Isolatie en adoptief overdracht van hoge zout behandeld antigeen-presenteren dendritische cellen

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om te isoleren van dendritische cellen uit lymfkliertest milt door magnetische cel Sorteren en latere adoptief overdracht naïef muizen. Het model van hoge-zout geactiveerde dendritische cellen werd gekozen om de stapsgewijze procedures voor de overdracht van de geadopteerde en stroom cytometry uitleggen.

Samenvatting

Teveel zout inname bijdraagt tot ontsteking en speelt een vitale rol in de ontwikkeling van hypertensie. Eerder vonden we dat antigeen-presenteren dendritische cellen (DC's) verhoogde extracellulaire natrium leidt tot het activeren van de NADPH oxidase en vorming van isolevuglandin (IsoLG) kunnen zin-eiwit adducten. Deze IsoLG-eiwit adducten reageren met zelf-eiwitten en een auto-immune-achtige toestand en hypertensie bevorderen. Wij hebben ontwikkeld en geoptimaliseerd state-of-the-art methoden om te bestuderen van DC functie in hypertensie. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor isolatie, in vitro behandeling met de verhoogde natrium en adoptief overdracht van lymfkliertest milt CD11c⁺ cellen in ontvangende muizen te bestuderen van hun rol in hypertensie.

Inleiding

Overtollige dieet zout is een belangrijke risicofactor voor hoge bloeddruk. ^{1 , 2} the American Heart Association adviseert een maximum van 2.300 milligram (mg), natrium (Na⁺) inname per dag, echter; minder dan 10% van de Amerikaanse bevolking merkt deze aanbeveling. ^{3 , 4} bescheiden verlaging van de⁺ Na inname de bloeddruk verlagen en de jaarlijkse nieuwe gevallen van hart-en vaatziekten en beroerte in de VS met 20% verminderen. ⁵ een groot probleem met overmatige consumptie van zout is dat 50% van de bevolking van hypertensieve zout-gevoeligheid vertoont, gedefinieerd als een stijging van de bloeddruk Na⁺ laden of een gelijkaardige daling van de bloeddruk na na Na^{met 10 mmHg +} beperking en diurese. ⁶ zout-gevoeligheid ook optreedt in 25% van de normotensive personen, en is een onafhankelijke voorspeller van dood en cardiovasculaire gebeurtenissen. ^{7 , 8} zout-sensing mechanismen in hypertensie waarbij de nieren zijn goed bestudeerd; recente studies suggereren echter dat de immuuncellen nb⁺kunnen voelen. ^{9 , 10}

Recent bewijs suggereert dat veranderingen in extra renale nb⁺ behandeling kunnen leiden ophoping van nb⁺ in het interstitium tot en bevordering van ontsteking. ^{11 , 12} ons laboratorium en anderen hebben aangetoond dat de cellen van het aangeboren en adaptieve immuunsysteem aan de verergering van hypertensie bijdragen. ^{9 , 13 , 14 , 15} verschillende hypertensieve stimuli, met inbegrip van angiotensine II, noradrenaline en zout oorzaak macrofagen, monocyten en T-lymfocyten infiltreren de nier- en therapieën te bevorderen nb⁺ retentie, vasoconstrictie, bloeddruk hoogte en einde-orgel schade. ^{9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} in voorafgaande studies, vonden we dat DCs isolevuglandin (IsoLG accumuleren)-eiwit adducten in reactie op verschillende stimuli van hypertensieve met inbegrip van angiotensine II en DOCA-zout hypertensie. ¹⁴ IsoLGs zijn zeer reactieve producten van lipide peroxidatie die snel en covalent te lysines op eiwitten adduct en hun accumulatie wordt geassocieerd met DC activering. ¹⁴ we hebben onlangs vastgesteld dat verhoogde nb⁺ een krachtige stimulans voor IsoLG-eiwit is adduct vorming in RattenUitrustingen DCs.⁹ nb⁺ inwerkingtreding DCs is bemiddeld door amiloride gevoelige vervoerders. NB⁺ wordt vervolgens omgewisseld voor calcium (Ca^{2 +}) via de nb⁺/CA^{2 +} warmtewisselaar. CA^{2 +} wordt geactiveerd proteïne kinase, C (PKC) die activeert de NADPH oxidase leidt tot verhoogde superoxide (O₂^{· -}) en IsoLG-eiwit adduct vorming. ⁹ adoptief overdracht van zout-blootgesteld DCs priemgetallen hypertensie in reactie op een sub pressor dosis van angiotensine II. ⁹

