Method Article

Kwantitatieve analyse van cellulaire samenstelling in geavanceerde atherosclerotische laesies van de gladde spieren cel Lineage-Tracing muizen

DOI:

10.3791/59139

⸱

February 20th, 2019

 ,  ,  , 
1Heart, Lung, Blood and Vascular Medicine Institute, University of Pittsburgh, 2Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia, 3Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia, 4Division of Cardiology, University of Pittsburgh School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij stellen voor een gestandaardiseerde protocol karakteriseren de cellulaire samenstelling van laat-stadium lymfkliertest atherosclerotische laesies met inbegrip van systematische methoden voor dierlijke dissectie, weefsel insluiten, afdelen, kleuring en analyse van brachiocephalic slagaders van atheroprone gladde spieren cel lineage tracering muizen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Atherosclerose blijft de belangrijkste oorzaak van overlijden wereldwijd en, ondanks talloze Preklinische studies beschrijven van veelbelovende therapeutische doelen, gebleven roman interventies ongrijpbaar. Dit is waarschijnlijk, gedeeltelijk vanwege tot een afhankelijkheid van preklinische preventie modellen onderzoekt de gevolgen van genetische manipulaties of farmacologische behandelingen op atherosclerose ontwikkeling in plaats van de gevestigde ziekte. Ook zijn resultaten van deze studies vaak storende vanwege het gebruik van oppervlakkige laesie analyses en een gebrek aan karakterisering van laesie cel populaties. Om te helpen deze translationeel hindernissen overwinnen, stellen wij voor een verhoogde afhankelijkheid van interventie modellen die onderzoek naar veranderingen in cellulaire samenstelling op het niveau van een eencellige in door immunefluorescentie kleuring en confocale microscopie dienst. Te dien einde beschrijven we een protocol voor het testen van een vermeende therapeutische agent in een model van de lymfkliertest interventie met inbegrip van een systematische aanpak voor dierlijke dissectie, insluiten, afdelen, kleuring en kwantificering van brachiocephalic slagader laesies. Bovendien, als gevolg van de fenotypische verscheidenheid van cellen binnen de laat-stadium atherosclerotische laesies beschrijven we het belang van het gebruik van cel-specifieke, afleidbare bloedlijn tracering muis systemen en hoe dit kan worden benut voor onbevooroordeelde karakterisering van atherosclerotische laesies cel populaties. Samen, deze strategieën kunnen bijstaan vasculaire biologen nauwkeuriger model van therapeutische interventies en analyseren van atherosclerotische ziekten en hopelijk zal vertalen in een hoger tarief van succes in klinische proeven.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Atherosclerose is de belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd ten grondslag liggen aan de meerderheid van coronaire hartziekte, perifere slagader ziekten en beroerte. Alsnog coronaire atherosclerose kan leiden tot ernstige complicaties inclusief myocardiale overtreding boekhouding voor bijna 16% van de wereld bevolking sterfte1,2. Als gevolg van de verwoestende gevolgen voor de volksgezondheid, aanzienlijke inspanning geboekt te ontcijferen van de mechanismen van atherosclerose progressie, evenals rijden over het ontwikkelen van nieuwe therapeutische strategieën. Toch is het tarief van de waarschijnlijkheid van goedkeuring (LOA) van klinische proeven voor hart-en vaatziekten tot de laagste in vergelijking met andere klinische velden (slechts 8,7% voor fase I)3. Dit kan verklaard worden gedeeltelijk door vele obstakels die atherosclerose vormt voor efficiënte Geneesmiddelenontwikkeling, met inbegrip van haar bijna alomtegenwoordige aard, klinisch-stille progressie en belangrijke ziekte heterogeniteit. Bovendien, het suboptimaal ontwerp van preklinische dierstudies kan ook worden verklaard voor het gebrek aan succes in klinische vertaling. Wij vinden het in het bijzonder nodig voor de uitvoering van interventiestudies mogelijk te onderzoeken van de werkzaamheid van de therapeutische strategieën. Ook is er dringend behoefte aan gestandaardiseerde procedures uitvoeren voor laesie analyses, met inbegrip van geavanceerde karakterisering van laat-stadium atherosclerotische laesies cellulaire samenstelling door lot toewijzing en fenotypering.

De overgrote meerderheid van atherosclerose studies richten zich op modellen van atherosclerose preventie bestaande uit drug behandeling of genetische manipulatie (knock-out of knock-in) bij gezonde jonge muizen, voorafgaand aan de inleiding van de ziekte en de progressie. Deze studies hebben ontdekt een groot aantal genen en signalering moleculen die een rol in de ontwikkeling van atherosclerose spelen. Echter het merendeel van deze doelstellingen niet te vertalen naar efficiënte therapieën in de mens. Inderdaad, het is moeilijk te extrapoleren het effect dat een therapie op gezonde jonge muizen aan oudere patiënten met geavanceerde atherosclerotische laesies heeft. Als zodanig, zorgt de implementatie van interventiestudies in de preklinische experimentele pijpleiding waarschijnlijk voor een meer nauwkeurige voorstelling van de relevantie en doeltreffendheid van een nieuwe therapeutische. Het idee wordt ondersteund door de opvallend uiteenlopende effecten van remming van de pro-inflammatoire cytokine Interleukine-1β (IL-1β) als een preventie4,5,6 of interventie strategie7in dienst. Verschillen tussen preventie en interventiestudies suggereren dat verschillende cellulaire processen zich voordoen in verschillende fasen van de ontwikkeling van atherosclerose en wijst op het feit dat preventie studies waarschijnlijk zijn onvoldoende om het model van de klinische scenario voldoende.

