OD600nm van 1). Pellet de cellen en bewaar ze op-80 °C voorafgaand aan het gebruik.
    2. Voer de extractie van RNA als volgt uit.
      1. Neem 0,5 mL van de geïnduceerde pEcoli Cell pellet en voeg 500 l van geëquilibreerd fenol. Dan, Vortex het monster; de oplossing zal worden melkachtig wit. Centrifugeer bij maximumsnelheid voor 2 min om de lagen te scheiden.
      2. Uittreksel naar de toppunt stratum, wie zal zitten lichtelijk geel, en repeteren trede 4.3.2.1 tegen bijvoeging een gelijk volume van fenol, centrifugeren, en winning voor te in totaal van 5x (of voor naar de middelste Stratum, wie zit ondoorzichtig wit, gaat weg en uitsluitend tweetal zuiver lagen zitten verlaten).
      3. Voeg het door fenol geëxtraheerde waterige volume toe aan een gelijk volume chloroform, Vortex, en centrifugeer bij maximale snelheid gedurende 2 minuten.
      4. Haal de waterige laag en voeg NaCl toe aan een eindconcentratie van 300 mM. Precipitatie het resulterende nucleic zuur door de toevoeging van 2,5 equivalenten van ethylalcohol, Vortex, rotatie neer, en neerslag bij-20 °C minstens 30 min.
      5. Pellet in een bench top centrifuge bij 15,6 x 1.000 x g bij 4 °c gedurende 30 min. Verwijder voorzichtig de bovendrijvende en hersuspendeer de pellet in 100 l van ddH2O.
      6. Voeg een DNase I-digestie stap toe aan deze procedure, naar aanleiding van het protocol11waarnaar wordt verwezen, om het totale RNA te verkrijgen.
        Opmerking: Vortex krachtig tot de pellet volledig is opgelost in ddH2O.

5. post-gel kleuring

  1. Bereid 1x gel kleuring oplossing volgens het recept in stap 1.1.3 en voeg het toe aan een schone glazen container die breed genoeg is om comfortabel fit de gel.
    Opmerking: borosilicaatglas glazen containers met snap fit deksels dienen dit doel goed.
  2. Voeg genoeg 1x gel kleuring oplossing om de container, zodat de gel is volledig bedekt met de oplossing en de vloeistof sloshes over de bovenkant van de gel wanneer het wordt geplaatst op de orbitale Rotator.
    Nota: de container moet groot genoeg zijn om het gel te passen zodat het kan bewegen en genoeg buffer in de container hebben om de gel volledig te behandelen.
  3. Zodra de native of denaturerende gel klaar is met lopen (sectie 2 of 3, respectievelijk), verwijder de gel van het apparaat en snijd de putten. Het kan nuttig zijn om een hoek van de gel te verwijderen voor oriëntatie later in de analyse.
  4. Breng de gel voorzichtig over naar de 1x gel-kleuring oplossing die in stap 5,2 is bereid.
    Opmerking: de gels zijn kwetsbaar en gevoelig voor het breken dus wees voorzichtig bij de overdracht van de gel. Houd het deksel op de kleuring container te allen tijde zo niet besmetten de gel.
  5. Plaats de gel op een orbitale Rotator met een snelheid van 100 rpm voor 30 min bij kamertemperatuur.
    Opmerking: Zorg ervoor dat de gel niet terug op zichzelf vouwen; anders, kan RNA uit de gel verspreiden en zo een verschillend deel van de gel etiketteren.

6. Imaging mango-Tagged ASE in gel

  1. De Imaging buffer zorgvuldig decanteren. Spoel de gel snel met water, waardoor er voldoende vloeistof blijft om de gel iets mobiel in de container te houden.
  2. Breng de gel voorzichtig over op de imager. Overdracht door zorgvuldig het oppakken van de zijkanten van de gel en het plaatsen van het op de imager lade; Als alternatief kan de gel langzaam worden gegoten op de lade. Zorg ervoor dat er geen bubbels onder de gel en dat er geen overtollige vloeistof onder de gel. Een pipet gerold over de gel kan nuttig zijn om overtollige vloeistof te verwijderen.
    Opmerking: gebruik een papieren handdoek om te genieten van de overtollige vloeistof.
  3. Neem een gel beeld, observeren fluorescentie tussen excitatie golflengte 510 Nm en emissie golflengte 535 nm (bijvoorbeeld, groen licht bij 520 nm golflengte fluorescentie-instellingen op de Imager). Zorg ervoor dat de instellingen volledig zijn geoptimaliseerd op het instrument en volg de instructies voor het gebruikte instrument.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korte mango-Tagged ASE werden voorbereid zoals beschreven in het protocol sectie. Ervan uitgaande dat de fluorescentie in de denaturering omstandigheden het meest moeilijk te observeren als gevolg van de aanwezigheid van ureum in de gels, we eerst bestudeerde de weerstand van de mango aptameren aan ureum, die fungeert als een nucleïnezuur denaturaat. We vonden dat mango aptameren aanzienlijk resistent zijn tegen denaturatie tot een ureum concentratie van ongeveer 1 M (Figuur 2a

