Hier presenteren we twee protocollen te transformeren aardappelplanten. De transformatie van het Agrobacterium tumefaciens leidt tot een volledige transgene plant terwijl het Agrobacterium rhizogenes produceert transgene harige wortels in een wild type shoot die zelf gekweekte kunnen. We detecteren dan promotor activiteit door GUS vlekken in het getransformeerde wortels.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Agrobacterium tumefaciens en Agrobacterium rhizogenes-gemedieerde transformatie van aardappel- en de activiteit van de promotor van een gen suberine door GUS Staining
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Agrobacterium sp. is één van de meest gebruikte methoden voor het verkrijgen van transgene planten als het heeft de mogelijkheid om te dragen en de plant genoom te integreren in de eigen T-DNA. Hier presenteren we twee transformatie systemen om genetisch wijzigen aardappelplanten (Solanum tuberosum). In A. tumefaciens transformatie, bladeren zijn besmet, getransformeerde cellen worden geselecteerd en een nieuwe volledige getransformeerde fabriek wordt geregenereerd fytohormonen met 18 weken. In A. rhizogenes transformatie, stengels zijn besmet door het injecteren van de bacteriën met een naald, de nieuwe getransformeerd naar voren gekomen harige wortels worden gedetecteerd met behulp van een rode fluorescerende markering en de wortels niet-getransformeerd worden verwijderd. In 5-6 weken is de resulterende plant een composiet van een wild type shoot met volledig ontwikkelde getransformeerde harige wortels. Het vergroten van de biomassa, kunnen de getransformeerde harige wortels worden weggesneden en zelf doorgegeven. We beide Agrobacterium -gemedieerde transformatie methoden om te verkrijgen van de wortels die de GUS verslaggever-gen uitdrukt gedreven door een promotor van suberine biosynthetic gene toegepast. De GUS kleuring procedure wordt verstrekt en laat de lokalisatie van de cel van de inductie van de promotor. In beide methoden toonde de getransformeerde aardappel wortels vlekken in de suberized endodermis en exodermis, en bovendien, in de A. rhizogenes getransformeerd wortels de activiteit GUS GUS is ook aangetroffen in de opkomst van laterale wortels. Deze resultaten suggereren dat A. rhizogenes een snel alternatief instrument te bestuderen van de genen die worden uitgedrukt in wortels kan zijn.
Inleiding
Afgezien van economisch belang heeft de generatie van transgene planten zijn eigen belang in onderzoek om aan te tonen de ultieme functie van genen en plantenfysiologie en ontwikkeling beter te begrijpen. De meest gebruikte methode voor plant DNA invoeging Agrobacterium is-gemedieerde transformatie. Agrobacterium tumefaciens vermag kroon kurkachtig genereren in de geïnfecteerde weefsel van vele plantensoorten door de inwerking van de tumor-inducerende (Ti) plasmide. Het plasmide bevat een T-DNA-regio met een aantal genen die zullen worden geïntegreerd in het genoom van de plant en het veroorzaken van weefsel dedifferentiation1,2. De uitwisseling van deze genen binnen de T-DNA door de transgenic heeft de generatie van specifieke plant wijzigingen vermijden van fenotypische effecten3toegestaan. Om te vergemakkelijken de transgenic klonen in de T-DNA, heeft de regio van T-DNA is weggesneden in een onafhankelijke plasmide genoemd een binaire plasmide, terwijl de rest van de genen van de Ti-plasmide (de virulentiegenen waarmee de mechanismen voor overdracht en inbrengen van T-DNA) geweest Geplaatst in een plasmide helper. Voor plant biotechnologisch onderzoek, transformatie door A. tumefaciens heeft verschillende voordelen: het heeft geen behoefte aan dure apparaten, is in staat om zowel stabiel en voorbijgaande plant transformatie, als lage aantallen van gen exemplaren zijn geïntegreerd in de chromosoom4. De generatie van stabiele transformants vereist echter voor de meeste planten, maar niet, Arabidopsis plant regeneratie van één of een paar cellen met behulp van exogene fytohormonen, waardoor dit proces moeizaam en tijdrovend. A. rhizogenes is ook kundig voor wijzigen van het genoom van de plant, produceren harige wortels of bijwortels op de sites van de infectie als gevolg van de expressie van genen van de rol (wortel loci) gecodeerd in de root-inducerende (Ri) plasmide5. Hoewel minder dan A. tumefaciensstudeerde, wordt A. rhizogenes ook gebruikt voor het verkrijgen van transgene wortels. In dit geval, bevat de A. rhizogenes het oorspronkelijke T-DNA in het plasmide Ri en een binaire plasmide met een tweede T-DNA die de transgenic. Wanneer de infectie-site in stengels of hypocotyls is, kan een samengestelde plant worden verkregen, met nieuwe harige transgene wortels opkomende van wild type schiet. Als alternatief, harige getransformeerde wortels kunnen groeien autonoom in vitro in media met koolstof bronaanvoeren. Het gebruik van A. rhizogenes in plaats van A. tumefaciens voor de productie van transgene weefsel wint relevantie als de hoofdmap de doel-orgel, is vanwege de regeneratie van de plant is niet vereist en vandaar het is sneller en minder kostbaar. Eerdere studies hebben aangetoond dat deze methode uitgetrokken voor de fenotypische karakterisering van wortel specifieke genen6,7,8,9.