De American Heart Association publiceerde onlangs een wetenschappelijke verklaring aanbevelingen voor goede proefopzet, procedurele normalisatie, analyse en rapportage van dierlijke atherosclerose studies8detaillering. Zij wijst op de voordelen en beperkingen van overheersende technieken die worden gebruikt in het veld. Nl gezicht Soedan IV kleuring van de aorta wordt bijvoorbeeld vaak uitgevoerd als een eerste uitlezing. Hoewel nl gezicht Soedan IV kleuring van lipide afzetting een geschikte methode voor de beoordeling van globale plaque last is, is het niet in staat om te onderscheiden van beginnende vette streep laesies van meer geavanceerde alsnog laesies. Als zodanig is de interpretatie van nl gezicht kleuring vaak dubbelzinnig en oppervlakkige9. Zorgvuldige analyse van weefsel doorsneden met behulp van de morfologische parameters vaartuig, laesie en lumen grootte en kwantificering van de indexcijfers van de laesie stabiliteit biedt een nauwkeuriger inzicht in het effect van een experiment.

Ten slotte, menselijke histopathologie studies hebben gesuggereerd dat cellulaire samenstelling een betere voorspeller van breuk dan de laesie grootte zelf, met laesies in de zachte spiercellen (SMC) armen en rijken in macrofagen wordt gevoeliger is voor scheuren10, 11. Deze opmerkingen waren gebaseerd op de kleuring voor markeringen klassiek gebruikt voor de identificatie van de cel (dat wil zeggen, ACTA2 voor SMC en LGALS3 of CD68 voor macrofagen). De uitdrukking van deze markeringen echter niet strikt beperkt tot een enkele celtype in atherosclerotische laesies als gevolg van de plasticiteit van meerdere lineages inclusief SMC, endotheliale cellen en myeloïde cellen12. In het bijzonder was de ondubbelzinnige identificatie van SMC binnen atherosclerotische laesies vrijwel onmogelijk tot de afgelopen tien jaar vanwege het eigendom van deze cellen te dedifferentiate en te bestraffen van hun geslacht-specifieke markers (een proces genoemd fenotypische schakelen) in13van de gewonde of zieke vaartuigen. Deze beperking in SMC identificatie heeft omzeild door de ontwikkeling van lineage tracering7,14,15,16,17,18, 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. het bestaat uit het permanent etikettering SMC en hun nageslacht voor het bijhouden van hun lot en fenotypische evolutie tijdens atherosclerose progressie met behulp van een combinatie van de uitdrukking van Cre recombinase gedreven door SMC-specifieke initiatiefnemers (dat wil zeggen, Myh117,15,17,18,19,20,21,22,23 , 24,26 25, Acta2en, SM22α14,16) en de activering van verslaggevers (bijv. fluorescente proteïnen, β-galactosidase) [gerecenseerd in Bentzon en Majesky 201827]. In één van de eerste studies dienst SMC lineage tracering buiten embryogenese instelling, Speer et al.14 aangetoond dat SMC moduleren hun fenotype en transdifferentiate in chondrogenic cellen tijdens vasculaire verkalking met behulp van kunt een SM22α Cre R26R LacZ lineage tracering model. Hoewel deze studies pionier SMC lineage tracering, waren zij gedeeltelijk dubbelzinnig in die zin dat een bepaald niet-SMC waarin SM22α in het kader van de ziekte zou worden aangeduid door de verslaggever. Deze beperking is gepasseerd door de ontwikkeling en het gebruik van tamoxifen-afleidbare Cre ERT/LoxP toelaat een temporele controle van cel labeling. Cel labeling gebeurt uitsluitend tijdens tamoxifen levering en zal worden beperkt tot de uiting van de cel type-specifieke promotor rijden Cre ERT expressie op het moment van tamoxifen blootstelling, het vermijden van tracering van alternatieve celtypes activeren Cre in cel de instelling van progressie van de ziekte. Voor tracering van de bloedlijn van SMC in atherosclerose, de tamoxifen-afleidbare Myh11- Cre/ERT2 transgenic gekoppeld aan fluorescerende verslaggevers (eYFP7,15,17,18 , 21, mTmG19,25, Confetti20,22,23 voor klonen uitbreiding studies) heeft aangetoond een opmerkelijke efficiëntie en specificiteit in SMC labeling en heeft gebruikt om lot kaart SMC populaties in atherosclerotische laesies in recente studies. Nog belangrijker is, deze studies is gebleken dat: 1) 80% van de SMC binnen geavanceerde atherosclerotische laesies ken niet uitdrukkelijk elke conventionele SMC markeringen (ACTA2, MYH11) in immunohistological analyse gebruikt en daarom zou hebben is onrechte zonder afstamming tracering 17; 2) deelverzamelingen van SMC express markers van alternatieve celtypen, met inbegrip van macrofaag markeringen of mesenchymale stamcellen markeringen16,17,19; en 3) SMC investeren en vullen de atherosclerotische laesie door oligoclonale expansie en SMC klonen behouden plasticiteit overgang naar fenotypische verschillende bevolkingsgroepen20,23. Om samen te vatten, is het nu duidelijk dat de zachte spiercellen een opmerkelijke fenotypische verscheidenheid in atherosclerotische laesies presenteren en voordelig of nadelig rollen op laesie pathogenese afhankelijk van de aard van hun fenotypische overgangen hebben kunnen. Deze ontdekkingen vertegenwoordigen een opmerkelijke nieuwe therapeutische laan voor het targeten van SMC athero-bevordering van fenotypische overgangen in laat-stadium atherosclerose.

