Isolatie en adoptief overdracht van hoge zout behandeld antigeen-presenteren dendritische cellen

Summary

Hier presenteren we een protocol om te isoleren van dendritische cellen uit lymfkliertest milt door magnetische cel Sorteren en latere adoptief overdracht naïef muizen. Het model van hoge-zout geactiveerde dendritische cellen werd gekozen om de stapsgewijze procedures voor de overdracht van de geadopteerde en stroom cytometry uitleggen.

Abstract

Teveel zout inname bijdraagt tot ontsteking en speelt een vitale rol in de ontwikkeling van hypertensie. Eerder vonden we dat antigeen-presenteren dendritische cellen (DC's) verhoogde extracellulaire natrium leidt tot het activeren van de NADPH oxidase en vorming van isolevuglandin (IsoLG) kunnen zin-eiwit adducten. Deze IsoLG-eiwit adducten reageren met zelf-eiwitten en een auto-immune-achtige toestand en hypertensie bevorderen. Wij hebben ontwikkeld en geoptimaliseerd state-of-the-art methoden om te bestuderen van DC functie in hypertensie. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor isolatie, in vitro behandeling met de verhoogde natrium en adoptief overdracht van lymfkliertest milt CD11c⁺ cellen in ontvangende muizen te bestuderen van hun rol in hypertensie.

Introduction

Overtollige dieet zout is een belangrijke risicofactor voor hoge bloeddruk. ^{1 , 2} the American Heart Association adviseert een maximum van 2.300 milligram (mg), natrium (Na⁺) inname per dag, echter; minder dan 10% van de Amerikaanse bevolking merkt deze aanbeveling. ^{3 , 4} bescheiden verlaging van de⁺ Na inname de bloeddruk verlagen en de jaarlijkse nieuwe gevallen van hart-en vaatziekten en beroerte in de VS met 20% verminderen. ⁵ een groot probleem met overmatige consumptie van zout is dat 50% van de bevol....

Protocol

Vanderbilt University's institutionele Animal Care en gebruik Comité hebben de hierin beschreven procedures goedgekeurd. Muizen zijn gehuisvest en verzorgd volgens de richtsnoeren voor de zorg en het gebruik van proefdieren (National Academies Press. Herziene 2010).

1. isolatie van milt van muizen

1. Bereiden 1640 RPMI: 10% FBS, 0.10 mM HEPES, 1 mM natrium pyruvaat, 50 µM β-mercaptoethanol en 1% penicilline/streptomycine.
2. Euthanaseren van 10 – 12 week-oude C57bl/6 mannelijke muizen bij CO₂ inademing. Spray de borst en zijkanten van de muis met 70% ethanol. Open zorgvuldig op de linker kant, de huid en de peritone....

Results

Figuur 1 geeft een schematische voorstelling van de hierboven beschreven stappen. Geïsoleerde lymfkliertest milt worden gesorteerd voor CD11c⁺ DCs door magnetische cel Sorteren en vergulde in normale zout media (NS; 150 mmol NaCl) of hoog zout media (HS; 190 mmol NaCl) voor 48 h. CD11c⁺ DCs worden vervolgens adoptively overgedragen door retro-orbitaal injectie te naïef ontvangende muizen. Tien dagen later, de muizen zijn geïmplanteerd me.......

Discussion

In het huidige protocol, hebben we procedures om te isoleren CD11c geoptimaliseerd⁺ DCs van milt van muizen en adoptively ze vervolgens overbrengen naar naïeve dieren te bestuderen van de rol van DCs in zout-geïnduceerde hypertensie. Dit protocol kan worden aangepast om te isoleren en adoptively overdracht andere immuun cel subsets met inbegrip van macrofagen, monocyten en adaptieve immune cellen, met inbegrip van T en B-lymfocyten. We hebben de milt spijsverteringsproces om voldoende cel overleving en stabili.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC/Cy7 anti-mouse CD11c	Biolegend	117324
autoMACS Running Buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
CD11c MicroBeads Ultrapure	Miltenyi Biotec	130-108-338
Collagenase D	Roche	11088866001
DNase I	Roche	10104159001
DPBS without calcium and magnesium	Corning	21-031-CV
FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotec	130-092-575
FITC anti-mouse CD45	Biolegend	103108
GentleMACS C tube	Miltenyi Biotec	130-096-334
GentleMACS dissociator device	Miltenyi Biotec	130-093-235	Use protocol: Spleen 04.01
LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit	Invitrogen	L34964
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
QuadroMACs Seperator	Miltenyi Biotec	130-090-976
RPMI 1640 medium	Gibco	11835-030