De aardappel (Solanum tuberosum) is de vierde belangrijkste gewas in de wereld volgens de voedsel- en Landbouworganisatie van de Verenigde Naties (FAO), omdat de Knol voeding relevantie voor menselijke consumptie voor het zijn een goede bron van vitaminen en mineralen. Om die reden, aardappel in de schijnwerpers van landbouwkundige biotechnologie is gezet en ook wordt beschouwd als een goede biologische model voor genetische en ontwikkelingsbiologie10,11 bestudeert. Aardappel transformatie in belangrijke mate bijgedragen aan het begrip van de moleculaire mechanismen onderliggende suberized weefsels via de karakterisatie van genen betrokken bij suberine en wax biosynthese12,13,14 ,15,16,17, suberine monomeer vervoer18 en transcriptie verordening19. Het suberine feruloyl transferase gen, FHT, behoort tot deze gekarakteriseerd biosynthetic genen; haar Downregulatie geeft aanleiding tot een sterke aantasting van de bescherming van de periderm, die is gecorreleerd met een sterke afname van de ferulate esters van suberine en wassen in aardappel knollen14. Gelijktijdig, in de wortels en zaden van Arabidopsis, de knock-out van haar vermeende orthologue (ASFT/RWP1) ook blijk gegeven van haar rol in het produceren van alkyl ferulates in suberine20,21. In aardappel toonde de FHT transcriptionele verslaggever lijn en het antilichaam FHT respectievelijk dat de promotor-activiteit en het eiwit zich in de exodermis, de endodermis, de phellogen-derivaten en gewonde weefsels15 bevinden.
In dit werk detailleren wij een protocol met behulp van A. rhizogenes voor de productie van transgene harige wortels die worden bijgehouden in een wild type shoot, het genereren van samengestelde aardappelplanten of weggesneden om te groeien autonoom in vitro. We bieden ook het protocol dat A. tumefaciens gebruikt om volledige transgene aardappelplanten. Als een case-studie, worden A. rhizogenes en A. tumefaciens getransformeerd met de dezelfde binaire vector gebruikt voor het verkrijgen van de wortels met de promotor van de FHT GUS verslaggever genexpressie rijden. De resultaten worden gerapporteerd en vergeleken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het A. rhizogenes -transformatie-protocol werd aangepast en gewijzigd van Horn et al.7 en het genotype getest was S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. Désirée). Het A. tumefaciens transformatie protocol werd aangepast en gewijzigd van Banerjee et al.22 en de genotypen getest werden S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. Désirée) en S. tuberosum ssp. andigena. De belangrijkste stappen van beide procedures worden samengevat in Figuur 1 en figuur 2, respectievelijk.
Opmerking: In alle stappen van de procedure uitvoeren in vitro overdrachten, snel doen, en indien mogelijk, houden de platen of potten gesloten, dus het minimaliseren van plant blootstelling aan de lucht om verwelking en besmetting te voorkomen. Anders vermeld, werden alle incubations van de plant gedaan in kasten onder de voorwaarden van 12u van 24 ° C licht/12 h van 20 ° C van donkere en 67 µmol m-1 s-1. Anders vermeld, alle de bacteriën manipulatie en in vitro plant transfers uitvoeren onder aseptische omstandigheden in een laminaire flow-kap. Alle media recepten voor Agrobacterium en in vitro culturen van de plant zijn opgenomen in Tabel S1.
Let op: Alle genetisch gemodificeerde bacteriën en planten naar de geëigende afval container storten.
1. Agrobacterium culturen gebruikt voor transformatie
Opmerking: De gebruikte voor A. rhizogenes transformatie stam was de C58C1:Pri15837 (vriendelijk geleverd door Dr. Inge Broer) en dat voor de A. tumefaciens was de GV2260 (vriendelijk geleverd door Dr. Salomé Prat). A. rhizogenes werd omgevormd met het binaire vector PK7GWIWG2_II-RedRoot (VIB-Plant Systems Biology aan de Universiteit Gent Vakgroep; http://gateway.psb.ugent.be) met een T-DNA een transformatie marker te voeren om te controleren de harige wortel vorming. Om te vergelijken de getransformeerde wortels gegenereerd door A. rhizogenes en A. tumefaciens, werden beide omgevormd met het binaire vector pKGWFS7 waarin een T-DNA uitvoering van de promotor van de FHT rijden de β-glucoronidase (GUS) verslaggever gen en het kanamycine resistentie gen als een selecteerbaar marker15.