Hierin stellen wij een gestandaardiseerd protocol voor het analyseren van de late-stadium lymfkliertest atherosclerotische laesies waaronder systematische methoden voor dierlijke dissectie, insluiten, afdelen, kleuring en kwantificering van brachiocephalic slagader laesies. Hebben we gebruikt om te bepalen van het effect van Interleukine-1β remming op SMC lot en fenotype, SMC lineage traceren ApoE- / - muizen gevoed een westerse dieet gedurende 18 weken vóór de ontvangst van de wekelijkse injecties van een anti-IL1β antistof of isotype-matched IgG besturingselement.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het fokken van dieren, de behandeling en de procedures werden goedgekeurd door de Universiteit van Virginia en de Universiteit van Pittsburgh institutionele dierenverzorgers en gebruik Comité.

1. generatie van SMC lineage tracering muizen

  1. Myh11- Cre/ERT2 mannen28 fokken (Jackson Laboratory; #019079) met R26R-EYFP vrouwtjes (Jackson Laboratory; #006148) te verkrijgen Myh11- Cre/ERT2+ R26R-EYFP+/ + mannen.
  2. Fokken van de Myh11- Cre/ERT2+ R26R-EYFP+/ + mannen met ApoE- / - vrouwelijke muizen (Jackson laboratorium; #002052). Kruis de nakomelingen en selecteer door genotypering Myh11- Cre/ERT2+ R26R-EYFP+/ + ApoE- / - man en R26R-EYFP+/ + ApoE- / - vrouwelijke muizen als definitieve fokkers. Knippen van staarten en het uitvoeren van genotypering op nestgenoten. Alle mannelijke muizen moeten Myh11- Cre/ERT2+ R26R-EYFP+/ + ApoE- / - en kan worden gebruikt als experimentele muizen(Figuur 1).
    Opmerking: Genotypering protocollen kunnen worden gevonden op de website van het Jackson Laboratory. De Myh11 Cre/ERT2 transgenic ligt aan het Y-chromosoom, zich verzet tegen het gebruik van de vrouwtjes. Andere geslacht tracering systemen kunnen worden gebruikt, maar dit systeem is tot nu toe de meest betrouwbare afstamming tracering strategie naar lot kaart SMC in atherosclerose.

2. glad spierweefsel cel lineage-tracing muis dieet en behandelingen

  1. Hebben mannelijke Myh11- Cre/ERT2+ R26R-EYFP+/ + ApoE- / - muizen ontvangen een reeks 1 mg tamoxifen injecties van zes tot acht weken van leeftijd om te etiketteren permanent Myh11+ SMC met YFP en het bijhouden van hun lot (Figuur 1 A).
    1. Verhit de olie van de pinda bij 55 ° C.
    2. Tamoxifen in voorverwarmde arachideolie voor te bereiden van een oplossing bij 10 mg/mL en Incubeer bij 55 ° C tot volledige ontbinding van tamoxifen toevoegen.
    3. Meer dan twee weken een intraperitoneale injectie met 0,1 mL van 10 mg/mL tamoxifen oplossing voor een reeks van tien injecties uitvoeren.
      Opmerking: Tamoxifen is een biohazard en moet met zorg worden behandeld.
  2. Vijf tot zeven dagen na de laatste injectie met tamoxifen, vervangen chow dieet met hoog-vet dieet (bijvoorbeeld westerse dieet 42% kcal uit vet; 0.2% totaal cholesterol) voor een duur van 18 weken te voorzien in de ontwikkeling van geavanceerde atherosclerotische laesies, die consequent ontwikkelt in meerdere vasculaire bedden, met inbegrip van de aortaboog, aorta wortel, brachiocephalic slagader en de abdominale aorta.
  3. Beginnen op 18 weken van vetrijke dieet voeding, therapeutische interventie voor de gewenste duur (Figuur 1B).
    Opmerking: Als een voorbeeld, trad we per intraperitoneaal injecties met een anti-IL1β-antilichaam of een besturingselement van de IgG isotype-matched tussen 18 en 26 weken van hoog vet dieet.
  4. Voedsel om snel muizen gedurende 8 tot 16 uur voorafgaand aan de oogst voor het uitvoeren van nauwkeurige lezingen voor plasma cholesterol en triglyceriden weefsel te verwijderen.

3. het verzamelen van de Brachiocephalic-slagader (BCA)