Identificatie van CD11c⁺ DCs uit weefsels is eerder beperkt immunohistochemistry en RT-PCR, en isolatie van DCs is beperkt tot de cel Sorteren op stroom cytometry. Hoewel stroom cytometry cel Sorteren een krachtige methode voor de isolatie van immune cellen is, het is duur, tijdrovend, en leidt tot een lage rendement van levensvatbare cellen. Daarom hebben we een stap voor stap-protocol voor het weefsel spijsvertering, in vitro stimulatie en adoptief overdracht van CD11c geoptimaliseerd⁺ DCs te bestuderen van hypertensie.

Protocol

Vanderbilt University's institutionele Animal Care en gebruik Comité hebben de hierin beschreven procedures goedgekeurd. Muizen zijn gehuisvest en verzorgd volgens de richtsnoeren voor de zorg en het gebruik van proefdieren (National Academies Press. Herziene 2010).

1. isolatie van milt van muizen

1. Bereiden 1640 RPMI: 10% FBS, 0.10 mM HEPES, 1 mM natrium pyruvaat, 50 µM β-mercaptoethanol en 1% penicilline/streptomycine.
2. Euthanaseren van 10 – 12 week-oude C57bl/6 mannelijke muizen bij CO₂ inademing. Spray de borst en zijkanten van de muis met 70% ethanol. Open zorgvuldig op de linker kant, de huid en de peritoneale spouw aan het blootstellen van de milt.
3. Behulp van kleine pincet, de darmen en de lever voorzichtig te verplaatsen naar de linkerkant van de muis, en fijne schaar zachtjes accijnzen de milt.
   Opmerking: Deze stap moet worden gedaan zeer zorgvuldig zoals schade aan de gastro-intestinale tractus kan besmetting veroorzaken.
4. Plaats elke weggesneden milt in gelabelde 15 mL conische buis met 3 mL RPMI 1640 voedingsbodem.

2. productie van eencellige schorsingen van milt

Opmerking: De milt kan in een enkele celsuspensie worden losgekoppeld door een combinatie van mechanische dissociatie plus enzymatische spijsvertering.

1. Bereid de milt spijsvertering-oplossing door het toevoegen van collagenase D (1 mg/mL; 0.29 U/mg gelyofiliseerde vorm) en DNase I (0,1 mg/mL) bij geprepareerd RPMI 1640 medium (zie stap 1.1)
2. Pincet gebruiken om de milt in een C-buis (dissociatie buis) met 3 mL milt spijsvertering oplossing.
3. Het uitvoeren van de mechanische dissociatie met behulp van een semi-automatische homogenizer volgens de instructies van de fabrikant.
   1. Plaats de C-buis op de semi-automatische homogenizer, ervoor te zorgen dat de C-buis strak op de roterende arm wordt geplaatst. Zodra de C-tube wordt geplaatst, drukt u op de startknop op de semi-automatische homogenizer om uit te voeren van de milt 04.01 protocol voor 60 s.
      Opmerking: Mechanische dissociatie kan ook worden uitgevoerd door het plaatsen van een 40 μm-filter op de top van een conische tube van 50 mL en voorzichtig slijpen de milt door de filter. Spoel na het slijpen van de milt, door het filter van 40 µm met 10 mL van RPMI media.
4. Na mechanische dissociatie, loskoppelen van de buis van de homogenizer en het uitvoeren van de enzymatische spijsvertering. Incubeer de monsters gedurende 15 minuten bij 37 ° C onder continue rotatie (20 rpm).
5. Breng de oplossing kwantitatief door pipetteren in een conische buis van 50 mL na de filtratie door een zeef van 40 µm. Wassen van de 40 µm zeef met 10 mL Dulbecco van PBS (dPBS). Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
6. Na centrifugeren, gecombineerd het supernatant volledig en spoelen de pellet door resuspending in 10 mL dPBS. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.

3. isolatie van in CD11c⁺ DCs van milt eencellige schorsing

1. Resuspendeer de pellet cel in 5 mL van de dPBS en het aantal cellen met behulp van een hemocytometer en trypan blue uitsluiting.
2. Pellet de cellen door centrifugeren 300 x ggedurende 10 minuten bij 4 ° C.
3. Gecombineerd volledig het supernatant en resuspendeer de pellet in 400 µL van magnetisch geactiveerde cel-sorteren (MACs) buffer.
4. Voeg 100 µL van CD11c microbeads (Zie Tabel van materialen) per 1 x 10⁸ cellen.
5. Vortex de celsuspensie en incubeer gedurende 10 minuten in de koelkast bij 4 ° C.
6. Voeg 10 mL van MACs buffer te wassen van de cellen. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
7. Gecombineerd volledig het supernatant en resuspendeer in 500 µL van MACs buffer.

