Siderofoor High-throughput Screening van milieu monsters: plantaardige weefsels, Bulk bodems en rhizosfeer bodems

Samenvatting

Presenteren we een protocol voor snelle screening van milieu monsters voor siderofoor potentieel bijdragen aan micronutriënt biologische beschikbaarheid en omzet in terrestrische systemen.

Samenvatting

Siderophores (laag-moleculair gewicht metaal verbindingen chelaat) zijn belangrijk in verschillende ecologische fenomeen variërend van ijzer (Fe) biogeochemische fietsen in de bodem, pathogen competitie, plant groeibevorderaars en cross-Koninkrijk signalering. Bovendien zijn siderophores ook commerciële belangstelling voor bioleaching en bioweathering voor metalen mineralen en ertsen. Een robuuste, snelle en kosteneffectieve middelen van kwantitatief beoordeling siderofoor productie in complexe monsters is de sleutel tot het identificeren van belangrijke aspecten van de ecologische gevolgen van siderofoor activiteit, waaronder, roman siderofoor microben produceren. De methode die hier gepresenteerd is ontwikkeld om de siderofoor activiteiten beoordelen van in-tact microbiome Gemeenschappen, in milieu monsters, zoals grond of plantaardige weefsels. De monsters werden gehomogeniseerd en verdund in een gemodificeerde M9 medium (zonder Fe) en verrijking culturen werden geïncubeerd voor 3 dagen. Siderofoor productie in monsters op 24, 48 en 72 uur (h) met behulp van een roman 96-Wells-microplate CAS (Chrome azurol Boxmark) evalueerden-Fe agar assay, een aanpassing van de traditioneel vervelend en tijdrovend colorimetrische methode voor de beoordeling van siderofoor activiteit, uitgevoerd op afzonderlijke gecultiveerde microbiële isolaten. Wij onze methode aan 4 verschillende genotypen/lijnen van tarwe (Triticum aestivum L.), met inbegrip van Lewjain, Madsen, en PI561725 en PI561727 vaak geteeld in de binnenvaart Pacific Northwest toegepast. Siderofoor productie werd duidelijk beïnvloed door het genotype van tarwe, en met de specifieke soorten plantaardige weefsels waargenomen. We met succes onze methode gebruikt om snel scherm voor de invloed van plant genotype op siderofoor productie, een belangrijke functie in terrestrische en aquatische ecosystemen. Wij geproduceerd vele technische replicaten, opbrengst zeer betrouwbare statistische verschillen in de bodem en in plantaardige weefsels. Nog belangrijker is, blijkt de resultaten dat de voorgestelde methode kan worden gebruikt om snel siderofoor productie in complexe monsters te onderzoeken met een hoge mate van betrouwbaarheid, op een wijze waarmee gemeenschappen te behouden voor latere werk om taxa en functionele genen te identificeren.

Inleiding

Siderophores zijn belangrijke biomoleculen betrokken voornamelijk in ijzer-chelatie voor biologische beschikbaarheid, maar met een breed scala van aanvullende doeleinden in terrestrische en aquatische ecosystemen variërend van microbiële quorum sensing, signalering naar microbiële plant-hosts, plant groeibevorderaars, samenwerking en concurrentie binnen de complexe microbiële gemeenschappen^1,2. Siderophores kan worden in grote lijnen ingedeeld volgens hun actieve sites en structurele kenmerken, maken van de vier basistypen: carboxylaat, hydroxamate, catecholate, en gemengde typen^3,4. Vele micro-organismen kunnen afscheiden van meer dan één type van siderofoor⁵ en in complexe Gemeenschappen, een overgrote meerderheid van de organismen biosynthesize de membraan receptoren zodat de opname van een nog breder scala aan siderophores^{1, 6}. Recent werk geeft aan dat siderophores met name van belang op communautair niveau, en zelfs in het Koninkrijk van de onderlinge communicatie en biogeochemische overdrachten^{7,8,9,10 zijn ,11}.

Chroom azurol Boxmark (CAS) is gebruikt voor meer dan 30 jaar als een chelaatvormer te binden ijzer (Fe) op een zodanige wijze dat toevoeging van liganden (bijvoorbeeld siderophores) leiden dissociatie van het CAS-Fe-complex tot kan, het creëren van een herkenbaar kleurverandering in het medium ¹². Wanneer de CAS is gebonden met Fe, de kleurstof wordt weergegeven als een Koninklijk blauwe kleur, en als de CAS-Fe-complex distantieert, het medium verandert van kleur afhankelijk van de soort ligand gebruikt voor het opruimen van de Fe-¹³. Het medium van het oorspronkelijke, op vloeistof gebaseerde opgericht door Schwyn en Neilands in 1987, is gewijzigd in veel opzichten voor wijzigen van microbiële doelstellingen¹⁴, groei gewoonten en beperkingen¹⁵, evenals een verscheidenheid van metalen naast Fe, met inbegrip van aluminium, mangaan, kobalt, cadmium, nikkel, lithium, zink¹⁶, koperen¹⁷en zelfs arseen¹⁸.