  1. Dierlijke euthanasie dient Animal Care en gebruik Comité (ACUC) eisen en voorschriften te volgen. De experimentele muizen euthanaseren door CO2 verstikking voor ongeveer 5 minuten en controleer of dood door teen snuifje.
  2. Weeg de muis en het verzamelen van bloed.
    1. Wegen van de muis
    2. Spray de ventrale zijde van de muis met 70% Ethanol
    3. Cardiale punctie uitvoeren door het invoegen van een naald van de 25G verbonden met een spuit van 1 mL in het ventrikel van de linker kant van de borstholte. 0,1 tot 1 mL bloed kunnen worden verzameld.
    4. Het bloed overbrengen in een EDTA vacuüm buis door te spoelen van de spuit en plaats de buis op een rocker of rotator gedurende 10-15 minuten.
    5. Bloed overbrengen in een tube 1,5 mL en Centrifugeer gedurende 10 minuten 250 x g bij 4 ° C. Zorgvuldig trekken de bovenste plasma fase met een pipet en voldoende tips en overbrengen naar een nieuwe buis. Bewaren bij-20 ° C vóór het meten van cholesterol en triglyceriden.
      Opmerking: volbloed kan worden gebruikt voor aanvullend onderzoek met inbegrip van de graven van de bloedcellen en andere bloedbestanddelen, met inbegrip van cytokines of immuun cel profilering.
  3. Maak een insnede van ongeveer 2 cm in de huid op het midden van de buik met behulp van schaar en trek de huid om de buikholte bloot te stellen. Snij het buikvlies tot het borstbeen zonder schadelijke weefsels. Twee bezuinigen op de lijn halverwege axillary door middel van de thorax, dat evenwel niet tot het hart en de longen beschadigen.
  4. Til het borstbeen met een pincet en snijd het middenrif om gedeeltelijk het hart bloot te stellen. Als het hart niet gemakkelijk toegankelijk is, knippen weg de ribbenkast genoeg te bereiken van het juiste atrium.
  5. Perfuse de muis met een zwaartekracht perfusie systeem(Figuur 2). Installeer de zwaartekracht perfusie systeem zodanig zijn dat de druk van de vloeistof perfusie gelijk aan de gemiddelde lymfkliertest bloeddruk (Figuur 2B is). Dit systeem zorgt voor consistentie in perfusie en beide onderhoudt het vaartuig morfologie en flushes rode bloedcellen.
    Opmerking: Als referentie, C57Bl6 muizen hebben een fysiologische bloeddruk tussen 120 mmHg (gemiddelde systolische bloeddruk) en 70 mmHg (gemiddelde diastolische bloeddruk)29,30. Gemiddelde systolische en diastolische bloeddruk kan variëren met muis genetische achtergrond.
    1. Sluit een 23 of 25G butterfly naald aan de zwaartekracht perfusie-systeem en -fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) doorlopen de naald tot uitzetting van de lucht door de buizen. De naald in het linkerventrikel invoegen en beveiligen van de naald op zijn plaats. Maak een kleine incisie (< 2 mm) met iris schaar in de juiste atrium of de oplopende aorta.
    2. Perfuse met 5 mL PBS, vervolgens 10 mL van de oplossing van de Paraformaldehyde (PFA) van 4%, vervolgens 5 mL PBS. Gebruik zowel PBS en 4% PFA oplossing bij kamertemperatuur.
    3. Verzamelen van de weefsels van belang (bijv. lever, longen, milt) en plaats hen in de 4% PFA-oplossing.
  6. De BCA bloot
    1. Reinig de halsgebied door het verwijderen van de huid en de speekselklieren.
    2. Het uitvoeren van één manier bespaart de middellijn van het borstbeen nog via het manubrium met behulp van schaar. Wees voorzichtig dat de schaar ligt dicht bij de achterkant van het sternum genomen om te voorkomen beschadiging van de therapieën die nauw onder het borstbeen. Trek aan beide zijden van de ribbenkast met een tang om volledig open de borstholte. Carotids moeten gedeeltelijk zichtbaar zijn.
    3. Schoon te maken door te trekken van de spieren en bindweefsel en verwijderen van vet met een fijne pincet totdat de juiste halsslagader, de slagader van de brachiocephalic de subclavian bifurcatie en de aortaboog zijn gereinigd en geïsoleerd van de omliggende bindweefsel en vet (figuur 2C).
  7. Verwijderen van de BCA
    1. Met behulp van Tang, pak de juiste halsslagader hieronder zijn bifurcatie en maken een eerste snede boven de verlostang (Figuur 2D).
    2. Bedrijf nog steeds de halsslagader, maken een tweede cut via de slagader van de subclavian. De laatste twee sneden zijn via de aortaboog, aan weerszijden van de slagader van het brachiocephalic (Figuur 2D).
    3. Verzamelen van andere vascular weefsels van belang (bijvoorbeeld abdominale aorta, superieure deel van het hart met de aorta wortel).
    4. Plaats de BCA en andere weefsels in 4% PFA oplossing overnachting bij kamertemperatuur.
      Opmerking: De tijd van de fixatie moeten consequent door de studie.

