Hier presenteren we een protocol voor het creëren van een immunocompetente ICR (Institute of Cancer Research) Murine model van infectie van het centrale zenuwstelsel om de ontwikkeling van neuropathie weer te geven. Monitoring van acute virale encefalitische stoornissen door identieke ziekte scores kan worden uitgevoerd voor het tonen van Denguevirus-geïnduceerde neuropathie in vivo.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een Muriene model van dengue virus-geïnduceerde acute virale encefalitis-achtige ziekte
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Dengue virus, een door arthropod overgedragen virus dat door muggen wordt overgebracht, kan de ernstige ziekte die bekend staat als dengue hemorragische koorts, die wordt gekenmerkt door dodelijke complicaties als gevolg van plasma lekkage, ascites, pleurale effusie, ademnood, ernstige bloedingen en orgaanstoornis. Een paar gevallen van DENV infectie aanwezig neurologische manifestaties; echter, studies hebben niet onderzocht DENV-geïnduceerde neuropathogenese verder. In deze studie presenteren we een protocol voor het gebruik van een immunocompetente buitengefokte ICR (Institute of Cancer Research) Mouse voor het onderzoeken van de inductie van infectie van het centrale zenuwstelsel (CZS) met DENV, gevolgd door de progressie van acute virale encefalitis-achtige Ziekte.
Inleiding
DENV, een geleedpotigen virus van de familie Flaviviridae , bevat een positief-Sense RNA-genoom dat drie virale structurele eiwitten codeert (capsid, premembraan en envelop) en zeven virale niet-structurele eiwitten (ns1, NS2A, NS2B, ns3, NS4A, NS4B en NS5). De vier serotypes van DENV (DENV1-4), die jaarlijks ongeveer 390.000.000 mensen infecteren, veroorzaken een wereldwijde last, ook al hebben overheden substantiële inspanningen gericht op muggen vector en Ziektecontrole1. Momenteel zijn beschermende vaccins en therapeutische antivirale geneesmiddelen in ontwikkeling en vereisen verdere validatie op lange termijn2. In de klinische praktijk, hoewel een dengue patiënt met CZS-infectie zeldzaam is, moet het verder worden onderzocht om de diversiteit van dengue-ziekte ontwikkeling3te begrijpen. Verder onderzoek en validering zijn noodzakelijk; met name de World Health Organization (WHO) heeft de betrokkenheid van CZS-stoornissen, zoals cognitieve stoornissen, convulsies, encefalopathie en encefalitis, opgenomen in de classificatie van ernstige dengue3,4. Het bouwen van diermodellen van DENV-infectie is onmisbaar voor het verkennen van de neuro pathogenese van DENV-infectie.
Voor het genereren van CNS infectie door DENV, verschillende studies hebben verschillende routes van DENV infectie uitgevoerd, met inbegrip van (1) intracerebrale inoculatie van C57BL/6 muizen die 4 x 103 plaque-vormende eenheden (Pfu) van niet-aangepaste DENV35kregen, 6, (2) intraperitoneale inoculatie van Balb/c-muizen die 7 x 104 Pfu kregen van in vitro neuroaangepaste DENV47, (3) intracerebrale inoculatie van Zwitserse muizen die 1 x 105 Pfu kregen van in vivo neuroaangepast DENV18en (4) intracerebrale en intraperitoneale co-inoculatie van ICR speen muizen die 1 x 106 Pfu van niet-aangepaste DENV29ontvingen. Volgens de bevindingen van deze onderzoeken5,6,7,8,9, denv infectie in muizen resulteren in virale replicatie in de hersenen, wat leidt tot acute virale encefalitis-achtige syndromen, gedragsveranderingen gepaard met verlamming van de ledematen en orthostatische instabiliteit, CNS neurotoxiciteit en ontsteking, algemene en gelokaliseerde plasma lekkage door de bloed-hersen barrière (BBB), en letaliteit. Alle resultaten van deze onderzoeken5,6,7,8,9 hebben aangetoond dat denv het CZS heeft kunnen infecteren en de inductie van acute virale encefalitis-achtige ziekte na infectie.
Op basis van onze huidige bevindingen9,10,11,12,13,14,15, hebben we een Murine model van denv-infectie gemaakt als een in vivo platform om de therapeutische werkzaamheid van gerichte agenten/factoren tegen virale replicatie te onderzoeken, evenals neurotoxiciteit. Hier rapporteren we het protocol dat wordt gebruikt om een immunocompetente outbred ICR-muis te maken om CZS-infectie te bestuderen en de ontwikkeling van neuropathieën met verschillende ernstcategorieën te monitoren die worden veroorzaakt door denv. De resultaten tonen de significante progressie van encefalitis-achtige ziekte bij met DENV geïnfecteerde muizen in een tijdafhankelijke manier.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Experimentele protocollen van dierlijke studie werden goedgekeurd door de institutionele Dierenzorg en gebruikerscomité van het National Defense Medical Center (IACUC Number: 16-261), volgens de richtlijnen vastgesteld door het ministerie van wetenschap en technologie, Taiwan.
