Methodenartikel

Meten mondiale cellulaire Matrix Metalloproteinase en metabole activiteit in 3D Hydrogels

7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59123

⸱

22 januari 2019

 , 
1Department of Biomedical Engineering, The Ohio State University, 2The Ohio State University Comprehensive Cancer Center, Arthur G. James Cancer Hospital and Richard J. Solove Research Institute, 3Biomedical Technology Department, King Saud University

In dit artikel

Samenvatting

Hier, een protocol wordt gepresenteerd voor het inkapselen van en het kweken van cellen in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels matiemaatschappij met een fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-afbreekbaar peptide. Cellulaire MMP en metabole activiteit wordt gemeten rechtstreeks vanaf de hydrogel culturen met behulp van een standaard microplate-lezer.

Samenvatting

Driedimensionale (3D) cel cultuur systemen recapituleren vaak nauwer in vivo cellulaire reacties en functies dan traditionele tweedimensionale (2D) cultuur systemen. Meting van de functie van de cel in 3D cultuur is echter vaak meer uitdagend. Veel biologische tests vereisen ophalen van celmateriaal die kan moeilijk in 3D culturen. Een manier om deze uitdaging is het ontwikkelen van nieuwe materialen die meting van de functie van de cel binnen het materiaal in staat te stellen. Hier wordt een methode gepresenteerd voor meting van cellulaire matrix metalloproteinase (MMP) activiteit in 3D hydrogels in een 96-Wells-indeling. In dit systeem, is een poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel matiemaatschappij met een fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellulaire MMP activiteit is evenredig aan de intensiteit van de fluorescentie en kan worden gemeten met een standaard microplate-lezer. Miniaturisatie van deze test naar een 96-Wells-formaat beperkt de tijd die nodig is voor experimentele instellen door gebruik van 50% en reagens met 80% per voorwaarde ten opzichte van de vorige versie van de 24-well van de bepaling. Deze bepaling is ook compatibel met andere metingen van cellulaire functie. Bijvoorbeeld is een bepaling van de metabole activiteit hier gedemonstreerd, die gelijktijdig kunnen worden uitgevoerd met MMP activiteit metingen binnen de dezelfde hydrogel. De bepaling is aangetoond met menselijke melanoom cellen ingekapseld in een heel scala van cel zaaien dichtheden om te bepalen van de dichtheid van de passende inkapseling voor het werkbereik van de bepaling. MMP en metabole activiteit uitlezingen waren na 24u voor de inkapseling van de cel, evenredig naar cel zaaien dichtheid. Terwijl de bepaling wordt hier aangetoond met een fluorogenic afbreekbaar substraat, de assay en methodologie kunnen worden aangepast voor een breed scala aan hydrogel systemen en andere tl sensoren. Een dergelijke bepaling biedt een praktische, efficiënte en toegankelijke 3D kweken platform voor een breed scala van toepassingen.

Inleiding

Driedimensionale (3D) cultuur systemen vaak nauwer recapituleren in vivo cellulaire reacties dan traditionele tweedimensionale (2D) cultuur systemen, zie verschillende uitstekende publicaties1,-2,3 . Echter met behulp van 3D cultuur systemen voor het meten van de functie cel heeft zijn uitdagend als gevolg van de moeilijkheid van cellulaire ophalen en genieten van verdere verwerking. Dit probleem beperkt de meting van vele cellulaire functies in 3D cultuur systemen. Overwinnen van deze problemen, nieuwe technieken waarmee gemakkelijk meting van de functie van de cel binnen 3D omgevingen nodig zijn. Een manier om deze behoefte is de ontwikkeling van materialen die 3D-celkweek ondersteunen niet alleen maar ook het opnemen van sensoren voor het meten van de functie cel. Bijvoorbeeld, hebben verschillende hydrogel systemen fluorogenic protease cleavable wordt zodat de visualisatie van protease-activiteit binnen 3D omgevingen4,,5,,6,7opgenomen. Terwijl deze systemen oorspronkelijk voor microscopische beeldvorming gebruikt werden, kunnen deze systemen ook worden aangepast voor gebruik in een globale matrix metalloproteinase (MMP) activiteit assay met behulp van een standaard afleesapparaat, facile meting van een functie van de cel in een 3D inschakelen milieu8.