4. de weefsels verwerking en segmenteren

  1. Verwijder het weefsel uit 4% PFA en breng dit in een gelabelde weefsel cassette (Figuur 3A). Gebruik schuim pads in de cassette om ervoor te zorgen het weefsel behouden zijn geaardheid en blijft in de cassette door de verwerking stap (Figuur 3B). Sluit de cassettes en onderdompelen in 70% ethanol tot weefsel verwerking (24 tot 72 h).
    1. Proces BCA en andere weefsels verzameld voor histologisch en immunefluorescentie kleuring als volgt (voorbeeld van overnachting routineprocedure met behulp van een processor met vacuüm penetratie): 10% neutraal gebufferd formaline gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (2 x), 75% ethanol voor 60 min bij 30 ° C (1 x), 90% ethanol voor 60 min bij 30 ° C (1 x), 95% ethanol voor 60 min bij 30 ° C (1 x), 100% ethanol voor 60 min bij 30 ° C (3 x), xyleen gedurende 60 minuten staan bij 30 ° C (3 x) en paraffine voor 80 min bij 62 ° C (3 x).
  2. Embed BCA verticaal, met de aortaboog dichtst bij het blok gezicht (Figuur 3C).
  3. Doorsnijden de paraffine-blok op rotary microtome (10 µm dikte) tot het bereiken van het ingesloten weefsel.
  4. Zodra het weefsel zichtbaar is, onderzoeken een gedeelte onder een microscoop om positie te bepalen. Als de aortaboog nog steeds zichtbaar is, maximaal tien 10 µm secties tegelijk verwijderen, behandeling van een sectie op elk interval.
  5. Wanneer de aortaboog heeft via zijn gesegmenteerd en de slagader van de brachiocephalic zichtbaar is, passen de oriëntatie van het blok te plaatsen van het weefsel volledig loodrecht naar de microtoom blade.
  6. Snijd de BCA bij een dikte van de sectie van 10 µm. Op dat moment worden alle secties serieel met drie secties per dia worden verzameld. Verzamelen tot het bereiken van de subclavian bifurcatie (Figuur 3D).
    Opmerking: Het is belangrijk om te snijden de BCA bij een dikte van de sectie van 10 µm voor latere z-stack confocal Beeldacquisitie en eencellige tellen. Deze dikte kan de beoordeling van het strenge en niet-cofounding van de associatie tussen een één kern en cytoplasmatische of membraan kleuring hoewel de diepte van de doorsnede.

5. immunefluorescentie kleuring

Opmerking: Een volledige karakterisering van atherosclerotische laesies omvat beoordeling van morfologische parameters en indexcijfers van de plaque stabiliteit of instabiliteit en cellulaire compositie die niet zal de focus van dit protocol. Laesie morfologie, collageen inhoud en intraplaque bloeding kunnen worden geanalyseerd door Movat7,17, PicroSirius Red 7,31, Ter119 kleuring 7,18, respectievelijk. Hier beschrijven we het protocol voor het analyseren van de cellulaire samenstelling van laesies.

  1. Incubeer de dia's in de volgende oplossingen bij kamertemperatuur onder een chemische motorkap: xyleen voor 5 min (2 x), 100% ethanol voor 5 min (2 x), 95% ethanol voor 5 min (2 x), 70% ethanol voor 5 min (2 x) en gedeïoniseerd H2O (diH2van O) gedurende 5 minuten (2 x).
  2. Incubeer dia's in de oplossing van de gegevensherwinning van antigeen volgens instructie van de fabrikant.
    1. Met citroenzuur gebaseerde antigeen ontmaskeren oplossing (Zie Tabel of Materials), Verdun 3 mL van oplossing in 320 mL diH2O. plaats de dia's in een kleuring reservoir en vulling naar de top met de oplossing van de gegevensherwinning bereid antigeen.
    2. Vul eventuele lege "slots" in de dia-rek met lege dia om zelfs Verwarming. Betrekking hebben op de container met een deksel dat de oplossing van de gegevensherwinning antigeen aan de kook zonder verdamping.
    3. Verwarm de dia's in een magnetron voor 20 min op ongeveer 675-700 watt. Controleer ondergedompeld de dia's regelmatig en vervang verdampt vloeistof met diH2O zodanig dat secties blijven in ontmaskeren oplossing te allen tijde.
    4. Laat dia's om af te koelen in de oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  3. Los 6 g vis huid gelatine (FSG) in 1 L van PBS. PBS/FSG wordt gebruikt als het wassen van de buffer. Bereid een blokkerende oplossing van 10% normale serum in PBS/FSG.
    Opmerking: Vis huid gelatine wordt gebruikt bij de voorbereiding van de buffer met blokkerend. FSG bevat geen serum eiwitten die kunnen cross-react met zoogdieren antilichamen, minimaliseren van achtergrondgeluiden. Echter, andere blokkerende optie de voorkeur verdient met biotine detectiesystemen zoals FSG endogene Biotine bevat. Het type voor normale serum gebruikt is gebaseerd op het secundaire antilichaam gebruikt. Wanneer ezel secundaire antilichamen worden gebruikt, moet de normale paard serum voor blokkeren en antilichaam verdunningen worden geselecteerd.
  4. Laat dia's in PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur inwerken. Cirkel weefselsecties met een hydrofobe pen. Dekking van de secties met de buffer met blokkerend PBS/FSG/normal serum gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Bereid de oplossing van de primair antilichaam in PBS/FSG/normal serum tijdens deze stap, terwijl het blokkeren van de weefsels.
  5. Incubeer met primaire antilichamen verdund in PBS/FSG/normal serum's nachts bij 4 ° C in een kamer vochtigheid. Één sectie per dia moet worden geïncubeerd met een mix van IgG antilichamen van de controle op dezelfde concentratie als de primaire antilichamen aan besturingselement voor primaire antilichamenspecificiteit.
  6. Wassen van de dia's als volgt bij kamertemperatuur: PBS/FSG gedurende 5 min. (3 x), vervolgens PBS voor 5 min (1 x).
  7. Incubeer met fluorophore-geconjugeerde secundaire antilichamen (Zie Tabel van materialen) en diamidino-2-phenylindole (DAPI) voor de nucleus counterstaining verdund in PBS/FSG/normal serum gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Dia's beschermen tegen licht.
  8. Wassen dia's zoals beschreven in stap 5.6.
  9. Dia's met behulp van montage media geschikt voor fluorescentie mount (Zie Tabel van materialen).

