Methodenartikel

Een High-throughput Assay voor het beoordelen en kwantificeren van neutrofiele extracellulaire Trap vorming

12.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59150

⸱

29 januari 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, Leiden University Medical Center

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een zeer gevoelige en hoge doorvoer neutrofiele extracellulaire val (NET) assay voor de semi-automatische kwantificering van ex vivo NET vorming door immunofluorescentie driedimensionale confocale microscopie. Dit protocol kan worden gebruikt voor het evalueren van de netto vorming en afbraak na verschillende prikkels en kan worden gebruikt voor het bestuderen van potentiële NET-gerichte therapieën.

Samenvatting

Neutrofiele vallen extracellulaire (netten) immunogene extracellulaire DNA structuren die kunnen worden vrijgegeven door neutrofiele granulocyten op een breed scala aan triggers. Netten zijn aangetoond om te dienen als een belangrijke gastheer afweermechanisme dat overlapt en doodt micro-organismen. Aan de andere kant, zijn ze betrokken bij verschillende systemische auto-immune ziekten. Netten zijn immunogeen en giftige structuren die een pool van relevante autoantigens bevatten, met inbegrip van Antineutrofiele cytoplasmatische antistoffen (ANCA)-geassocieerde vasculitis (AAV) en systemische lupus erythematosus (SLE). Verschillende vormen van netten kunnen afhankelijk van de stimulus worden opgewekt. Het bedrag van de netten kan worden gekwantificeerd aan de hand van verschillende technieken, waaronder DNA release in supernatant, meting van DNA-complexvorm met NET-moleculen zoals myeloperoxidase (MPO) of neutrophil elastase (NE), meten van de aanwezigheid van citrullinated meten histonen door fluorescentie microscopie, of stroom cytometrische detectie van NET-componenten die alle verschillende functies met betrekking tot hun specificiteit, de gevoeligheid, de objectiviteit en de hoeveelheid. Hier is een protocol te kwantificeren ex vivo NET vorming in een zeer gevoelige en high-throughput wijze met behulp van drie-dimensionale immunofluorescentie confocale microscopie. Dit protocol kan worden toegepast om verschillende onderzoeksvragen over netto vorming en afbraak in gezondheid en ziekte.

Inleiding

De vorming van neutrofiele extracellulaire vallen (netten) is het proces waarin neutrofielen vrij hun DNA in een extracellulaire driedimensionale (3D) web zoals structuur, complexvorm met een breed scala van antimicrobiële en gevaarlijke moleculen, korrelig en cytoplasmatische enzymen, peptides en proteïnen. Deze immunogeen en giftige structuren hebben een belangrijke fysiologische rol in het aangeboren immuunsysteem verdediging van gezonde individuen door overlapping en doden infectieziekten pathogenen1. Echter, ze hebben ook aangetoond worden betrokken bij trombose2 en verschillende systemische auto-immune ziekten, met inbegrip van Antineutrofiele cytoplasmatische antistoffen (ANCA)-geassocieerde vasculitis (AAV)3, systemische lupus erythematosus (SLE )4,5, antiphospholipid syndroom (APS)2,6, reumatoïde artritis (RA), psoriasis en jicht7,8,9.