Veel menselijke pathogenen, zo goed als plant groei bevorderen van micro-organismen (PGPM) zijn geïdentificeerd als siderofoor-producerende organismen^3,19,20, en belangrijke rhizosfeer en endophytic PGPM vaak testen positief voor siderofoor-productie⁴. De traditionele Fe-gebaseerde vloeibare methode is aangepast aan de microtiterplaat testen van isolaten in teelt voor siderofoor productie²¹. Echter deze technieken niet om te erkennen het belang van de microbiële Gemeenschap als geheel (de microbiome), in samenwerking en mogelijke regulering van de productie van siderofoor in bodem en plant systemen²². Om die reden hebben we een high-throughput Gemeenschapsniveau beoordeling van de siderofoor productie van een bepaald milieucompartiment, gebaseerd op de traditionele CAS assay, maar met replicatie, gebruiksgemak meting, betrouwbaarheid en herhaalbaarheid in een microplate assay.

In deze studie is een kosteneffectieve, hoge-doorvoer CAS-Fe-assay voor het opsporen van siderofoor productie bedoeld om te beoordelen van de verrijking van de siderofoor productie van complexe monsters (dat wil zeggen, bodem en plant weefsel homogenates). Bulk, losjes-gebonden en strak gebonden rhizosfeer bodem (in termen van hoe de bodem was gebonden aan de wortel) samen met graan, schieten en wortel weefsels uit vier verschillende tarwe (Triticum aestivum L.) genotypen werden verkregen: Madsen, Lewjain, PI561725, en PI561727. Het was veronderstelde dat fundamentele verschillen in de genotypen van tarwe kunnen leiden tot verschillen in werving en selectie van siderofoor productie van gemeenschappen. Van bijzonder belang is het verschil tussen microbiële gemeenschappen die zijn gekoppeld aan de isogene lijn van PI561725, die is aluminium tolerant omdat het bezit ALMT1 (aluminium-geactiveerde Malate Transporter 1), in vergelijking met de aluminium gevoelige PI561727 isogene lijn, die beschikt over een niet-aluminium responsieve vorm van het gen, almt1^23,24,25,26. Het hoofddoel van de studie was een eenvoudige, snelle methode van het kwantitatief beoordeling van productie van het siderofoor in siderofoor verrijking culturen van complexe monster typen met behoud van de culturen voor toekomstige werkzaamheden te ontwikkelen.

Protocol

Opmerking: Locatie van veld-Site: Washington State University, Plant Pathology boerderij (46 ° 46' 38,0" N 117 ° 04' 57,4 ' W). Zaden werden ingezaaid met behulp van een mechanische planter op 19 oktober 2017. Het genotype van elke tarwe werd geplant in headrows, ongeveer 1 meter uit elkaar overlappende van wortelsysteem te vermijden. Planten- en grond monsters werden verzameld op 9 augustus 2018, wanneer de planten klaar voor oogst waren. Monsters werden verzameld uit drie replicaat-organismen van vier tarwe genotypen: PI561727, Lewjain, PI561725, Madsen.

1. bereiding van gemodificeerde M9 medium

1. Gebruik nb₂PO₄∙7H₂O (12,8 g/200 mL), KH₂PO₄ (0,3 g/200 mL), NaCl (0,5 g/200 mL) en NH₄Cl (1 g/20 mL) reagentia te bereiden de M9 zoutoplossing.
2. 18 g MgSO₄∙7H,₂O in 100 mL dubbele gedeïoniseerd water (ddH₂van O) gebruiken om te bereiden 0,75 M MgSO₄∙7H₂O.
3. 1 M CaCl₂∙2H,₂O maken door toevoeging van 14,7 g CaCl₂∙2H,₂O met 100 mL ddH₂O.
4. Bereid de bufferoplossing door het oplossen van 6.048 g van buizen in 156 mL van ddH₂O met roeren. Breng de pH op 6,8 met 5 M NaOH.
5. 20% glucose (dextrose monohydraat) voor te bereiden door het oplossen van 20 g glucose in 100 mL ddH₂O.
6. Het bereiden van oplossingen en individueel autoclaaf alle maar de glucose. Filter steriliseren de glucose-oplossing voor toevoeging aan de M9 media na autoclaaf (0,22 µm).
7. Bereid het gemodificeerde M9 medium door het mengen van 156 mL bufferoplossing PIJPEN, 40 mL M9 zouten oplossing, 20 μL van CaCl₂·2H₂O oplossing, 266 μL van MgSO₄·7H₂O en 4 mL 20% glucose oplossingen samen in het biosafety kabinet, met behulp van steriele techniek.
8. Voor behoud van de gemodificeerde M9, verzegelen van de container, dek af met aluminiumfolie te beschermen tegen UV, en plaats bij 4 ° C.