6. confocale microscopie

Opmerking: Het gebruik van een confocal microscoop en z-stack verwerving is van cruciaal belang voor het tellen van eencellige.

  1. Overname parameters worden gebruikt in de studie instellen: beeld resolutie (1024 x 1024 of 2048 x 2048 pixels); Optische weglengte van en aantal kanalen, die een functie van de combinatie van secundaire antilichamen geselecteerd; Scansnelheid (aanbevolen scansnelheid: 7-8); en differentiële interferentie contrast (DIC) kanaal.
  2. Gebruik secties gekleurd met de primaire antilichamen en IgG controle en laat de gevoeligheid van de detector, laser kracht en verschuiving voor elk individueel kanaal. De IgG-besturingselement wordt gebruikt om het signaal van de achtergrond te minimaliseren.
  3. De bovenste en onderste posities voor z-stack overname instellen. Vooraf bepalen de dikte en het aantal stacks aan te schaffen. Deze parameters moeten blijven consistent van de studie.
    Opmerking: We raden imaging 8 tot en met 10 stapels 1 µm dikte. Blijf consequent in het aantal stacks beeld tijdens de studie.
  4. Afbeelding weefselsecties gekleurd met primaire antilichamen en IgG controle voor alle kanalen waaronder DIC.
  5. Label ten minste één afbeelding met een bar van de schaal voor de kalibratie van de afbeelding tijdens het eencellige tellen.