In vitro netto vorming is wijd bestudeerd met het chemisch samengestelde phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA), die enorme netto vorming induceert. Meest fysiologische prikkels veroorzaken echter veel lagere niveaus van netto vorming10. Studie NET-triggers in, bijvoorbeeld, een auto-immuunziekte omgeving, is een gestandaardiseerde, gevoelige, high-throughput kwantitatieve bepaling nodig om te detecteren en kwantificeren van netto vorming. Kwantificering van netten heeft bewezen te zijn uitdagend en wordt momenteel uitgevoerd door verschillende methoden, elk met hun eigen voordelen en beperkingen11. Een veelgebruikte methode is de opsporing van DNA in het supernatant12, die doelstelling, maar discrimineert niet tussen de oorsprong van het DNA (apoptotic, necrotische, netten), en daarom niet zeer specifiek voor netten. Ten tweede enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) van DNA-complexvorm met NET-specifieke eiwitten, bijvoorbeeld myeloperoxidase (MPO) of neutrophil elastase (NE), een meer specifieke benadering te detecteren van netten en werden gedemonstreerd te correleren goed met citrullinated Histon-3 (CitH3) positieve netten13. Het is echter niet bekend of deze methode gevoelig genoeg is voor het halen van alle netten (b.v., MPO, NE, en CitH3 negatieve netten). Een derde benadering is immunofluorescentie microscopie die wordt gebruikt voor het detecteren van de co lokalisatie van NET-geassocieerde moleculen (NE, MPO, CitH3) met extracellulaire DNA te kwantificeren van netten. Deze methode is in het algemeen specifiek voor netten, maar het kan niet worden toegepast als een hoge-doorvoer-methode en is niet doelstelling als gevolg van de waarnemer bias. Bovendien, houdt deze methode niet rekening MPO-, NE-, CitH3-negatieve netten die zich vaak ophouden afhankelijk van het gebruikte NET-trigger14,15. Stroom cytometry benaderingen detecteren netten via een gewijzigde vooruit/zijwaartse scatter (FSC/SSC) met vermelding van de zwelling van de kern in NET-ting neutrofielen16. Deze methode houdt niet rekening te houden met de verschillende vormen van netto formatie die zijn geïdentificeerd, waarbij zwelling van de kern, zoals vitale netto vorming17niet mogelijk. Tot slot, immunofluorescentie confocale microscopie is toegepast om te visualiseren en te kwantificeren van netto vorming door direct kleuring extracellulaire DNA met een cel-ondoordringbare kleurstof die extracellulaire DNA12,18 vlekken. In het algemeen 5 tot 10 high-power velden zijn handmatig geplukt en beoordeeld, die betrekking heeft op 1-5% van elk putje van een 96-wells-plaat11,17. Handmatige selectie van afbeeldingen is niet altijd objectief, naar voren gebogen aan bias en niet aantrekkelijk voor high-throughput analyse. Een geautomatiseerde, hoge-doorvoer netto kwantificering assay werd onlangs ontwikkeld, die beeld 11% van de put op 3D-wijze die betrekking hebben op 13 µm door Z-gestapeld immunofluorescentie confocale microscopie, waardoor een zeer gevoelige techniek te beoordelen van netten vergeleken met de conventionele methoden10. Het huidige verslag beschrijft het meest recente protocol om te kwantificeren netto vorming door middel van een geautomatiseerde, zeer gevoelige bepaling met behulp van 3D confocale microscopie, die bereikt een verbeelde oppervlakte van 45% van elk putje en omvat 27 µm door Z-stacks. Dit protocol is geschikt om te kwantificeren, met een hoge gevoeligheid, lage niveaus van netto vorming op objectieve en onpartijdige wijze.

Protocol

Alle patiënten en gezonde controles toegestemd om deel te nemen in het LUMC biobank. Beide biobanking studies werden goedgekeurd door de ethische commissie van het LUMC.

1. isolatie van gezonde neutrofiele granulocyten

  1. 20 mL van perifeer bloed verkrijgen bij een gezonde donor in twee 10 mL EDTA-gecoate buizen.
  2. Zet van 10 mL bloed in de buis van een steriele 50 mL en voeg fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tot 32.5 mL.
  3. Dichtheid verloop (bijv.., densiteitgradiënt-amidotrizoaat) onder de cellen toevoegen.
    1. Duren 14 mL dichtheid gradiënt met een 10 mL pipet en Pipetteer controller.
    2. Plaats de pipet op de onderkant van de tube van 50 mL.
    3. Nemen van de controller van de pipet uit het pipet, zodat het verloop van de dichtheid te stromen uit de Pipetteer door de zwaartekracht, totdat het maximum door de capillaire werking bereikt is (1-2 mL blijft), zonder gebruik te maken van de motor.
    4. Pipetteer verwijderen door het plaatsen van een duim op de top van de pipet, waardoor de dichtheid verloop van lekken uit tijdens het verwijderen van de pipet.
  4. Draai de buizen voor 20 min op 912 x g en kamertemperatuur (RT) zonder versnelling of rem.
    Opmerking: Rode bloedcellen (RBC) en neutrofielen hebben een hoge dichtheid en zijn aan de onderkant van de tube van 50 mL. Perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) zijn gescheiden en op de top van het verloop van de dichtheid als een witte ring. PBS-verdund plasma zullen boven het PBMCs. Indien nodig, kunnen PBMCs door de overdracht van de witte ring aan een nieuwe tube van 50 mL met stappen van de extra wassen met PBS worden geïsoleerd.
  5. Verwijder voorzichtig de witte ring met PBMCs eerst, gevolgd door verwijdering van het PBS-verdund plasma en tot slot de dichtheid gradiënt laag zo veel mogelijk.
  6. Lyse isoleren neutrofielen van de neutrofiele/erytrocyten mix, erytrocyten door koude steriel gedistilleerd water.
    1. Neem koude steriel gedistilleerd water fles en een 10 x geconcentreerd PBS kolf uit de koelkast.
    2. Werk snel voor deze stap. Voeg 36 mL koud steriel gedistilleerd water rechtstreeks op de top van de pellet en meng eens zorgvuldig. Voeg 4 mL 10 x PBS na 20 s tot het maken van een isotone oplossing. Meng eens zorgvuldig.
    3. Draai de buis gedurende 5 minuten op 739 x g en 4 ° C (voor de verwijdering van RBC). Neutrofielen zal worden in de witte pellet.
    4. Zorgvuldig Verwijder het supernatant. Voer stap 1.6.2 opnieuw uit en zorg ervoor dat de pellet goed is geschorst.
    5. Spin buis voor 5 min op 328 x g - en 4 ° C.
    6. Zorgvuldig Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 5 mL PBS. Tellen van de neutrofielen en houd ze op het ijs.
      Opmerking: Verwachte opbrengst uit 1 buis van bloed (10 mL) is ongeveer 15-75 miljoen neutrofiele granulocyten.