1. infectie procedure
- Bereid niet-aangepaste DENV2 (stam PL046) voorraden9 (oorspronkelijk verkregen uit de centra voor Ziektecontrole in Taiwan, variërend van 2,5 x 107 tot 1 x 109 Pfu/ml).
- Verdun het virus bestand tot 1 x 106 Pfu met Roswell Park Memorial Institute (rpmi) 1640 medium tot een totaal volume van 40 μL.
- Vul één Injectieflacon van 0,3 mL met een naald van 30 G met 10 μL (2,5 x 105 Pfu) van het verdunde virus en vul een andere injectieflacon van 0,3 ml met een 30 g naald met 30 μl (7,5 x 105 Pfu) verdund virus.
-
Houd de 7-daagse ICR speen Mouse vast en voer de volgende stappen uit.
- Voor de intracerebrale injectie, houd de muis in een liggende positie door het indrukken van de oorschelp tussen de wijsvinger en duim, en intracerebrally injecteren 10 μL verdund virus in het Lambda-gebied, het punt op de kruising van het sagittale en lambdoïde hechtdraad 16.
- Na de intracerebrale injectie, houd de muis in een liggende positie met behulp van de wijsvinger en duim en intraperitoneaal Injecteer 30 μL verdund virus zachtjes in de Murine abdomenl.
Opmerking: om kannibalisme te voorkomen, wordt 75% alcohol gebruikt om een tijdelijk verlies van de olfactorische sensatie van de moeder te creëren. Daarnaast wordt voorgesteld om de nesten met de ontlasting en urine van hun moeder te bedekken.
- Leg de speen muizen terug in hun kooien en wacht 5 minuten om hun veiligheids poststimulatie te controleren met de avidity van muizen, inclusief wandelen en moedermelk zuigen.
Opmerking: Meestal tonen muizen een normale activiteit poststimulatie en er lijken geen schadelijke effecten te zijn na de technische uitdaging. Tijdens dit experiment werden de dieren onderhouden door het institutioneel Dierenzorg-en gebruikerscomité van het National Defense Medical Center, Taiwan. - Evalueer de dagelijkse voortgang van de muizen in termen van lichaamsgewicht (door gebruik te maken van een microgram balans), acute virale encefalitis-achtige ziekte (door het scoren van ziekten zoals beschreven in rubriek 2) en overlevingspercentage9,10,11 ,12,13,14,15.
2. ziekte Score
- Controleer de graad van acute virale encefalitis-achtige ziekten. Wijs een Score van 0 toe aan gezonde muizen; 1 aan muizen met lichte ziektesymptomen, met inbegrip van gewichtsverlies, verminderde mobiliteit, en de oriëntatie van de klokkenluider lichaam; 2 aan muizen die een limbisch beslag vertonen; 3 aan muizen de tentoonstelling limbische zwakte, met inbegrip van bewegen met moeilijkheden en voorste ledematen of zwakte van de achterste ledematen; 4 voor verlamming; 5 voor de dood.
Opmerking: Zodra de score 3 bereikt, worden de symptomen van de ziekte geacht snel te evolueren. - Plot de scoring van de ziekte, volgens stap 2,1, voor elke dag als een curve-gebaseerd cijfer met behulp van de gemiddelde ± SD van de dagelijkse testscores in elke groep.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Ernstige dengue-geassocieerde neurologische complicaties zijn gemeld bij patiënten voor dengue-pathogenese4. Hoewel deze gevallen zeldzaam zijn in de kliniek, kan het creëren van een immunocompetente muriene model van DENV-infectie niet alleen worden gebruikt voor het bestuderen van immunopathogenese, maar ook voor het verkennen van de CZS-infectie, neuro ontsteking, neurotoxiciteit en acute virale encefalitis-achtige ziekte. In deze studie werden volgens onze huid...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Denv-infectie is aangetroffen in het CZS van ernstige dengue-patiënten3,17, wat suggereert dat de mogelijkheid van de manifestatie van acute virale encefalitis optrad tijdens dengue-pathogenese. Hier rapporteren we een in vivo muriene model van DENV-infectie voor het bestuderen van de betrokkenheid van CZS dysfunctie in ernstige dengue, vooral met een focus op DENV-geïnduceerde acute virale encefalitis-achtige ziekten. In vergelijking met de vorige modellen, in h...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Deze studie werd gesteund door subsidies van het ministerie van wetenschap en technologie (MOST107-2321-B-038-001) en de intramurale financiering 106TMU-CIT-01-2, Taipei, Taiwan.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) | Gibco | 11875-085 | Diluter virus |
| 0.3 mL Insulin Syringe | BD Ultra-FineII | 328838 | Intracerebral en intraperitoneal injectie |
| Microbalance | METTLER TOLEDO's LabX | AL104 | Weeg muis |
| Non-adapted DENV2 (strain PL046) | The Centers for Disease Control of Taiwan | - | Muis infecteren |
| Institute of Cancer Research (ICR) zuigende muis | BioLASCO Taiwan Co., Ltd | - | Ons muismodel |
Referenties
- Guzman, M. G., Gubler, D. J., Izquierdo, A., Martinez, E., Halstead, S. B. Dengue infection. Nature Reviews Disease Primers. 2, 16055(2016).