7. eencellige tellen

  1. Installeer en open ImageJ. Indien nodig, het downloaden van Plugins in de sectie downloaden > Input/Output voor de ImageJ website te openen het afbeeldingsbestand gegenereerd, afhankelijk van het formaat van de afbeeldingen gegenereerd door de confocal microscoop.
  2. Open het afbeeldingsbestand in ImageJ.
  3. Kalibreren van de afbeelding met een referentie-schaal bar met behulp van de afbeelding gegenereerd in 6.6.
  4. Bakenen de regio van belang waarin eencellige tellen zal worden uitgevoerd met behulp van het kanaal van DIC (Figuur 4).
    Opmerking: Een regio kan worden afgebakend op een moment. Afhankelijk van de experimentele vragen, eencellige tellen kan worden uitgevoerd op het gebied van volledige laesie (Zie 7.3.1) en/of in een sublocation van de laesie. Bijvoorbeeld, is onderzoek van het gevezelde GLB-gebied (Zie 7.3.2) bijzonder relevant, aangezien de cellulaire samenstelling een belangrijke index van laesie neiging is te scheuren.
    1. De laesie gebied af te bakenen door het volgen van de rand van de lumen (Figuur 4A; witte pijlen) en de interne elastische lamina (Figuur 4A; gele pijlen) zichtbaar op de DIC-afbeelding.
    2. Voor analyse van het gevezelde cap gebied, bepalen de grens verre van 30 µm van de lumen en traceren van de grens ( Figuur 4B-D).
      Opmerking: Het gebied vezelig GLB is klassiek gedefinieerd als de regio verrijkt in ACTA2 + cellen en collageen underlaying de lumen (Figuur 4B). De verrijking in ACTA2 + cell en collageen speelt een cruciale rol in de stabiliteit van de laesie. Eerdere studies hebben vastgesteld dat de ACTA2 + cel rijke vezelig GLB-gebied gemiddeld een dikte van 30 µm van het lumen in SMC-geslacht traceren ApoE- / - muizen gevoed een vetrijke dieet voor 18 tot en met 26 weken (Figuur 4C). Zorgvuldige karakterisering van de gevolgen van genetische manipulatie of farmacologische behandeling op het gebied van de cellulaire samenstelling van vezelig GLB is dus opmerkelijk relevante.
  5. Open het deelvenster Kanalen gereedschappen (Afbeelding > Kleur > kanaal Tools) en de andere pseudo-kleur kleuring kanalen (Figuur 5A; kader 1).
  6. Samenvoegen van de kleurkanalen (Afbeelding > Kleur > samenvoegen kleuren) (Figuur 5A; vak 2). Alle kanalen moeten zichtbaar zijn op het zelfde beeld (Figuur 5B). En van afzonderlijke kleurkanalen met behulp van het deelvenster van het Kanaal gereedschappen (Figuur 5A; vak 1) aanzetten.
  7. De tellen tool instellen.
    1. Klik met de rechtermuisknop op het pictogram van de Counting in de werkbalk (Figuur 5C; vak 1) en selecteer Multi-Point gereedschap.
    2. Dubbelklik op het pictogram gelijk om het Gereedschap Ankerpunt deelvenster (Figuur 5C; vak 2) te openen.
    3. Selecteer het type en de grootte van de items gebruikt om de cellen tellen.
    4. Controleer Alles weergeven.
  8. Schakel op de DAPI kanaal alleen in het deelvenster Gereedschappen van het kanaal en selecteer de teller kanaal 0 (Figuur 5C; vak 3). Klik op afzonderlijke kernen die zal worden gelabeld (bijvoorbeeld gele stippen in Figuur 5C-D). Scroll z-stacks te tellen alle kernen gekleurd in de regio van belang. Het aantal gebeurtenissen wordt aangegeven onder het kanaal van de teller in Gereedschap Ankerpunt deelvenster (Figuur 5C; in vak 4).
  9. Inschakelen van een andere kleuring kanaal (bijv eYFP kleuring). Selecteer de teller kanaal 1. Klik op cellen waarin er een colocalization tussen de DAPI en kleuring is. Voor cytoplasmatische kleuring, selecteer de cellen voor met vlekken rondom de kern op de gehele diepte van de kern (check verschillende z-stacks).
  10. Herhaal door aanpassing van de kleuring van combinaties en selecteren nieuwe teller kanalen om te tellen de cel populaties van belang. Elke stip kleur vertegenwoordigt de bevolking van een andere cel (Figuur 5D). Resultaten kunnen worden uitgedrukt als het aantal cellen tot totale aantal DAPI of aantal cellen naar regio gebied.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe- / - muizen werden ingespoten met tamoxifen tussen zes en acht weken oud voordat gevoed een hoog vet dieet. Op 18 weken hoog vet dieet, voeding, werden twee groepen van acht muizen per week behandeld met ofwel een monoklonaal anti-IL-1β-antilichaam van muis of een besturingselement van de IgG isotype-matched bij 10 mg/kg voor 8 weken (Figuur 1)7. Muizen werden opgeofferd en geperfundee...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ondanks decennia van onderzoek en technische vooruitgang bij het bestuderen van atherosclerose, heeft de veld een teleurstellend geschiedenis van voor het vertalen van wetenschappelijke bevindingen aan klinische therapieën34,35. Dit verschijnsel kan gedeeltelijk worden verklaard door verschillen in diermodellen, experimentele designs en analyses van de laesie. Hierin beschrijven we een experimentele pijpleiding die we gebruikt om te analyseren de cellulaire samen...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken het centrum voor biologische Imaging (ondersteund door NIH 1S10OD019973-01) aan de Universiteit van Pittsburgh voor hun hulp. Dit werk werd gesteund door wordt ondersteund door wetenschappelijke ontwikkeling Grant 15SDG25860021 van de American Heart Association aan D.G. R.A.B. werd gesteund door NIH grant F30 HL136188.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
16% Paraformaldehyde waterige oplossingElectron Microscopy SciencesRT 15710Weefselperfusie en fixatie
23G butterflynaaldFisherBD367342
25G naaldFisher14-821-13D 
A1 Confocal microscoopNikonConfocale microscoop
ACTA2-FITC antilichaam (muis)Sigma AldrichF3777Primair antilichaam
Alexa-647 anti geitInvitrogenA-21447Secundair antilichaam
Antigeen Unmasking oplossing, Citroenzuur gebaseerdVector LabsH-3300Antigeen recuperatie oplossing
Chow DieetHarlan TekladTD.7012
DekvlakFisher12-544-14Elk 50 x 24 mm dekvlak
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)InvitrogenD1306Fluorescente tegenkleuring van de kern
Donkey Alexa-488 anti-konijnInvitrogenA-21206Secundair antilichaam
Donkey Alexa-555 anti-ratAbcamab150154Secundair antilichaam
DPBS 10X zonder Calcium en MagnesiumGibco14200166PBS voor oplossingsverdunningen en wasbeurten. Verdun tot 1x in gedeïoniseerd water
InbeddingscassetteFisher15-182-701D
ETDA vacuümbuisFisher02-685-2B
Ethanol 200 proofDecon2701
SchuimkussenFisher22-222-012
Gelatine uit koude watervishuidSigma AldrichG7765
GFP antilichaam (geit)abcamab6673Primair antilichaam
geiten IgG controleVector LabsI-5000IgG controle
Hoog Vet DieetHarlan TekladTD.88137
ImageJNIHComputerprogramma https://imagej.nih.gov/ij/ 
LGALS3 antilichaam (rat)CedarlaneCL8942APPrimair antilichaam
LSM700 confocale microscoopZeissConfocale microscoop
Microscoopglazen, Superfrost PlusFisher12-550-15
MicrotoommessenFisher30-538-35
Muis IgG controleVector LabsI-2000IgG controle
NIS element beeldvormingssoftwareNikonBeeldvormingssoftware voor z-stack beeldacquisitie
Normaal PaardenserumSigma AldrichH1270
Pap PenFisher50-550-221
PindakaasSigmaP2144
Prolong gold Antifade bevestigingsmiddelInvitrogenP36930Bevestigingsmiddel 
Konijn IgG controleVector LabsI-1000IgG controle
Rat IgG controleVector LabsI-4000IgG controle
RUNX2 antilichaam (konijn)Abcamab192256Primair Antilichaam
SpuitBD3096281 ml spuit
TamoxifenSigmaT5648
XYleenFisherX55K-4
Zen beeldvormingssoftwareZeissBeeldvormingssoftware voor z-stack beeldacquisitie