2. voorbereiding van CAS-Fe-Agar medium

1. Zuur wassen alle glaswerk in 100 mM HCl/100 mM HNO₃ voor een minimum van 2 uur voorafgaand aan gebruik in de CAS-bepaling.
2. Bereiden van een aluminium pan bakken gevuld met laboratorium rang zand en bedek het met aluminiumfolie. Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 30 min en braaklegging.
3. HDTMA (hexadecyltrimethylammonium bromide) voor te bereiden door toevoeging van 0.0365 g aan 20 mL ddH₂O en plaats van de oplossing bij 37 ° C ter bevordering van solubilisatie.
4. Bereiden van 10 mM HCl en genereren van 1 mM FeCl₃·6H₂O met behulp van 10 mM HCl als het oplosmiddel. Voeg 0.0302 g van Certificeringsinstanties tot 25 mL van ddH₂O terwijl zachtjes roeren met een steriele magnetische roer bar. Voeg vervolgens 5 mL van 1 mM FeCl₃·6H₂O (in 10 mM HCl) om de 25 mL van de oplossing van de CAS terwijl het voortdurend zachtjes roeren (de oplossing verandert in donker roodachtig zwarte kleur).
5. Voeg langzaam de 20 mL van de oplossing van de HDTMA terwijl het zachtjes roeren, in de oplossing van de Fe-CAS (dit resulteert in een donker blauwe oplossing).
6. Bereid de bufferoplossing door ontbinding 15.12 g van buizen in 375 mL van ddH₂O, met zachte roeren. Breng de pH op 6,8 met 5 M NaOH. Voeg om het volume tot 450 mL water toe. Voeg toe 5 g agarose aan de oplossing. Autoclaaf de leidingen buffer oplossing en de CAS-Fe oplossing bij 121 ° C gedurende 30 minuten.
7. Voeg voorzichtig het geheel van de CAS-Fe oplossing om het geheel van de Buffer van de buizen in de bioveiligheid kabinet na elk van hen is een gesteriliseerde met autoclaaf.
8. Plaats de gemengde oplossing in een waterbad van 50 ° C.
   Opmerking: Vers bereiden alle reagentia in het medium van de CAS-Fe-Agar vóór elke assay, als op lange termijn opslag bij 50 ° C resulteert in een neerslag van de CAS-Fe complex en koeling resultaten in gestolde medium.
9. Plaats een steriele reagens boot in de steriel zand in het biosafety kabinet en warmte tot 50 ° C. De CAS-Fe-Agar overbrengen in de boot, dan snel aliquoot 100 µL aan elk putje in een duidelijke, flat-bottom, steriele 96-Wells-microplate.

3. Pyoverdine/EDTA standaard voorbereiding

1. Pyoverdine voorbereiding
   1. Bereid 800 μM pyoverdine (mengsel van barnsteenzuur, 2-hydroxy-glutaramide en succinaminde vormen van pyoverdine – Zie Tabel of Materials), eerder bereid gemodificeerde M9 medium.
   2. Verdun deze oplossing in 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 en 6,25 μM oplossingen.
2. EDTA standaard voorbereiding
   1. Voeg Dinatrium ethyleendiamminetetra zuur 0.594 g (EDTA: C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈.2H₂O), 500 ml eerder bereid gemodificeerde M9 middellange tot 3200 μM EDTA standaard voor te bereiden.
   2. Verdun deze oplossing in 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 en 6,25 μM oplossingen.
3. Standaard curve generatie
   1. Voeg 100 μl van elke concentratie van pyoverdine en EDTA te scheiden wells van een 96-Wells-microplate met 100 μl van CAS-Fe Agar medium. Maken van dubbele technische replicaties voor elke concentratie. Ook het toevoegen van lege putjes met alleen M9 (geen EDTA of pyoverdine).
   2. Met behulp van een microplate reader, meet extinctie (op 420 nm en 665 nm) na 1, 6 en 24 uur incubatie bij 22 ° C en gebruik extinctie metingen voor het genereren van standaard curven.
      Opmerking: Voor 420 nm metingen, aftrekken extinctie van vormstukken uit de extinctie van pyoverdine of EDTA bevatten wells. Voor 665 nm, aftrekken van de extinctie van pyoverdine of EDTA met putten van de extinctie van de blanco. Dan is log₁₀(µM pyoverdine of EDTA) teruggelopen tegen de extinctie metingen. Voor het gemak van het interpreteren van de resultaten van de steekproef, extinctie gebruiken als de x-as en meld u₁₀(µM pyoverdine of EDTA) als de y-as.