- Katzelnick, L. C., Coloma, J., Harris, E. Dengue: knowledge gaps, unmet needs, and research priorities. Lancet Infectious Diseases. 17 (3), e88-e100 (2017).
- Carod-Artal, F. J., Wichmann, O., Farrar, J., Gascon, J. Neurological complications of dengue virus infection. Lancet Neurology. 12 (9), 906-919 (2013).
- Geneva: World Health Organization. Dengue: Guidelines for Diagnosis, Treatment, Prevention and Control: New Edition. , WHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee (2009).
- Amaral, D. C., et al. Intracerebral infection with dengue-3 virus induces meningoencephalitis and behavioral changes that precede lethality in mice. Journal of Neuroinflammation. 8, 23(2011).
- de Miranda, A. S., et al. Dengue-3 encephalitis promotes anxiety-like behavior in mice. Behavioural Brain Research. 230 (1), 237-242 (2012).
- Velandia-Romero, M. L., Acosta-Losada, O., Castellanos, J. E. In vivo infection by a neuroinvasive neurovirulent dengue virus. Journal of Neurovirology. 18 (5), 374-387 (2012).
- Despres, P., Frenkiel, M. P., Ceccaldi, P. E., Duarte Dos Santos, C., Deubel, V. Apoptosis in the mouse central nervous system in response to infection with mouse-neurovirulent dengue viruses. Journal of Virology. 72 (1), 823-829 (1998).
- Tsai, T. T., et al. Microglia retard dengue virus-induced acute viral encephalitis. Scientific Reports. 6, 27670(2016).
- Cheng, Y. L., et al. Activation of Nrf2 by the dengue virus causes an increase in CLEC5A, which enhances TNF-alpha production by mononuclear phagocytes. Scientific Reports. 6, 32000(2016).
- Ho, M. R., et al. Blockade of dengue virus infection and viral cytotoxicity in neuronal cells in vitro and in vivo by targeting endocytic pathways. Scientific Reports. 7 (1), 6910(2017).
- Jhan, M. K., et al. Anti-TNF-alpha restricts dengue virus-induced neuropathy. Journal of Leukocyte Biology. 104 (5), 961-968 (2018).
- Kao, J. C., et al. The antiparasitic drug niclosamide inhibits dengue virus infection by interfering with endosomal acidification independent of mTOR. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (8), e0006715(2018).
- Tsai, T. T., Chen, C. L., Tsai, C. C., Lin, C. F. Targeting heat shock factor 1 as an antiviral strategy against dengue virus replication in vitro and in vivo. Antiviral Research. 145, 44-53 (2017).
- Jhan, M. K., et al. Dengue virus infection increases microglial cell migration. Scientific Reports. 7 (1), 91(2017).
- Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Intraparenchymal Stereotaxic Delivery of rAAV and Special Considerations in Vector Handling. Methods in Molecular Biology. , 199-215 (2016).
- Fong, C. Y., et al. Mild encephalitis/encephalopathy with reversible splenial lesion (MERS) due to dengue virus. Journal of Clinical Neuroscience. 36, 73-75 (2017).
- Sarathy, V. V., et al. A lethal murine infection model for dengue virus 3 in AG129 mice deficient in type I and II interferon receptors leads to systemic disease. Journal of Virology. 89 (2), 1254-1266 (2015).
- Schul, W., Liu, W., Xu, H. Y., Flamand, M., Vasudevan, S. G. A dengue fever viremia model in mice shows reduction in viral replication and suppression of the inflammatory response after treatment with antiviral drugs. The Journal of Infectious Diseases. 195 (5), 665-674 (2007).
- Tyler, K. L. Acute Viral Encephalitis. New England Journal of Medicine. 379 (6), 557-566 (2018).
- Yauch, L. E., Shresta, S. Mouse models of dengue virus infection and disease. Antiviral Research. 80 (2), 87-93 (2008).
- Assir, M. Z., Jawa, A., Ahmed, H. I. Expanded dengue syndrome: subacute thyroiditis and intracerebral hemorrhage. BMC Infectious Diseases. 12, 240(2012).
- Kumar, R., Prakash, O., Sharma, B. S. Intracranial hemorrhage in dengue fever: management and outcome: a series of 5 cases and review of literature. Surgical Neurology. 72 (4), 429-433 (2009).
- Simanjuntak, Y., Liang, J. J., Lee, Y. L., Lin, Y. L. Repurposing of prochlorperazine for use against dengue virus infection. Journal of Infectious Diseases. 211 (3), 394-404 (2015).
- Rocha, B. A. M., et al. Dengue-specific serotype related to clinical severity during the 2012/2013 epidemic in centre of Brazil. Infectious Disease Poverty. 6 (1), 116(2017).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