2. de rode fluorescerende cel etikettering van neutrofiele granulocyten

  1. Maak een neutrofiele opschorting van 10-20 miljoen neutrofielen in 2 mL PBS in een tube van 15 mL.
  2. Maak een oplossing van 2 mL PBS met 4 µL van 2 µM rood fluorescerende cel linker (Zie Tabel van materialen) in een verschillende 15 mL-buis. Voeg dit zachtjes tot de neutrofiele schorsing en meng zorgvuldig.
  3. Incubeer in het donker gedurende precies 25 minuten bij 37 ° C op het etiket van de neutrofiele granulocyten met de linker rode fluorescerende cel.
  4. Inactivering van de etikettering door toe te voegen RPMI 1640 opslagmedium met 10% warmte geïnactiveerd foetale runderserum (FCS) op RT maximaal 15 mL en meng eens zorgvuldig. Zorg ervoor dat de pellet is zorgvuldig geresuspendeerde als een pellet heeft gevormd.
  5. Draai de buis gedurende 5 minuten op 328 x g en RT.
  6. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 5 mL fenol rood-vrije RPMI 1640 medium met 2% FCS en 10% P/S op RT. tellen de neutrofielen.
    Opmerking: Een cel verlies van 50% kan optreden na het rood fluorescerende cel etikettering.

3. de inductie van neutrofiele extracellulaire Trap vorming

  1. Maak een celsuspensie van 0,42 x 106 cellen/mL in fenol red gratis RPMI 1640 medium met 2% FCS en 10% P/S.
  2. Voeg 37.500 neutrofielen in 90 µL per putje in een zwarte 96-Wells, platte bodemplaat.
  3. Voeg 10 µL van de gekozen prikkel (bijv. de sera van patiënt) in drievoud tot een concentratie van 10% in de put. Omvat altijd een negatieve controle (medium) in drievoud.
  4. Incubeer in het donker bij 37 ° C gedurende de gewenste tijd, variërend van 30 minuten tot 2, 4 of 6 h. broeden voor 4 h wordt voorgesteld.
  5. Het volume berekenen die nodig zijn om toe te voegen van 25 µL van 5 µM ondoordringbare DNA kleurstof (Zie Tabel of Materials), om te bereiken een eindconcentratie van 1 µM in de put. Maak een predilution indien nodig in RPMI 1640 medium met 2% FCS en 10% P/S tot het verkrijgen van een concentratie van 5 µM.
  6. Voeg 25 µL van 5 µM ondoordringbare DNA kleurstof 15 min voor het eind van de incubatietijd. Blijven incubatie gedurende een ander 15 minuten bij 37 ° C in het donker.
  7. Verwijder het supernatant (~ 125 µL) zeer zorgvuldig en slaan indien nodig. Voeg 100 µL van 4% paraformaldehyde (PFA). Houd in het donker, en direct verder met stap 4.