4. verzameling van milieu monsters: bodem en plant weefsels

1. Wassen van bemonstering apparatuur (schoppen en schaar) met 0,22 µm gefilterd ddH₂O gevolgd door 70% ethanol, en veeg met papieren handdoeken vóór de bemonstering en tussen monsters te handhaven van de steriele techniek en verminderen kruisbesmetting.
2. Accijnzen van de plantaardige weefsels (korrels en scheuten) van planten in het veld, en plaats ze in een gelabelde kunststof opbergtas, verlaten genoeg schieten stoppels voor het gemak in het ontwortelen de gewenste monsters voor bodem- en wortel.
3. Excavata een kleine wortel bal ongeveer 15 cm diep en 23 cm breed en plaats deze in een aparte, gelabelde plastic zak voor de bereiding van de monsters in de testomgeving. Deze stap is vergelijkbaar met de methoden van McPherson et al.²⁷.
4. Plaats alle monsters (granen, scheuten, bulk bodem en wortel ballen in aparte zakken) rechtstreeks op ijs en droog bij 4 ° C tot monsters worden verwerkt voor de siderofoor productie assay.
5. Aparte wortel verbonden bodemmonsters in bulk, losjes gebonden rhizosfeer bodem en strak gebonden rhizosfeer bodem.
   1. Neem de wortel ballen uit de zakken. Zachtjes afschudden bodem van de bal van de wortel. Afgeschud bodem, samen met de bodem links in de tas bestaat uit de bodem "bulk".
   2. Gebruik een rubber hamer om verdere bodem van de bal van de wortel. Dit is de bodem losjes gebonden rhizosfeer.
   3. Strak-gebonden rhizosfeer bodem genereren door het nemen van wortels met het strak-gebonden monster en brengen hen in een centrifugebuis. Voeg 30 mL ddH₂O en vortex voor 2-3 minuten. Wortels om de strak-gebonden rhizosfeer bodem drijfmest verdunning te verwijderen.

5. bereiding van siderofoor verrijking culturen en CAS-Fe siderofoor productie kwantitatieve analyse

Opmerking: Alle glaswerk moet zuur gewassen voorafgaand aan het begin van de tests.

1. Bereiding van de monsters van de bodem (voor elk van de drie bodemtypes monster)
   1. Elk bodemmonster binnen de bemonsteringszak, Meng door mixen en draaien van de bodem zoveel mogelijk zonder het openen van de zak.
      Opmerking: Dit vermindert het aantal natuurlijke bodem ruimtelijke variabiliteit en uitgelijnd met normale bodem bemonsteringsprocedures. Andere methoden kunnen worden gebruikt om het homogeniseren van milieu monsters, zo nodig, en afhankelijk van de proefopzet.
   2. Nadat elk monster geweest grondig gemengde, aliquoot en schorten 2.0 g van de bodem in 20 mL gemodificeerde M9 voedingsbodem, vervolgens Verdun 10^-3 tot een totaal volume van 20 mL in een centrifugebuis steriele 50 mL met een steriele schuim stekker toe beluchting.
   3. Voor strak gebonden rhizosfeer monsters, voeg toe 2 mL van de rhizosfeer bodem drijfmest tot 20 mL gemodificeerde M9 medium, dan Verdun 10^-3 tot een totaal volume van 20 mL in een centrifugebuis steriele 50 mL met een steriele schuim stekker toe beluchting.
2. Bereiding van de monsters (wortel, schieten en graan) van het weefsel
   1. Oppervlak steriliseren het monster met 70% ethanol. Maceraat 2.0 g van vers weefsel in 20 mL gemodificeerde M9 voedingsbodem met behulp van een mixer op hoge voor 30 seconden. Het monster overbrengen in een centrifugebuis steriele 50 mL en Verdun 10^-3 tot een totaal volume van 20 mL in een centrifugebuis steriele 50 mL met een steriele schuim stekker toe beluchting.
3. Verrijking van de siderofoor productie door middel van Fe beperking
   1. 50 mL centrifuge buizen bij kamertemperatuur incuberen en schudden bij 160 rpm.