4. magnetische scheiding van CD11c⁺ DCs

Opmerking: Magnetische scheiding handmatig wordt gedaan met een magnetische scheidingsteken (Zie Tabel van materialen) uitgerust met LS kolommen. Magnetische scheiding kan ook automatisch worden gedaan met een geautomatiseerde magnetische scheiding. (Zie Tabel van materialen).

1. Plaats de LS-kolom in het magnetisch veld van MACs scheidingsteken en een conische tube van 15 mL onder elke kolom voor het verzamelen van de doorstroming.
2. Spoel de LS-kolom met 3 mL buffer.
3. Plaats de celsuspensie op elke kolom van LS en verzamelen de doorstroming met labelloze cellen.
4. Was de kolom van LS met 3 mL MACs buffer verzamelen de labelloze cellen die passeren. Was de LS kolom 2 vaker.
5. Verwijder de LS-kolom uit de magnetische scheidingsteken. Voeg 5 mL van MACs buffer aan elke kolom en onmiddellijk spoelen de magnetisch gelabelde cellen door de LS-kolom in een schone 15 mL conische buis stevig te storten.
   Opmerking: Het is belangrijk om uit te voeren een dubbele isolatie van CD11c cellen te verkrijgen van een hoge zuiverheid celsuspensie. Daarom herhaal stap 3.1 via 4.5. en referentie van Figuur 4 voor zuiverheidscriteria. Hierdoor verbetert de zuiverheid van CD11c⁺ cellen tot 90-95%.
6. Bepalen CD11c⁺ DC nummer op een hemocytometer met behulp van trypan blauwe uitsluiting. Verdun het monster van de cel bij een verdunning 1:1 in 0,4% trypan blauwe oplossing.
   Opmerking: niet-levensvatbare cellen zal blauw worden gekleurd terwijl levensvatbare cellen onbevlekt zal blijven.
   1. Om dit te doen, voorzichtig een hemocytometer vullen met 10 µL van de cel monsterverdunning en incubeer gedurende 1 minuut.
   2. Cellen in 4 vierkantjes van 1 x 1 mm,² in de kamer die is geladen om te bepalen van het aantal levensvatbare cellen te tellen.

5. in Vitro hoge zout behandelingvan CD11c⁺ DCs

1. DC-kweekmedium bereiden door 10% FBS, 0.1 mM HEPES, 1 mM natrium pyruvaat, 50 µM β-mercaptoethanol en 1% penicilline/streptomycine toe te voegen aan 500 mL 1640 RPMI.
2. 10 x DC hoog zout cel voedingsbodems (400 mM) voor te bereiden door weging van 1,17 g van NaCl en plaatsen het in een tube van de falcon steriele 50 mL. Voeg 50 mL steriele DC cel voedingsbodems (bereid in stap 5.1) aan de falcon tube van 50 mL en vortex totdat de NaCl in oplossing.
3. Onmiddellijk filtermedia de hoge zout DC cultuur met behulp van vacuüm filtratie door een 0,2 micrometer filter in een cel cultuur kap.
4. Centrifugeer elke celsuspensie van de milt bij 300 x g gedurende 10 minuten bij een temperatuur van 4ºC. Resuspendeer de pellet van elke cel in DC voedingsbodems bij een concentratie van 1 x 10⁶ cellen/mL.
5. Pipetteer 900 μL (ongeveer 1 x 10⁶ cellen) van de DC-suspensie in een 24-well platte bodem Falcon plaat. Voeg 100 µL van hoge zout DC voedingsbodems aan elk putje voor een definitieve natrium concentratie van 190 mM. Label van de plaat en plaats in een 37 ° C humified CO₂ incubator voor 48 uur.