4. netto visualisatie met 3D High-inhoud, High-resolution immunofluorescentie confocale microscopie

  1. De instellingen op de immunofluorescentie confocal microscoop door te klikken op de overname-instellingen configureren.
    1. Klik op het tabblad configureren .
    2. Selecteer het doel en de camera. Kies het 10 X Apo Lambda doel met een modus van de verwerving van een confocal 60 µm pinhole.
    3. Klik op plaat en kies de 96-Wells kunststof plaat. Selecteer de sites te bezoeken en kies een vast aantal sites. Vul 3 kolommen en 3 rijen zonder overlapping (0 µm), die betrekking hebben op een totaal van 45% van de put.
    4. Klik op overname. Selecteer inschakelen Laser gebaseerde gericht. Selecteer Verwerven Z serie/tijdreeksen indien nodig.
    5. Klik op Site-Autofocus.
      1. Klik op de Focus op de bodem plaat | Off-Set door de dikte van de bodem. Voor de eerste put te vinden van het monster, kies de eerste put aangeschaft. Kiezen voor de autofocus van de site, alle sites.
    6. Klik op golflengten.
      1. Voor het aantal golflengtes, 2 te kiezen. Voor het TL arcering verfijning correctie niveau, 2 te kiezen.
      2. Selecteer voor golflengte 1, Texas Red.
        1. Voor de autofocus opties, selecteer laser met Z offset, post laser verschuiving 1.1 µm. gebruik Z-stack met een aangepast bereik van 200-10.
      3. Selecteer voor golflengte 2, FITC.
        1. Voor de autofocus opties, selecteer laser met Z offset vanaf w1 0 µm. gebruik Z-stack met een aangepast bereik van 200-10.
        2. Voor de opties van de overname, door Z-serie en 2D-projectie afbeelding maximaal te selecteren. Selecteer bij de opties voor overname Shading Correction | Uit.
    7. Selecteer Z-serie. Selecteer het aantal stappen: 10. Selecteer de stap-grootte: 3 mm (totaal bereik zullen 27 µm).
  2. Zet de plaat in de immunofluorescentie confocal microscopie.
    1. Klik op het tabblad uitvoeren .
      1. Vul plaat naam en beschrijving en kies de opslaglocatie.
      2. Selecteer de putten die moeten worden verworven.
  3. Kies belichtingstijd voor Texas rood en FITC.
  4. Klik op Verwerven plaat om te beginnen met de overname, die ongeveer 1 uur per plaat duurt.

5. analyse van netto vorming

  1. Gebruik een programma ontworpen voor analyse van wetenschappelijke multidimensionele beelden (Zie Tabel of Materials) voor het analyseren van netto vorming voor beeldverwerking.
  2. Overdracht van de verworven afbeeldingsgegevens op een aparte harde schijf.
  3. Selecteer de kleur toe te voegen gereedschap.
    1. Selecteer w1 en kiest u de map op de harde schijf waar de gegevens worden opgeslagen.
    2. Selecteer w2 en kiest u de map op de harde schijf waar de gegevens worden opgeslagen.
      Opmerking: Gebruik een standaarddialoogvenster voor macrovirussen die w1 gebruikt in de bestandsnaam rode kleur toevoegen aan de Texas Red beelden en w2 groene kleur toevoegen aan de FITC-beelden gebruikt.
  4. Kies analyse Macro.
    1. Selecteer w1, kiest u de drempelwaarde (intensiteit drempel), die meestal 10. Selecteer de gewenste pixelwaarde (grootte drempel, bijvoorbeeld 100).
    2. Selecteer w2, kiest u de drempelwaarde (intensiteit drempel), die meestal 10. Selecteer de gewenste pixelwaarde (grootte drempel, bijvoorbeeld 500).
    3. Kies de bestemming voor het werkbladbestand, analyse uitvoeren en daarna logboekbestanden opslaan.
  5. Analyseren van gegevens in een werkblad.