MMP, een superfamilie van zink proteasen, spelen belangrijke rol in normale weefsel homeostase en vele ziekten. MMP degraderen remodelleren van extracellulaire matrix (ECM), klieven oppervlakte cel receptoren en cytokines en andere MMP9,10te activeren. MMP spelen belangrijke rol in de fysiologische processen zoals wondgenezing en ziekten zoals artritis, aderverkalking, Alzheimer en kanker (Bekijk beoordelingen in 9,10,11). Bij kanker, zijn hoge MMP expressie niveaus sterk gecorreleerd met kanker uitzaaiingen en slechte prognose12. Bovendien bijdragen MMP aan de progressie van de tumor door kanker cel invasie en migratie, cellulaire processen die inherent 3D verschijnselen13,14te bevorderen. Daarom is er veel interesse in de mogelijkheid voor het meten van MMP activiteit in 3D cultuur in vele contexten, met inbegrip van fundamentele biologische studies en drug screening tests.

PEG hydrogels worden veel gebruikt voor 3D-celkweek als gevolg van hun hoog watergehalte, weerstand tegen eiwit adsorptie en afstembare aard. PEG hydrogels hebben matiemaatschappij met een aantal wordt naar de functie van de directe cel, zoals met ECM mimetische peptiden zoals RGD RLD en IKVAV te vergemakkelijken van cel adhesie, of het direct binden van groeifactoren zoals transformeren groeifactor-β (TGF-β) 15,16. Meer recentelijk hebben PEG hydrogels matiemaatschappij is met sensor peptiden waarmee de meting van de functie cel als goed5,8. Met name het gebruik van een PEG hydrogel systeem met een fluorogenic MMP-afbreekbaar peptide ingeschakeld meten van cellulaire MMP-activiteiten in 3D culturen met een standaard-afleesapparaat matiemaatschappij en vereist geen verdere verwerking. Deze systemen zijn ook compatibel met andere metingen van cellulaire functie, met inbegrip van de metabole activiteit. Hier, wordt een protocol beschreven voor de meting van MMP activiteit van cellen gekweekt in een 3D-PEG hydrogel matiemaatschappij met een fluorogenic MMP-afbreekbaar peptide en resultaten te tonen van de experimenten van de eerste optimalisatie nodig voor gebruik van dit assay. Menselijke melanoom cellen (A375) werden ingekapseld in de hydrogels fluorogenic over een bereik van zaaien dichtheden om te bepalen van de juiste seeding dichtheden die binnen het werkbereik van de bepaling. Na 24u voor de inkapseling, werden MMP en metabole activiteit gemeten met behulp van een standaard microplate-lezer. Vervolgens werd MMP activiteit op metabole activiteit om te bepalen van de seeding dichtheden binnen het lineaire bereik van de bepaling genormaliseerd. Ten slotte, intra-plaat coëfficiënt van de variatie percentages (% CV) werden berekend tussen triplicates om na te denken van de reproduceerbaarheid van de verkregen resultaten. Deze methode kan eenvoudig en snel 3D-celkweek en eenvoudig meten van protease-activiteiten met minimal steekproef verwerking.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Hydrogel onderdelen voorbereiding

  1. Synthetiseren de fluorescerende protease-afbreekbaar peptiden zoals beschreven elders8, met behulp van fluoresce¨ une als de fluorescerende molecuul en dabcyl als de quencher. Los de peptide in DMSO tot een concentratie van 10 mM en winkel in een vriezer-80 ° C in kleine (~ 30 µL) porties om te voorkomen dat herhaalde bevriezen-ontdooien cycli.
    Opmerking: Deze peptiden kunnen ook worden gekocht commercieel. Dit protocol vereist een C-terminal cysteïne in de volgorde van de peptide covalente opneming in de hydrogel polymeer netwerk inschakelen.
  2. Bereiden van 8 arm 40 kDa poly (ethyleenglycol) amine (PEG)-Norborneen (NB) als beschreven17. Controleer of eind groep functionalization van meer dan 90% gebruik van 1H NMR. PEG-NB in steriele fosfaat buffer zoutoplossing (PBS) bij 25% w/v en winkel in-80 ° C diepvriezer in (~ 300 µL) aliquots ontbinden.
    Opmerking: PEG matiemaatschappij met Norborneen kan ook commercieel worden gekocht.
  3. De foto-initiator lithium fenyl 2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) synthetiseren zoals elders beschreven18. Los van de LAP in steriel water tot een concentratie van 68 mM en opslaan in een vriezer-80 ° C in (~ 300 µL) aliquots.
    Opmerking: als alternatief, Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) kan worden gebruikt als de foto-initiator. RONDE- en Irgacure kan commercieel worden gekocht.
  4. Los de MMP-afbreekbaar crosslinker peptide (KCGPQG↓IWGQCK) en de cel adhesie peptide (CRGDS) in steriel water tot een concentratie van 200 mM en 100 mM respectievelijk, en ze opslaan in een vriezer-80 ° C in (~ 300 µL en ~ 30 µL) aliquots, respectievelijk.