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een belangrijk voordeel van de mango fluorescerende tag is dat een enkele tag kan worden gebruikt op meerdere manieren. De hoge helderheid en de affiniteit van deze aptameren maken hen nuttig niet alleen voor in cel visualisatie2 maar ook voor in vitro RNA of RNP zuivering4. Daarom, gel Imaging breidt de veelzijdigheid van de mango-tag op een eenvoudige manier. Mango gel Imaging gevoeligheid is iets minder dan die van een noordelijke vlek14 , maar ka...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een octrooi is in afwachting van de mango fluorogenic systeem.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken Razvan Jelliii en Amir Abdolahzadeh voor hun technische bijstand en Lena Dolgosheina voor het proeflezen van het manuscript. De financiering werd verstrekt voor dit project door een Canadese natuurwetenschappen en ingenieurs Onderzoekraad (NSERC) exploitatiesubsidie aan P.J.U.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.8mm Thick Comb 14 Wells for 30 mL PAGE gelsLabRepCo11956042
101-1000 µL  tipsFisher02-707-511
20-200 µL low retention  tipsFisher Scientific02-717-143
Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 19:1)BioreagentsBP1406-1Scherpe toxiciteit
Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 29:1)FisherBP1408-1Scherpe toxiciteit
AgarAnachemia02116-380
Aluminium backed TLC plateSigma-Aldrich1164840001
Amersham Imager 600GE Healthcare Lifesciences29083461
Ammonium PersulfateBiorad161-0700Schadelijk
BL21 cellsNEBC2527H
Boric AcidACPB-2940
Bromophenol Blue sodium saltSigmaB8026-25G
ChloloformACPC3300
DithiothreitolSigma Aldrich AlcoholsD0632-5G
DNase IThermoFisherEN0525
EDTA Disodium SaltACPE-4320
EthanolCommerial P016EAAN
Flat Gel Loading tipsCostarCS004854
Formamide 99%Alfa AesarA11076
Gel apparatus set with spacers and combsLabRepCo41077017
Glass Dish with Plastic lidPyrex1122963Moet groot genoeg zijn om uw gel-stuk te passen
GlycerolAnachemia43567-540
HClAnachemia464140468
ImageQuanTLGE Healthcare Lifesciences29000605
IPTGInvitrogen15529-019
KClACPP-2940
MgCl2Caledron4903-01
MgSO4Sigma-AldrichM3409
NaClACPS-2830
NaOHBDHBDH9292
Orbital RotatorLab-Line
PhenolInvitrogen15513-039
Round Gel Loading tipsCostarCS004853
Sodium Phosphate dibasicCaledron8120-1
Sodium Phosphate monobasicCaledron8180-01
SYBRGoldThermoFisherS11494
T7 RNA PolymeraseABME041
TEMEDSigma-AldrichT7024-50 ml
TO1-3PEG-Biotin FluorophoreABMG955
Tris BaseFisherBP152-500
TryptoneFisherBP1421-500
Tween-20SigmaP9496-100
UreaFisherU15-3
Xylene CyanolSigmaX4126-10G
Yeast ExtractBioshopYEX401.500

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dolgosheina, E. V., et al. RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking. ACS Chemical Biology. , (2014).
  2. Autour, A., et al. Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells. Nature Communications. 9, 656(2018).
  3. Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).
  4. Panchapakesan, S. S., et al. Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango. RNA. , 1592-1599 (2017).
  5. Trachman, R. J. III, et al. Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango. Nature Chemical Biology. 13, 807(2017).
  6. Trachman, R. J., et al. Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness. Biochemistry. 57, 3544-3548 (2018).
  7. Trachman, R., et al. Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity. Nature Chemical Biology. , in review (2018).
  8. Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).
  9. Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W., Jaffrey, S. R. In-gel imaging of RNA processing using Broccoli reveals optimal aptamer expression strategies. Chemistry & Biology. 22, 649-660 (2015).
  10. Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
  11. A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB. , Available from: https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303 (2018).
  12. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), pdb.prot4455 (2006).
  13. Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators. Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).
  14. Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).
  15. Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay. RNA. 15, 724-731 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Polyacrylamidegel imagingTO1 Biotine kleuringanalyse van native gelsanalyse van denaturerende gelsRNA mobiliteitsassayfluorescente RNA detectieprotocol voor gelkleuringRNA kwantificering

Gerelateerde artikelen