6. CAS-Fe agar tests voor de opsporing van siderofoor productie in milieu monsters

1. Op 24, 48 en 72 uur na de inleiding van de cultuur van de verrijking, door 1 mL deelmonsters te verwijderen van de buizen van de verrijking met steriele techniek en centrifuge op 10.000 x g gedurende 1 min. in 2 mL centrifuge buizen aan de pelletize van de cellen.
2. Het verzamelen van het supernatans dat gescheiden. Met behulp van steriele techniek, 100 μL van de bovendrijvende substantie aan 100 μl oplossing van CAS-Fe-Agar in dubbele of drievoud in de microplate toevoegen. Ook Voeg 100 µL van steriele M9 medium (als leeg). Vervolgens Incubeer de plaat bij 28 ° C.
3. De resterende supernatant en pellet voor elk monster (niet toegevoegd aan de microtiterplaat plaat) in zijn eigen, steriele 2 mL centrifugebuis opschorten. Voeg 400 μL van steriele glycerol in elke buis monster-supernatant en resuspendeer de pellet tot glycerol voorraden. Het bevriezen van de voorraad op-80 ° C voor latere analyses.
   Opmerking: Deze stap kan worden aangepast voor het genereren van glycerol voorraden volgens een in-house voorkeursprotocol.
4. Meet de extinctie op 6, 24, 48 en 72 uur, bij 420 nm golflengte.
5. Gebruik standaard curven gegenereerd op basis van pyoverdine of EDTA te kunnen interpreteren monster extinctie metingen op het gebied van pyoverdine-equivalenten.
   Opmerking: Pyoverdine was vastbesloten te zijn een superieure standaard in vergelijking met EDTA (vide infra), dus EDTA was niet gewend aan het interpreteren van de resultaten in de huidige studie.

Resultaten

Een pyoverdine mengsel levende door Pseudomonas fluorescens werd gebruikt als een standaard voor het interpreteren en kwantificeren van de extinctie (op 420 nm) van monsters in termen van pyoverdine equivalenten in µM. Figuur 1 toont de relatie tussen extinctie (420 nm) en het starten van de concentratie van pyoverdine (Log₁₀ molarity in µM). EDTA verstrekten niet een voldoende mate omdat monsters tentoongesteld meer extinctie metingen dan...

Discussie

Het belangrijkste resultaat van dit werk is de productie van een nieuwe methodologie die kan worden gebruikt om snel verrijken siderofoor microben produceren tijdens het kwantitatief meten van siderofoor productie/activiteit in het milieu monster. De methodologie is snel, eenvoudig en kosteneffectief, en de resultaten laten zien hoe het kan worden gebruikt voor het detecteren van siderofoor activiteit van complexe en nieuwe monster typen (b.v.., bodem en plant weefsel). Het protocol ook resulteert in de producti...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Agarose	Apex	LF451320014
Aluminium bakvorm
Aluminiumfolie
Ammoniumchloride, korrelig	Fiesher Scientific	152315A
Autoclaaf en sterilisator	Thermo Scientific
Calciumchloride dihydraat	Fiesher Scientific	171428
CAS (Chrome Azurol S)	Chem-Impex Int'l Inc)	000331-27168
Dextrosemonohydraat (glucose), kristallijn poeder	Fiesher Scientific	1521754
EDTA, dinatriumzout, dihydraat, Kristal	J.T.Baker	JI2476
Glycerol, watervrij	Baker Analyzed	C22634
HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide	Reagent World	FZ0941
Hydrochloorzuur	ACROS Organic	B0756767
Infinite M200 PRO plate reader	TECAN
Ijzer (III) chloride hexahydraat, 99%	ACROS Organic	A0342179
Laboratoriumafzuigkap	Thermo Scientific
Laboratoriumincubator	VWR Scientific
Magnesiumsulfaat	Fiesher Scientific	27855
Salpeterzuur, (69-70)%	J.T.Baker	72287
PIPES-buffer, 98,5%	ACROS Organic	A0338723
Kaliumfosfaat, dibasisch, poeder	J.T.Baker	J48594
Pyoverdine	SIGMA-ALDRICH	078M4094V
Zand
SI-600R Shaker	Lab Companion
Natriumchloride, korrelig	Fiesher Scientific	136539
Natriumhydroxide, pellets	J.T.Baker	G48K53
Natriumfosfaat, dibasisch heptahydraat, 99%	ACROS Organic	A0371705