- Kies een kolonie van Agrobacterium en groeien het 's nachts (O/N) in 5 mL YEB voedingsbodem aangevuld met antibiotica (Tabel S1) in een centrifugebuis 50 mL bij 28 ° C met schudden bij 200 omwentelingen per minuut.
- Voor A. tumefaciens transformatie, meet de optische dichtheid, die OD600 moet = 0.6-1.0.
- Als de optische dichtheid hoger is, moet een subcultuur verlagen tot OD600 = 0,3 met verse media en wacht totdat de cultuur OD600 bereikt = 0,6-1.
- Centrifugeer 1 mL Agrobacterium cultuur bij 3000 x g in een bench-top centrifuge gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant door pipetteren en resuspendeer de cellen in 1 mL verse YEB medium zonder antibiotica. Herhaal deze stap om ervoor te zorgen de volledige verwijdering van antibiotica.
- Voor A. tumefaciens transformatie, in de laatste resuspensie toevoegen het juiste YEB volume te verkrijgen van een definitieve optische dichtheid van OD600 = 0,8.
- Cellen op ijs houden bij de voorbereiding van de planten te worden besmet.
2. plantmateriaal voor transformatie
- Maken van een of twee knooppunt houtstekken ofwel met de apicale of de ondersteunende toppen van steriele in vitro aardappelplanten (donor planten); groeien ze in solide 2MS medium in de potten voor 3 tot 4 weken (figuur 1A en figuur 2A).
3. plant transformatie met behulp van A. rhizogenes (Figuur 1)
Opmerking: Deze procedure maakt het mogelijk het verkrijgen van getransformeerde harige wortels. Om te beoordelen de transgenic expressie, is een negatieve controle nodig. Volg de procedure met behulp van een stam van de A. rhizogenes niet-getransformeerde of getransformeerd met de lege vector waarin de transformatie marker gene ter voorbereiding van de negatieve controle.
- Gebruik verse media platen; Als alternatief, de platen kunnen worden bewaard bij 4 ° C met het deksel naar boven, strak verzegelde met doorzichtige folie om uitdroging van de media. Ter voorbereiding van de vierkante media platen, helling hen ~ 15°, vullen met 40 mL van MS, en laten stollen. Dit zal het minimaliseren van het contact van de antenne deel van de plant met het medium.
- Overdracht zeer zorgvuldig een donor plant van het 2MS medium naar een vierkante plaat van 120 x 120 mm.
- Injecteer aan één stengel stengellid 3 μL van de cultuur van de A. rhizogenes met behulp van een chirurgische naald en herhaal het tweemaal per plant in verschillende stengelleden indien mogelijk.
Opmerking: Overwegen elke injectie als een onafhankelijke modificatie (figuur 1B). - Transfer onmiddellijk de hele plant naar een vierkante plaat met solide MS medium aangevuld met 0,1 mM acetosyringone. Geschikt voor 2 planten per plaat.
Opmerking: De 1 M acetosyringone stockoplossing wordt bereid in DMSO en kan worden opgeslagen bij-20 ° C. - Afdichting van de plaat met behulp van chirurgische tape en regelen het verticaal binnen een kabinet groei voor 4 dagen.
- De plant overbrengen in een nieuwe vierkante plaat met MS medium aangevuld met cefotaxime natrium [500 µg Mo/mL] om te doden van A. rhizogenes.
- Na 10-12 dagen, zal harige wortels beginnen te verschijnen (Figuur 1 c,1 D). Vervolgens accijnzen van de eigen wortels van de plant en de plant overbrengen in een nieuwe vierkante plaat met MS medium aangevuld met cefotaxime natrium [500 µg Mo/mL].
Opmerking: Getransformeerde harige wortels kunnen worden gecontroleerd door rode fluorescentie bij het gebruik van een DsRed transformation marker (figuur 3D). - Voor het verkrijgen van een samengestelde plant (figuur 1E), laat de transgene harige wortels groeien voor 3-4 weken in MS medium aangevuld met cefotaxime natrium [500 μg/mL] (wekelijks veranderen het medium).
- Afhankelijk van het doel, de transgene harige wortels en de negatieve controles als volgt worden doorgegeven.