2. assay media voorbereiding

  1. Voorbereiding van de warmte-geïnactiveerd, houtskool ontdaan foetale runderserum (FBS) voor de MMP-assay:
    Opmerking: Proteasen in FBS kunnen produceren een hoge achtergrond signaal met de MMP-test; Daarom is het aanbevolen om warmte-inactivering en houtskool strippen de FBS voor de assay-media.
    1. Inactivering van 100 mL FBS door verwarming gedurende 30 minuten bij 55 ° C.
      Opmerking: 100 mL FBS werd hier gebruikt voor aliquoting en opslag bij-20 ° C voor toekomstig gebruik. Kleinere volumes kunnen desgewenst worden gebruikt.
    2. 0,25% w/v van actieve kool en 0,025% w/v van dextran toevoegen aan een kleine hoeveelheid FBS (circa 5 mL) en roer tot een drijfmest wordt gevormd. Dan, voeg de rest van de FBS en roer gedurende 30 minuten bij 55 ° C.
    3. Centrifugeer bij 1,962 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. Breng het supernatant op een ander vaartuig.
    4. Herhaal stap 2.1.2 maar bij 37 ° C, gevolgd door stap 2.1.3. De bovendrijvende vloeistof met behulp van een 0,45 µm filter en vervolgens een 0,2 µm filter te steriliseren.
  2. Bereiden assay media met behulp van de media, aangevuld met 1% houtskool ontdaan FBS, 2 mM L-glutamine, 10 U/mL penicilline, 10 µg/mL streptomycine.
    Opmerking: Media zonder fenol rood wordt aanbevolen omdat er minder storing fluorescentie. Andere toevoegingen aan de assay media zoals insuline, groeifactoren, enz. , zolang de absorptie kan worden toegevoegd en fluorescentie spectrum pieken elkaar niet overlappen met de sensor (494 nm/521 nm).
  3. Verdunde bacteriële collagenase enzym typ ik op 10 en 1000 µg/mL in de assay media als positieve controle.

3. Hydrogel voorbereiding en cel inkapseling

  1. Bereid de oplossing van de voorloper hydrogel.
    1. Toevoegen van de reagentia aan een 1,5 mL tube in de volgende volgorde, vortexing na toevoeging van elk onderdeel: 20 mM 8 arm 40 kDa PEG-NB, 12.75 mM crosslinker MMP-afbreekbaar peptide, 17.8 mM NaOH, 1 mM CRGDS, 2 mM schoot, en 0,25 mM fluorogenic MMP-afbreekbaar peptide.
      Opmerking: Tabel 1 toont hydrogel voorloper oplossing inhoud, voorraad concentraties, werken de concentraties, volume berekeningsformules en van de vereiste hoeveelheden die nodig zijn om 120 µL van hydrogel voorloper oplossing, die volstaat om een experimenteren met 10 hydrogels. Ter verantwoording voor verlies van de oplossing van de hydrogel wegens pipetteren, het totale volume met 20% te stijgen. De commerciële peptiden worden vaak geleverd in een zure waterstofchloride oplossing; Daarom wordt NaOH toegevoegd aan het bereiken van een definitieve pH van 7. pH van de uiteindelijke oplossing moet worden bevestigd door de gebruiker.
    2. Verdeel de hydrogel voorloper oplossing in meerdere 1,5 mL tubes, één tube per voorwaarde wordt getest.
      Opmerking: Verschillende controlevoorwaarden waarin hydrogels zijn bereid zonder toevoeging van cellen worden voorgesteld. Voor een negatieve controle, ter verantwoording voor aspecifieke afbraak van de fluorogenic-sensor, kan een hydrogel voorwaarde worden geïncubeerd met de controle van het voertuig of de experimentele media alleen als er geen behandeling voorwaarden. Voor een positieve controle en kalibratie tussen experimenten, kan hydrogels worden geïncubeerd met een protease bekend te klieven van de fluorogenic-sensor. Bijvoorbeeld, werden twee concentraties van bacteriële collagenase hier gebruikt.
  2. Cellen in hydrogels kapselen.
    1. Maak een suspensie van eencellige afhankelijk van het celtype wordt gebruikt. Bijvoorbeeld, het wassen van een 10 cm schotel van A375 melanoom cellen met 10 mL PBS. Trypsinize cellen met behulp van 0,05% trypsine en Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 voor 3 min. aantal cellen met een hemocytometer om te bepalen van de totale mobiele nummer.
    2. Centrifugeer de cell oplossing bij 314 x g gedurende 3 min, gecombineerd cultuurmedia en resuspendeer de cellen in PBS op ongeveer drie keer de hoogste vereiste seeding dichtheid voor het experiment. Bijvoorbeeld, werd een celsuspensie met een dichtheid van 21 x 106 cellen hier gebruikt om een definitieve ingekapselde dichtheid van 7 x 106 cellen/mL.
    3. De cellen opnieuw om ervoor te zorgen de concentratie van een nauwkeurige cel tellen.
    4. Zwevende cellen en PBS toevoegen aan elke buis van hydrogel voorloper oplossing volgens de vereiste seeding dichtheid (0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 en 7 x 106 cellen/mL in dit voorbeeld). PBS aan voorwaarden met geen cellen in plaats van de zwevende cellen toevoegen.
      Opmerking: Alle voorwaarden moeten hetzelfde uiteindelijke hydrogel voorloper oplossing volume om de verhouding tussen de hydrogel componenten en PBS constant is. Doen niet vortex buizen die cellen in hen hebben, Pipetteer krachtig op en neer zonder bubbels om Meng de voorloper-oplossing maken.
    5. Afzien 10 µL van de hydrogel voorloper oplossing in een steriele zwart ronde bodemplaat van 96-Wells, ervoor te zorgen dat de tip is gecentreerd in het midden van de elk putje terwijl verstrekking.
    6. Polymeriseren hydrogel voorloper oplossing door de plaat naar ultra violet (UV)-licht op 4 mW/cm2 voor 3 min bloot te leggen.
      Opmerking: De UV-lamp (UVL-56 Handheld UV-Lamp, UVP, Upland, CA) produceert UV-A licht met een lange golflengte van UV (365 nm), die heeft geen invloed op cellulaire levensvatbaarheid.
    7. 150 µL van assay media toevoegen aan alle putjes met uitzondering van de voorwaarden van de positieve controle zonder ingekapselde cellen. De positieve controle, toevoegt 150 µL van collagenase enzym oplossing.
    8. Voeg 150 µL van PBS aan de buitenste putjes van de plaat te verminderen van verdamping tijdens de incubatie.