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. GBD DALYs and HALE Collaborators. Global, regional, and national disability-adjusted life-years (DALYs) for 315 diseases and injuries and healthy life expectancy (HALE), 1990-2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015. Lancet. 388 (10053), 1603-1658 (2016).
  2. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2018 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 137 (12), 67-92 (2018).
  3. Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nature Biotechnology. 32 (1), 40-51 (2014).
  4. Bhaskar, V., et al. Monoclonal antibodies targeting IL-1 beta reduce biomarkers of atherosclerosis in vitro and inhibit atherosclerotic plaque formation in Apolipoprotein E-deficient mice. Atherosclerosis. 216 (2), 313-320 (2011).
  5. Isoda, K., et al. Lack of interleukin-1 receptor antagonist modulates plaque composition in apolipoprotein E-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (6), 1068-1073 (2004).
  6. Kirii, H., et al. Lack of interleukin-1beta decreases the severity of atherosclerosis in ApoE-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 23 (4), 656-660 (2003).
  7. Gomez, D., et al. Interleukin-1β has atheroprotective effects in advanced atherosclerotic lesions of mice. Nature Medicine. 24, 1418-1429 (2018).
  8. Daugherty, A., et al. Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 121 (6), 53-79 (2017).
  9. Baylis, R. A., Gomez, D., Owens, G. K. Shifting the Focus of Preclinical, Murine Atherosclerosis Studies From Prevention to Late-Stage Intervention. Circulation Research. 120 (5), 775-777 (2017).
  10. Kolodgie, F. D., et al. Pathologic assessment of the vulnerable human coronary plaque. Heart. 90 (12), 1385-1391 (2004).
  11. Virmani, R., Kolodgie, F. D., Burke, A. P., Farb, A., Schwartz, S. M. Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atherosclerotic lesions. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 20 (5), 1262-1275 (2000).
  12. Gomez, D., Owens, G. K. Smooth muscle cell phenotypic switching in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 95 (2), 156-164 (2012).
  13. Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiological Reviews. 84 (3), 767-801 (2004).
  14. Speer, M. Y., et al. Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes in calcifying arteries. Circulation Research. 104 (6), 733-741 (2009).
  15. Gomez, D., Shankman, L. S., Nguyen, A. T., Owens, G. K. Detection of histone modifications at specific gene loci in single cells in histological sections. Nature Methods. 10 (2), 171-177 (2013).
  16. Feil, S., et al. Transdifferentiation of vascular smooth muscle cells to macrophage-like cells during atherogenesis. Circulation Research. 115 (7), 662-667 (2014).
  17. Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nature Medicine. 21, 628(2015).
  18. Cherepanova, O. A., et al. Activation of the pluripotency factor OCT4 in smooth muscle cells is atheroprotective. Nature Medicine. 22, 657(2016).
  19. Albarran-Juarez, J., Kaur, H., Grimm, M., Offermanns, S., Wettschureck, N. Lineage tracing of cells involved in atherosclerosis. Atherosclerosis. 251, 445-453 (2016).
  20. Chappell, J., et al. Extensive Proliferation of a Subset of Differentiated, yet Plastic, Medial Vascular Smooth Muscle Cells Contributes to Neointimal Formation in Mouse Injury and Atherosclerosis Models. Circulation Research. 119 (12), 1313-1323 (2016).
  21. Newman, A. A., et al. Irradiation abolishes smooth muscle investment into vascular lesions in specific vascular beds. JCI Insight. 3 (15), (2018).
  22. Dobnikar, L., et al. Disease-relevant transcriptional signatures identified in individual smooth muscle cells from healthy mouse vessels. Nature Communications. 9 (1), 4567(2018).
  23. Misra, A., et al. Integrin beta3 regulates clonality and fate of smooth muscle-derived atherosclerotic plaque cells. Nature Communications. 9 (1), 2073(2018).
  24. Majesky, M. W., et al. Differentiated Smooth Muscle Cells Generate a Subpopulation of Resident Vascular Progenitor Cells in the Adventitia Regulated by Klf4. Circulation Research. 120 (2), 296-311 (2017).
  25. Herring, B. P., Hoggatt, A. M., Burlak, C., Offermanns, S. Previously differentiated medial vascular smooth muscle cells contribute to neointima formation following vascular injury. Vascular Cell. 6, 21(2014).
  26. Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Science Translational Medicine. 7 (308), (2015).
  27. Bentzon, J. F., Majesky, M. W. Lineage tracking of origin and fate of smooth muscle cells in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 114 (4), 492-500 (2018).
  28. Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nature Medicine. 14 (1), 64-68 (2008).
  29. Mattson, D. L. Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice. American Journal of Hypertension. 14 (5), Pt 1 405-408 (2001).
  30. Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), 2408-2415 (2004).
  31. Durgin, B. G., et al. Smooth muscle cell-specific deletion of Col15a1 unexpectedly leads to impaired development of advanced atherosclerotic lesions. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (5), 943-958 (2017).
  32. Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness. Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).
  33. Lin, M. E., et al. Runx2 Deletion in Smooth muscle Cells Inhibits Vascular Osteochondrogenesis and Calcification but not Atherosclerotic Lesion Formation. Cardiovascular Research. , (2016).
  34. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving Bioscience Research Reporting: The ARRIVE Guidelines for Reporting Animal Research. PLoS Biology. 8 (6), 1000412(2010).
  35. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
  36. Nishioka, T., et al. Contribution of inadequate compensatory enlargement to development of human coronary artery stenosis: An in vivo intravascular ultrasound study. Journal of the American College of Cardiology. 27 (7), 1571-1576 (1996).
  37. Pasterkamp, G., et al. Paradoxical Arterial-Wall Shrinkage May Contribute to Luminal Narrowing of Human Atherosclerotic Femoral Arteries. Circulation. 91 (5), 1444-1449 (1995).
  38. Galkina, E., et al. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).
  39. Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. Quantitative analysis and characterization of atherosclerotic lesions in the murine aortic sinus. Journal of Visual Experiments. (82), 50933(2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Atherosclerotic Lesion AnalysisSmooth Muscle Cell LineageImmunofluorescent StainingConfocal MicroscopyBrachiocephalic Artery HarvestTissue Sectioning ProtocolSingle Cell CountingImageJ AnalysisIL 1 Beta InhibitionGalectin 3 Positive Cells

Related Articles