6. adoptief overdracht van hoge zout behandeld CD11c⁺ DCs

1. Na in vitro stimulatie voor 48 h humified verwijderen de plaat uit de 37 ° C CO₂ incubator.
2. Pipetteer van de cel voedingsbodems omhoog en naar beneden om resuspendeer de CD11c⁺ DCs. Pipetteer al de CD11c⁺ DC schorsing in een overeenkomt met het label tube 1.6 mL. Herhaal deze stap voor elk individu goed verguld.
3. Centrifugeer elke CD11c⁺ DC schorsing bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. De bovendrijvende substantie gecombineerd. Resuspendeer de pellet DC met 100 µL van steriele dPBS.
4. Loting DC schorsing in een spuit van 1 mL uitgerust met een 27 G ½ inch naald.
5. Plaats de naïeve mannelijke 10 week-oude C57bl/6 muizen onder 2% Isofluraan te bereiken van een stabiele chirurgische vliegtuig. Controleer het niveau van anesthesie met het ontbreken van pedaal reflex. Zodra een stabiele chirurgische vliegtuig is bereikt, langzaam en voorzichtig introduceren de naald in de retro-orbitaal ruimte onder een hoek van ongeveer 30°.
   Opmerking: De schuine kant van de 27 G naald moet wijzen naar beneden, weg van het oog, oogbeschadigingen en/of schade te voorkomen.
6. Langzaam en vloeiend injecteren de CD11c⁺ DC schorsing (ongeveer 1 x 10⁶ cellen). Zodra de injectie voltooid is, verwijder voorzichtig de naald voor de ruimte van de retro-orbitaal wordt bewust om geen schade toebrengen aan het oog.
   Opmerking: Na de injectie, moet er weinig of geen bloeding. Adoptief overdracht van CD11c⁺ DCs kan ook worden uitgevoerd met behulp van een methode I.V. injectie (bijvoorbeeld staart ader). De muizen controle ontvangen CD11c⁺ DCs die werden gekweekt in normale zout media.
7. De muizen verwijderen uit de neus en controleren ze voor ongeveer 30 min tijdens het herstel van de verdoving.

7. bereiding van 14 dagen lage dosis angiotensine II (140 ng/kg/min)

1. Bereid de angiotensine II buffer door 500 μL van 5 M NaCl en 300 μL van azijnzuur toe te voegen. Quantum Satis (QS) tot 30 mL gedeïoniseerd H₂0.
2. Angiotensine II naar 5 mg/mL voorraadoplossing met angiotensine II buffer te ontbinden. Verdun angiotensine II stockoplossing met extra buffer om een eindconcentratie zodat de osmotische minipomp angiotensine II in een snelheid van 140 ng/kg/min volgens het lichaamsgewicht voor elke muis zal leveren.
   Opmerking: Essentiële angiotensine II (mg) = (muis gewicht (g) x 0,2 mg / dag x 14 dagen) / 1.000
   Bereid van angiotensine II (mg) = (essentiële angiotensine II x 260 µL) / pomp tarief (0,25 l/hr)
   Angiotensine II voorraad Volume (l) = bereid angiotensine II / voorraad concentratie (5 mg/mL) x 1,000
   Verdund volume (l) = 270 - angiotensine II voorraad volume
3. Angiotensine II voorraad volume toevoegen aan het verdunde (angiotensine II buffer) op basis van de volumes berekend in stap 7.2.
4. Onder de motorkap van een steriele cel cultuur, open osmotische minipomp.
5. Voeg verdunde angiotensine-II-oplossing en alle lucht uit de spuit en naald. Plaats de meegeleverde naald in de bodem van de osmotische minipomp en langzaam het injecteren van angiotensine II oplossing terwijl langzaam en zorgvuldig keuzemenu de naald uit de blaas.
6. Invoegen de osmotische minipomp hoofd de osmotische blaas volledig, aandacht niet om alle lucht in de blaas.

8. het implanteren van 14 dagen lage dosis angiotensine II osmotische Minipumps

1. Tien dagen na adoptie overdracht van CD11c⁺ DCs, plaats muizen in een zaal Isofluraan starten van anesthesie en verplaats deze muizen naar neus kegel naar 2% Isofluraan voor het bereiken en handhaven van een passende chirurgische vliegtuig continu te ontvangen.
2. Verwijder de vacht langs de dorsale zijde van de nek met clippers aan chirurgische site voorbereiden. Reinig de geschoren gebied met 70% ethanol gevolgd door 7,5% betadine vóór de aanvang van de operatie.
3. Maakt een kleine incisie (ongeveer 1,5 cm) in de huid. Hemostats invoegen in de snede te maken een subcutane zak voor plaatsing van de osmotische minipomp.
4. De minipomp invoegen in de subcutane zak. Sluit de huid gewikkeld met 2-3 chirurgische nietjes en toepassing van een andere toepassing van 7,5% betadine op de wond en nietjes om infectie te voorkomen.
5. De muizen voor 30-60 min toezien tijdens het herstel van anesthesie voordat u terugkeert hen naar hun kooien.
   Opmerking: Muizen moeten worden tot 3-4 dagen na implantatie van de osmotische minipomp gecontroleerd.