4. MMP en metabole activiteitsmeting

  1. Meten van fluorescentie onmiddellijk na inkapseling een nulmeting van de fluorescentie te zorgen voor uniformiteit in hydrogel polymerisatie. Lees de plaat met behulp van een fluorescentie microplate scan lezer met behulp van een protocol van de ondoorzichtige 96-wells-plaat met een oppervlakte instelling op 494 nm/521 nm (excitatie/emissie). Dit zal de 0 h lezen.
  2. Incubeer plaat in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2 voor 18u.
  3. Metabole activiteit reagens (resazurin) op 1:10 (v/v) voor elk putje toevoegen.
  4. Incubeer plaat in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2 voor een extra 6 h.
    Opmerking: Deze incubatietijd kan variëren afhankelijk van het celtype.
  5. Maatregel fluorescentie bij 24 h na inkapseling. Lees de plaat met behulp van een fluorescentie microplate scan lezer met behulp van een protocol van de ondoorzichtige 96-wells-plaat met een oppervlakte instelling op 494 nm/521 nm (excitatie/emissie) voor MMP activiteit en 560 nm/590 nm (excitatie/emissie) voor metabole activiteit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De huidige bepaling werd aangepast van een eerder ontwikkelde en gekarakteriseerd 3D hydrogel cultuur systeem met een fluorogenic MMP cleavable sensor8matiemaatschappij. De fluorogenic MMP sensor gebruikt hier bestaat uit een peptide-reeks, GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (AdOO) C (↓ geeft de breukzijde) die eerder werd geoptimaliseerd voor decolleté door MMP-14 en MMP-1119. De peptide heet met een fluorescerende molecule (fluoresceïne) en een quen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