- De hele samengestelde plant overbrengen in een hydrocultuur (Tabel S2) of de bodem medium toe te staan voor enorme ontwikkeling.
- Als u wilt individueel propageren de getransformeerde harige wortels, met behulp van een scalpel snijden de wortels uiting geven aan de rode fluorescerende transformatie markering (DsRed eiwit) wanneer ze zijn 4-8 cm lang (figuur 1E) en ze vervolgens overbrengen naar een petrischaal met Gamborg B5 solide medium aangevuld met 2% sucrose en cefotaxime natrium [500 μg/mL]. Zegel van de platen met plastic laboratorium film en ze groeien in het donker bij 20 ° C.
Opmerking: De wortels kunnen worden gemanipuleerd onder een stereomicroscoop uitgerust om te ontdekken de fluorescentie onder steriele omstandigheden (Zie Tabel van materialen). - Voor de productie van biomassa (dat wil zeggen, gen expressie analyse), snijd een 5 cm lang harige root en het doorgeven in een 150 mL conische kolf met 20 mL Gamborg B5 opgietvloeistof aangevuld met 2% sucrose en cefotaxime natrium [500 µg Mo/mL]. Het kweken voor 6 weken in het donker bij 20 ° C en 60 rpm.
Figuur 1: Tijdlijn te verkrijgen aardappel transgene harige wortels met behulp van A. rhizogenes. De cumulatieve weken te bereiken van elk stadium van het transformatieproces en de daaropvolgende stappen de harige wortels groeien worden weergegeven. Representatieve beelden van verschillende stadia worden afgebeeld: de opening van het proces met behulp van 3 weken oude in vitro planten (A), vervolgens infectie van de planten door het injecteren van A. rhizogenes (B), de vorming van de proliferatieve weefsel (C, pijlen) met opkomende harige wortels (D), en de ontwikkelde harige wortels uiting geven aan de rode fluorescerende transformatie markering DsRed (E). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
4. plant transformatie met behulp van A. tumefaciens (Figuur 2)
Opmerking: Deze procedure maakt het mogelijk het verkrijgen van getransformeerde planten. Om te beoordelen van de transgenic effect, is een negatieve controle nodig. Een optie is de procedure met behulp van een A. tumefaciens getransformeerd met de lege vector te volgen. Wild type planten kunnen als alternatief worden gebruikt.
- Knippen en deze plaatsen een blad van de 3-4-week-oude planten (figuur 2A) in een petrischaal. Met behulp van een scalpel uitsluiten van de bast en snoeien dwarse (1-3 afhankelijk van de grootte van het blad) vanaf het midden van het blad aan de randen te vermijden ze afsnijden (figuur 2B).
- Onmiddellijk plaats van het blad drijvend op 10 mL verse 2MS vloeibare media in een petrischaal met de abaxial kant omhoog en sluit de plaat. Herhaal de stap die plaats bieden aan maximaal 15 vertrekt voor cv. Désirée en 25 verlaat voor ssp. eenndigena (afhankelijk van de grootte van het blad).
- Voeg onmiddellijk 80 µL van A. tumefaciens cultuur bij OD600 = 0,8 in de vloeibare media en meng de plaat handmatig voor 1 min voor het distribueren van de bacteriële oplossing.
- Zorgvuldig verzegelen met het afdichten van de film, dek af met aluminiumfolie en incubeer gedurende 2 dagen in een zaal bij 24 ° C te laten de transformatie zich voordoen.
- Breng de bladeren abaxial kant tot CIM medium (figuur 2B) te houden en hen Incubeer gedurende één week in een kabinet groei.
- Schraap het CIM-medium met de pincet, zodat de bladeren beter kunnen worden ondergebracht op de media.
- Breng de bladeren abaxial kant tot SIM-medium (figuur 2C) houden en broeden ze in een groei kabinet, vernieuwen van het medium om 7-10 dagen, tot de scheuten zijn ongeveer 2 cm hoog.
- Schraap het SIM-medium met de pincet, zodat de bladeren kunnen volledig worden omgeven door de media. Wanneer de naar voren gekomen scheuten het deksel bereikt, werken met hoge petrischalen (100 x 20 mm, hoogte x diameter).
Opmerking: De eelt zullen vormen na 2-3 weken in SIM-medium (figuur 2D) en de scheuten na 6-7 weken (figuur 2E). De scheuten zal worden beschouwd als onafhankelijke modificaties als zij uit eelt gevormd uit onafhankelijke wonden voortkomen.
- Schraap het SIM-medium met de pincet, zodat de bladeren kunnen volledig worden omgeven door de media. Wanneer de naar voren gekomen scheuten het deksel bereikt, werken met hoge petrischalen (100 x 20 mm, hoogte x diameter).