9. isolatie van milt van geadresseerden muizen voor Flow cytometrische analyse

1. Na 14 dagen na de lage dosis angiotensine II infusie, isoleren behandeld milt van muizen ontvangen in vitro hoog zout DCs door adoptief overdracht. De precieze stappen hierboven (stappen 1 en 2).

10. oppervlakte kleuring

1. Overdracht van splenocytes die zijn geresuspendeerde in 1 x PBS in een polystyreen FACS buis en centrifuge op 350 x g gedurende 8 minuten bij 4 ° C. Gecombineerd supernatans dat na het centrifugeren. Wassen tweemaal met 1 mL van MACs Buffer en centrifugeren (350 x g, 8 min, 4 ° C).
   1. Verdeel de splenocytes even in verschillende polystyreen FACS buizen op basis van het aantal stroom cytometrische panelen gewenst.
2. Wassen als u wilt uitvoeren de Live/Dead cel levensvatbaarheid kleuring, de cellen met 1 x PBS en centrifuge (350 x g, 8 min, 4 ° C). Resuspendeer in 1 mL 1 x PBS en voeg 1 µL van een levensvatbaarheid van de cellen vlek (Zie materialen tabel). Incubeer gedurende 15 min bij 4 ° C (koelkast of op ijs) bedekt met folie om te beschermen tegen licht.
3. Tijdens de incubatie van de cel levensvatbaarheid vlek, door de cocktail van antilichamen te voorbereiden door het celoppervlak kleuring in een passende hoeveelheid MACS Buffer.
4. Spoel de cellen met MACS Buffer, centrifuge (350 x g, 8 min, 4 ° C), 1 mL en resuspendeer de pellet van elke cel met 100 µL van het antilichaam cocktail. Incubeer beschermd tegen licht gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
   Opmerking: Elke stroom cytometry antilichaam is uniek, en het is zeer nuttig en geadviseerd om te bepalen van de optimale hoeveelheid antilichaam die nodig zijn voor het uitvoeren van een dosis titratiecurve voor elke specifieke antilichaam.
5. Spoel de cellen tweemaal met 1 mL van MACS buffer en resuspendeer de splenocytes in een geschikte hoeveelheid van MACS Buffer voor flow cytometrische analyse.

Resultaten

Figuur 1 geeft een schematische voorstelling van de hierboven beschreven stappen. Geïsoleerde lymfkliertest milt worden gesorteerd voor CD11c⁺ DCs door magnetische cel Sorteren en vergulde in normale zout media (NS; 150 mmol NaCl) of hoog zout media (HS; 190 mmol NaCl) voor 48 h. CD11c⁺ DCs worden vervolgens adoptively overgedragen door retro-orbitaal injectie te naïef ontvangende muizen. Tien dagen later, de muizen zijn geïmplanteerd me...

Discussie

In het huidige protocol, hebben we procedures om te isoleren CD11c geoptimaliseerd⁺ DCs van milt van muizen en adoptively ze vervolgens overbrengen naar naïeve dieren te bestuderen van de rol van DCs in zout-geïnduceerde hypertensie. Dit protocol kan worden aangepast om te isoleren en adoptively overdracht andere immuun cel subsets met inbegrip van macrofagen, monocyten en adaptieve immune cellen, met inbegrip van T en B-lymfocyten. We hebben de milt spijsverteringsproces om voldoende cel overleving en stabili...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
APC/Cy7 anti-mouse CD11c	Biolegend	117324
autoMACS Running Buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
CD11c MicroBeads Ultrapure	Miltenyi Biotec	130-108-338
Collagenase D	Roche	11088866001
DNase I	Roche	10104159001
DPBS zonder calcium en magnesium	Corning	21-031-CV
FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotec	130-092-575
FITC anti-mouse CD45	Biolegend	103108
GentleMACS C tube	Miltenyi Biotec	130-096-334
GentleMACS dissociator apparaat	Miltenyi Biotec	130-093-235	Gebruik protocol: Spleen 04.01
LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit	Invitrogen	L34964
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
QuadroMACs Seperator	Miltenyi Biotec	130-090-976
RPMI 1640 medium	Gibco	11835-030