3D in vitro celkweek recapituleert veel belangrijke aspecten van het in vivo milieu. Echter, 3D cultuur maakt ook beoordeling functie van de cel en signalering uitdagend, zoveel biologische tests vereisen cellulaire ophalen en grote aantallen cellen. Dus, de ontwikkeling van een cultuur van eenvoudige 3D-systeem waarmee meting van cellulaire functie zonder verdere monster verwerking zou aanzienlijk vergroten het nut van 3D cultuur systemen. De 3D systeem hier beschreven kan worden aangepast voor een scala aan verschillen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs wil erkennen Ohio kanker onderzoek (OCR), OH, Verenigde Staten voor de financiering van deze werkzaamheden, alsmede de Koning Saud Universiteit (KSU), Riyad, KSA voor het sponsoren van de eerste auteur. Moleculair gewicht van de fluorescerende peptide sensor werd gemeten met behulp van de matrix bijgestaan, laser desorptie-ionisatie, time-of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF) met hulp van de Campus chemische Instrument Center massaspectrometrie en Proteomics Faciliteit aan de Ohio State University.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1X Phosphate Buffered SalineFisher Scientific10-010-049
Geactiveerde houtskool Sigma-AldrichC3345
Zwarte ronde bodem 96-well plaatBrand-Tech89093-600
Cel adhesie peptide (CRGDS)GenScript USA Inc.op maat gemaakt
Collagenase enzym type I Life Technologies17100-017
DextraanSigma-AldrichD4876
DMEM Hoge Glucose MediaInvitrogen11965118
Foetaal bovien serum (FBS) Seradigm1500-500
Fluorescentie microplate lezer BioTekCytation 3
HemocytometerHausser Scientific Co.3200
L-glutamineLife Technologies25030-081
MMP-afbreekbaar peptide crosslinker (KCGPQG↓IWGQCK)GenScript USA Inc.op maat gemaakt
NaOHFisher ScientificS318500
Penicilline /streptomycineLife Technologies15140-122
Resazurin (Alamar Blue)Life TechnologiesDAL1100
UV licht UVP95-0006-02

Referenties

  1. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  2. Duval, K., et al. Modeling Physiological Events in 2D vs. 3D Cell Culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  3. Hoarau-Véchot, J., Rafii, A., Touboul, C., Pasquier, J. Halfway between 2D and Animal Models: Are 3D Cultures the Ideal Tool to Study Cancer-Microenvironment Interactions. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).
  4. Lee, S. -H., Miller, J. S., Moon, J. J., West, J. L. Proteolytically Degradable Hydrogels with a Fluorogenic Substrate for Studies of Cellular Proteolytic Activity and Migration. Biotechnology Progress. 21 (6), 1736-1741 (2005).
  5. DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).
  6. Chalasani, A., et al. Live-Cell Imaging of Protease Activity: Assays to Screen Therapeutic Approaches. Methods in Molecular Biology. 1574, Clifton, N.J. 215-225 (2017).
  7. Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing Protease Activity in Living Cells: From Two Dimensions to Four Dimensions. Current Protocols in Cell Biology. 04, Unit-4.20 (2008).
  8. Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
  9. Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).
  10. Tokito, A., Jougasaki, M., Tokito, A., Jougasaki, M. Matrix Metalloproteinases in Non-Neoplastic Disorders. International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1178(2016).
  11. Visse, R., Nagase, H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circulation Research. 92 (8), 827-839 (2003).
  12. Vihinen, P., Kähäri, V. -M. Matrix metalloproteinases in cancer: Prognostic markers and therapeutic targets. International Journal of Cancer. 99 (2), 157-166 (2002).
  13. Yodkeeree, S., Garbisa, S., Limtrakul, P. Tetrahydrocurcumin inhibits HT1080 cell migration and invasion via. downregulation of MMPs and uPA1. APHS Acta Pharmacologica Sinica. 29 (7), 853-860 (2008).
  14. Yodkeeree, S., Chaiwangyen, W., Garbisa, S., Limtrakul, P. Curcumin, demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin differentially inhibit cancer cell invasion through the down-regulation of MMPs and uPA. The Journal of Nutritional Biochemistry. 20 (2), 87-95 (2009).
  15. Mabry, K. M., Schroeder, M. E., Payne, S. Z., Anseth, K. S. Three-Dimensional High-Throughput Cell Encapsulation Platform to Study Changes in Cell-Matrix Interactions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21914-21922 (2016).
  16. Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. Covalently tethered TGF-β1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (12), 4464-4472 (2014).
  17. Sridhar, B. V., et al. Development of a cellularly degradable PEG hydrogel to promote articular cartilage extracellular matrix deposition. Advanced Healthcare Materials. 4 (5), 702-713 (2015).
  18. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
  19. Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1' Positions. Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).
  20. Chai, S. C., Goktug, A. N., Chen, T. Assay Validation in High Throughput Screening - from Concept to Application. Drug Discovery and Development. , (2015).
  21. Iversen, P. W., et al. HTS Assay Validation. Assay Guidance Manual. , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK83783/ (2004).
  22. Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).
  23. Patterson, J., Hubbell, J. A. Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2. Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

3D hydrogelsmatrixmetalloprote nase activiteitassay voor metabolische activiteitfluorescente sensormicroplaatlezerhydrogel precursorsolutiecelinkapselingUV polymerisatiefluorescentie intensiteitA375 melanoomcellen

Gerelateerde artikelen