- Knip drie schiet naar voren gekomen uit elke callus (beschouwd als "transformation event" de dezelfde) (figuur 2E), wroeten, overdracht kunnen cultuur kolven met MG medium aangevuld met cefotaxime natrium [250 mg/L] om de subset label met een nummer en Incubeer in een behuizing voor 3-4 weken of totdat de scheuten krachtige (figuur 2F zijn) groei.
Opmerking: Wanneer de scheuten, snijden verwijdert ook de eelt anders de wortel niet maakt.- Herhaal de stap zo vaak als onafhankelijke regels zijn nodig. Tot 5 verschillende transformatie kunnen gebeurtenissen worden geplaatst in een maatkolf van cultuur met een diameter van 8 cm te werken in het volste vertrouwen dat het planten van verschillende gebeurtenissen worden niet gemengd.
- Selecteer het gezondste bedrijf van elke gebeurtenis, knippen het apicale segment van het schieten met 3-4 stengelleden en breng dit in een nieuwe cultuur-kolf met 2MS medium aangevuld met cefotaxime natrium [250 mg/L].
Opmerking: 3-6 weken die de plant efficiënt zal groeien, ontwikkelen van een krachtige shoot en wortels.- Terugbrengen naar de kamer de niet-geselecteerde scheuten totdat de geselecteerde plant volledig heeft ontwikkeld.
- Segmenten van de stengel van de plant met ten minste één stengellid of met de apicale bud knippen en deze overbrengen naar nieuwe 2MS medium aangevuld met cefotaxime [250 mg/L]. Broeden ze in de kast groei.
- Elke 3-4 weken om de regels in vitro getransformeerd worden gerepliceerd.
Opmerking: De cefotaxime natrium is nodig in ten minste drie daaropvolgende overdrachten naar 2MS medium om zeker te zijn om te doden van de A. tumefaciens; Daarna, als A. tumefaciens begroeiing wordt waargenomen, overbrengen in de planten weer 2MS media aangevuld met cefotaxime natrium.
- Elke 3-4 weken om de regels in vitro getransformeerd worden gerepliceerd.
- Karakteriseren het fenotype van de plant, planten voor de bodem voor hun volledige karakterisering of naar overbrengen hydrocultuur cultuur voor inspectie van de wortel.
- De knollen geproduceerd in de bodem te verspreiden en onderhouden van de vastgestelde regels te houden.
Figuur 2: Tijdlijn te verkrijgen van de aardappel omgezet planten met behulp van A. tumefaciens. De cumulatieve weken te bereiken van elk stadium van het transformatieproces en de volgende stappen om de planten groeien worden weergegeven. Representatieve beelden van verschillende stadia worden afgebeeld: de opening van het proces met behulp vertrekt vanuit 3 - weken oude in vitro planten (A), de overdracht van de gewonde en geïnfecteerde verlaat aan de CIM-media (B), de bladeren toen overgedragen aan SIM-media (C), de visualisatie van de eelt rond de gewonde gebieden na 2-3 weken in SIM-media (D), de vorming van de shoot na 9-11 weken in SIM-media (E) en de scheuten na wordt overgedragen aan MG media (F). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
5. hydroponic cultuur
- Voorbereiden van de Hoagland oplossing voor een halve sterkte (0,5 x) (Tabel S2) in een 10 L emmer.
- Dompel een aquarium pomp teneinde homogeniteit en goede zuurstof voorwaarden te behouden.
- Betrekking hebben op de muren van de emmer met aluminiumfolie om te groeien van de wortels in donkere omstandigheden.
- Het vermijden van wortel schade, overbrengen in in vitro planten hydrocultuur cultuur.
Opmerking: Verwijder eventuele resterende in vitro medium uit wortels om te voorkomen dat micro-organisme proliferatie tijdens de incubatie door zorgvuldig schudden van de wortels ondergedompeld in water. - De planten met transparante film als een kas te maken voldoende acclimatisatie en broeden in de groeiende zaal bedekken.
- Maak gaten in de film na 3 dagen en volledig één week na verwijderen.
- Vervangen door verse media elke 10 dagen.
6. GUS histochemische reporter gene assay
Opmerking: In ons geval de GUS analyse werd uitgevoerd met wortels van 2-3 weken in hydrocultuur of in vitrogekweekt.
- Herstellen van de wortels met 90% gekoeld aceton (v/v) en Incubeer het gedurende 20 minuten op ijs.
- Het uitvoeren van twee wasbeurten met gedestilleerd water.
- Toevoegen van verse GUS kleurstofoplossing (tabel 1) en de toepassing van vacuüm (-70 Pa) voor 20 min.
- Incubeer bij 37 ° C in het donker te beschermen van de lichtgevoelige GUS voor 4 uur of totdat een blauwe kleur zichtbaar is.
Opmerking: De aanwezigheid van ferri- en ferrocyanide in GUS oplossing minimaliseren de verspreiding van reactieproducten en bieden meer precieze lokalisatie.
Let op: Gebruik een zuurkast en Draag beschermende kleding bij hantering van de giftige cyanide derivaten in GUS oplossing (kalium Hexacyanoferraat en kaliumferrocyanide). Het substraat GUS en het materiaal ter beschikking moeten veilig worden afgevoerd. - GUS kleurstofoplossing Verwijder en verwerp het in geschikte containers.
- Het uitvoeren van twee wasbeurten met ethanol 70% (v/v).
- Onder een Microscoop helder veld observeren.
Opmerking: GUS kleuring is stabiel voor een paar weken; tijdens de eerste week was het signaal GUS is echter duidelijk en diffundeert minder in aangrenzende cellen. Voor langere opslag, verzegelen van de buis en op te slaan bij 4 ° C.
Tabel 1: GUS kleuring oplossing recept.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Agrobacterium rhizogenes -gemedieerde aardappel transformatie
In dit manuscript, de stapsgewijze procedure instellen om te verkrijgen getransformeerd wortel met A. rhizogenes gepresenteerd. Figuur 1 geeft een overzicht van de procedure, waarin in totaal ongeveer 5-6 weken (na injectie van A. rhizogenes voor het verkrijgen van de volledig o...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In aardappel, het meest voorkomende systeem voor stabiele volledige transgene planten gebruikt de transformatie door Agrobacterium tumefaciens stammen waarvoor organogenese gebruik van exogene fytohormonen. Hoewel de Agrobacterium gebaseerde protocollen heeft het potentieel om het integreren van niet-T-DNA vector reeks25, is deze methode nog het makkelijkst en minder dure beschikbaar voor transformeren aardappelplanten. Tijdens de laatste jaren de belangstelling voor A. rhizo...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door de Ministerio de Innovación y Ciencia (AGL2009-13745, FPI subsidie voor PB), Ministerio de Economía y Competitividad en FEDER financiering (AGL2012-36725, AGL2015 + 67495 + C2 + 1-R) en de Universiteit van Girona (PhD grant SF en subsidie SING11/1). De auteurs zijn Dr. Inge Broer (Instituut voor ruimtelijke ordening, Universiteit van Rostock, Rostock, Duitsland) en Dr. Salomé Prat (Centro Nacional de Biotecnología, Madrid, Spanje) dankbaar voor het verstrekken van de A. rhizogenes en de A. tumefaciens stam, respectievelijk, en Dr. Marçal Soler en Dr. Anna Plasencia voor de hulp en steun ontvangen in het initiëren van de experimenten van de transformatie A. rhizogenes (Universiteit Paul Sabatier van Toulouse III — CNRS, Plant Research Laboratory (LRSV), Castanet-Tolosan, Frankrijk). De auteurs bedanken Sara Gómez (Departament de Biologia, UdG, Girona) voor haar waardevolle hulp in het laboratoriumwerk uitvoeren en het verzorgen van planten, en Ferran Fontdecaba en Carla Sánchez die bijgestaan met een aantal van de experimenten terwijl ze aan het doen waren hun projecten van de laatste graad.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Acetone | Panreac | 1.310.071.21 | |
| Acetosyringone | Acros | 115540050 | |
| Aquarium pomp | Prodac | MP350 | |
| Autoclaaf | Ragpa Strelimatic | ||
| Bacteriologische agar | Lab Conda | 1800 | |
| BAP | Duchefa | B0904 | |
| Rundvlees extract | Lab Conda | 1700 | |
| Plant kweekkast | Nuaire | ||
| Carbenicilline | Duchefa | C0109 | |
| Cefotaxime natrium | Duchefa | C0111 | |
| DMSO | Merck | 1029310161 | |
| Ecotron infors | HT | 29378 | |
| Ethanol | Merck | 1.009.831.011 | |
| Falcon buis | Control tecnica | CFT011500 | |
| Ferricyanaat | Sigma | 101001081 | |
| Ferrocyanaat | Sigma | 100979088 | |
| Kolf (8.06 cm diameter en 11.3 cm hoogte) en plastic deksel voor in vitro kweek | Apiglass | ref16 | |
| GA3 | Sigma | G7645 | |
| Gamborg B5 media | Duchefa | G0210 | |
| Gelrite | Duchefa | G1101 | |
| Glucosa | Sigma | G5767 | |
| Kanamycin | Sigma | K1377 | |
| Leukopor tape | BSN Leukopor | BDF47467 | |
| Lupe | Wild-Heerbrugg | M420 | |
| Magneet schudler | Agimatic | 7000243 | |
| MES hydrate | Sigma | M2933-25G | |
MgSO4 | Panreac | 131404 | |
| Microscoop | Olympus | ||
| Minufugue centrifuge 5415R | Eppendorf | ||
| Murashige en Skoog media | Duchefa | M0254.0050 | |
Na2HPO4 | Panreac | 131679 | |
| NAA | Duchefa | N0903 | |
| NaCl | Panreac | 131659 | |
NaH2PO4 | Sigma | 58282 | |
| NightSea Stereo | SFA Moonting Adapter | ||
| Parafilm | Anorsa | PRFL-001-001 | |
| Peptone | Lab Conda | 1616 | |
| Petri schotels (90 x 14) | Anorsa | 200200 | |
| pH-meter | Crison | ||
| Phytotron |
Referenties
- Gelvin, S. B. Traversing the Cell: Agrobacterium T-DNA's journey to the host genome. Frontiers in Plant Science. 3, 1-11 (2012).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 467-481 (2013).
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiology. 146 (2), 325-332 (2008).
- Ishida, Y., et al. High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacteriumtumefaciens. Nature Biotechnology. 14 (6), 745-750 (1996).
- White, F. F., Taylor, B. H., Huffman, G. A., Gordon, M. P., Nester, E. W. Molecular and genetic analysis of the transferred DNA regions of the root-inducing plasmid of Agrobacterium rhizogenes. Journal of Bacteriology. 164 (1), 33-44 (1985).
- Dinh, P. T. Y., Brown, C. R., Elling, A. A. RNA Interference of effector gene Mc16D10L confers resistance against Meloidogyne chitwoodi in Arabidopsis and Potato. Phytopathology. 104 (10), 1098-1106 (2014).
- Horn, P., et al. Composite potato plants with transgenic roots on non-transgenic shoots: a model system for studying gene silencing in roots. Plant Cell Reports. 33 (12), 1977-1992 (2014).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotechnology Journal. 14 (6), 1381-1393 (2015).
- Ron, M., et al. Hairy root transformation using Agrobacteriumrhizogenes as a tool for exploring cell type-specific gene expression and function using tomato as a model. Plant Physiology. 166 (2), 455-469 (2014).
- Zhang, W., et al. Development and application of a universal and simplified multiplex RT-PCR assay to detect five potato viruses. Journal of General Plant Pathology. 83 (1), 33-45 (2017).
- Almasia, N. I., et al. Successful production of the potato antimicrobial peptide Snakin-1 in baculovirus-infected insect cells and development of specific antibodies. BMC Biotechnology. 17 (1), 1-11 (2017).
- Serra, O., et al. Silencing of StKCS6 in potato periderm leads to reduced chain lengths of suberin and wax compounds and increased peridermal transpiration. Journal of Experimental Botany. 60 (2), 697-707 (2009).
- Serra, O., et al. CYP86A33-Targeted gene silencing in potato tuber alters suberin composition, distorts suberin lamellae, and impairs the periderm's water barrier function. Plant Physiology. 149 (2), 1050-1060 (2008).
- Serra, O., et al. A feruloyl transferase involved in the biosynthesis of suberin and suberin-associated wax is required for maturation and sealing properties of potato periderm. The Plant Journal. 62 (2), 277-290 (2010).
- Boher, P., Serra, O., Soler, M., Molinas, M., Figueras, M. The potato suberin feruloyl transferase FHT which accumulates in the phellogen is induced by wounding and regulated by abscisic and salicylic acids. Journal of Experimental Botany. 64 (11), 3225-3236 (2013).
- Serra, O., Chatterjee, S., Figueras, M., Molinas, M., Stark, R. E. Deconstructing a plant macromolecular assembly: chemical architecture, molecular flexibility, and mechanical performance of natural and engineered potato suberins. Biomacromolecules. 15 (3), 799-811 (2014).
- Vulavala, V. K. R., et al. Identification of genes related to skin development in potato. Plant Molecular Biology. 94 (4-5), 481-494 (2017).
- Landgraf, R., et al. The ABC transporter ABCG1 is required for suberin formation in potato tuber periderm. The Plant Cell. 26 (8), 3403-3415 (2014).
- Verdaguer, R., et al. Silencing of the potato StNAC103 gene enhances the accumulation of suberin polyester and associated wax in tuber skin. Journal of Experimental Botany. 67 (18), 5415-5427 (2016).
- Molina, I., Li-Beisson, Y., Beisson, F., Ohlrogge, J. B., Pollard, M. Identification of an Arabidopsis feruloyl-coenzyme A transferase required for suberin synthesis. Plant Physiology. 151 (3), 1317-1328 (2009).
- Gou, J. Y., Yu, X. -H., Liu, C. J. A hydroxycinnamoyltransferase responsible for synthesizing suberin aromatics in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18855-18860 (2009).
- Banerjee, A. K., Prat, S., Hannapel, D. J. Efficient production of transgenic potato (S. tuberosum L. ssp. andigena) plants via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Plant Science. 170 (4), 732-738 (2006).
- Sunil Kumar, G. B., Ganapathi, T. R., Srinivas, L., Revathi, C. J., Bapat, V. a Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots. Plant Science. 170 (5), 918-925 (2006).
- Schmidt, J. F., Moore, M. D., Pelcher, L. E., Covello, P. S. High efficiency Agrobacteriumrhizogenes-mediated transformation of Saponariavaccaria L. (Caryophyllaceae) using fluorescence selection. Plant Cell Reports. 26 (9), 1547-1554 (2007).
- Petti, C., Wendt, T., Meade, C., Mullins, E. Evidence of genotype dependency within Agrobacteriumtumefaciens in relation to the integration of vector backbone sequence in transgenic Phytophthorainfestans-tolerant potato. Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 301-306 (2009).
- Gaudin, V., Vrain, T., Jouanin, L. Bacterial genes modifying hormonal balances in plants. Plant Physiology and Biochemistry. 32 (1), 11-29 (1994).
- Nemoto, K., et al. Function of the aux and rol genes of the Ri plasmid in plant cell division in vitro. Plant Signaling &. Behavior. 4 (12), 1145-1147 (2009).
- Visser, R. G. F., et al. Expression and inheritance of inserted markers in binary vector carrying Agrobacteriumrhizogenes-transformed potato (Solanumtuberosum L.). Theoretical and Applied Genetics. 78 (5), 705-714 (1989).
- Guillon, S., Trémouillaux-Guiller, J., Pati, P. K., Rideau, M., Gantet, P. Hairy root research: recent scenario and exciting prospects. Current Opinion in Plant Biology. 9 (3), 341-346 (2006).
- Georgiev, M. I., Agostini, E., Ludwig-Müller, J., Xu, J. Genetically transformed roots: from plant disease to biotechnological resource. Trends in Biotechnology. 30 (10), 528-537 (2012).
- Ooms, G., Lenton, J. R. T-DNA genes to study plant development: precocious tuberisation and enhanced cytokinins in A. tumefaciens transformed potato. Plant Molecular Biology. 5 (4), 205-212 (1985).
- de Vries-Uijtewaal, E., et al. Fate of introduced genetic markers in transformed root clones and regenerated plants of monohaploid and diploid potato genotypes. TAG. Theoretical and applied genetics. 78 (2), 185-193 (1989).
- Bird, D., et al. Characterization of Arabidopsis ABCG11/WBC11, an ATP binding cassette (ABC) transporter that is required for cuticular lipid secretion. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 52 (3), 485-498 (2007).
- Luo, B., Xue, X. Y., Hu, W. L., Wang, L. J., Chen, X. Y. An ABC transporter gene of Arabidopsis thaliana, AtWBC11, is involved in cuticle development and prevention of organ fusion. Plant and Cell Physiology. 48 (12), 1780-1802 (2007).
- Panikashvili, D., et al. The Arabidopsis DESPERADO/AtWBC11 transporter is required for cutin and wax secretion. Plant Physiology. 145 (4), 1345-1360 (2007).
- Panikashvili, D., et al. The Arabidopsis DSO/ABCG11 transporter affects cutin metabolism in reproductive organs and suberin in roots. Molecular Plant. 3 (3), 563-575 (2010).
- Bjelica, A., et al. Fatty acid ω-hydroxylases from Solanum tuberosum. Plant Cell Reports. 35 (12), 2435-2448 (2016).
- Ding, Y., et al. Abscisic acid coordinates nod factor and cytokinin signaling during the regulation of nodulation in Medicago truncatula. The Plant Cell. 20 (10), 2681-2695 (2008).
- Isayenkov, S., Mrosk, C., Stenzel, I., Strack, D., Hause, B. Suppression of allene oxide cyclase in hairy roots of Medicagotruncatula reduces jasmonate levels and the degree of mycorrhization with glomus intraradices 1[w]. Plant Physiology. 139 (3), 1401-1410 (2005).
- Dalton, D. A., et al. Physiological roles of glutathione S-Transferases in soybean root Nodules 1[C][W][OA]. Plant Physiology. 150 (1), 521-530 (2009).
- Limpens, E., et al. RNA interference in Agrobacteriumrhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula. Journal of Experimental Botany. 55 (399), 983-992 (2004).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