Resultaten

Neutrofiele extracellulaire val (NET) vorming wordt gekwantificeerd in een 3D-wijze door het kwantificeren van gebeitst extracellulaire DNA over 10 Z-stacks met 3 µm afstand vanaf om het brandvlak in elk putje. Door de cumulatieve oppervlakte, de gevoeligheid van de verhogingen van de assay (figuur 1A) te meten. De geïsoleerde neutrofiele granulocyten hebben een gemiddelde zuiverheid van 98,7 procent standaarddeviatie (SD) van 1,10% gemeten in 14 verschillende monsters van verschillende isolatie. Het gemiddelde percentage rode bloedcellen is 1,04% ± 1,1% SD en het gemiddelde percentage van monocyten 0.085% ± 0,17% SD (gegevens niet worden weergegeven). De totale oppervlakte van gekleurd neutrofielen beeld zijn gekwantificeerd alleen in het brandvlak in elk putje, die correleren sterk met de totale neutrofiele telling in elk putje met een Pearson-correlatiecoëfficiënt van 0,99 (95% betrouwbaarheidsinterval [CI] 0.985-0.997, p < 0.0001) (figuur 1B). De representatieve resultaten van kwantificering van netto vorming in neutrofielen gestimuleerd met 10% sera van AAV patiënten of medium (MED) als een negatieve controle, uitgedrukt als cumulatieve gebrandschilderde extracellulaire DNA-gebied meer dan 10 Z-stacks per verbeelde neutrofiele (figuur 1 C). Snapshots van representatieve beelden van ongestimuleerde neutrofiele granulocyten (figuur 2A) en van de netten in de AAV-gestimuleerd neutrofiele granulocyten (figuur 2B) worden weergegeven.

figure-results-1
Figuur 1: kwantificering van netto vorming door het meten van extracellulaire DNA en neutrofiele graaf. (A) gebied is cumulatief gekwantificeerd over de 10 Z-stacks voor elk goed voor ongestimuleerde neutrofiele granulocyten (MED) en neutrofielen gestimuleerd met 10% serum van ANCA-geassocieerde vasculitis (AAV) patiënten (n = 4) gekwantificeerd met een programma van de beeldverwerking. Elke stimulans werd getest in drievoud, elk punt de mediane waarde vertegenwoordigt. (B) rood fluorescerende gelabelde cel gebied en cel tellen in het brandvlak van elk putje werden gekwantificeerd door de beeldverwerking programma (R2 = 0,99, p < 0.0001). (C) netto vorming wordt uitgedrukt als cumulatieve oppervlakte per verbeelde neutrofiele (cel gebied). De gemiddelde ± standaardafwijking van het gemiddelde (SEM) van elke drievoud is uitgezet per stimulans. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-2
Figuur 2: momentopnamen van netto kwantificering assay. Fluorescerende gelabelde neutrofielen worden weergegeven in het rood, en gebeitst extracellulaire DNA wordt weergegeven in het groen. 10 x Plan Apo Lambda doelstelling. (A) ongestimuleerde neutrofielen. (B) neutrofielen gestimuleerd met AAV serum. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussie

Het meest kritische deel van deze bepaling is de noodzaak om vers geïsoleerde neutrofielen voor elk experiment omdat neutrofielen kortstondige zijn en sterven wanneer bevroren. Dit vereist een gezonde donor die telkens weer andere, sommige variaties als gevolg van de kenmerken van de donor kan betrekken. Een van deze variaties is de status van de activering van de neutrofielen. Neutrofielen kon al in vivo voorafgaand aan isolatie worden geactiveerd. Bovendien, neutrofielen kunnen worden geactiveerd tijdens de stappen van isolatie met name tijdens lysis van de erythrocyten, daarom een ervaren handler van neutrofielen is vereist om te minimaliseren van de activering van neutrofielen. In het algemeen, isolatie van neutrofielen dient te worden uitgevoerd zo spoedig mogelijk na bloed tekenen en het experiment moet niet worden onderbroken om te voorkomen dat buitensporige spontane activering. Ten tweede, ruwe behandeling van neutrofielen moet worden vermeden. Als zodanig is het bekende voordeel van het beschreven protocol de minimale pipetting interventies zodra neutrofielen worden overgeënt in een 96-wells-plaat. Nog belangrijker is, wordt de status van de activering van de neutrofielen best beoordeeld in de ongestimuleerde voorwaarde waarin deze bepaling gevoelig lage niveaus van netto vorming kan detecteren. Een andere factor die de bepaling kan beïnvloeden is het gebruik van FCS in het medium. Het percentage van FCS is verlaagd van 10% tot 2% om te voorkomen dat de mogelijke afschaffing van netto vorming door anti-oxidant activiteit19,20 of de mogelijke activering van de neutrofielen ondanks warmte inactivatie. Cultuur zonder FCS of met het gebruik van verschillende types van media is nog niet uitgeprobeerd. Een ongestimuleerde of middelgrote controle is altijd meegenomen bij het uitvoeren van de bepaling dat een indicatie van het signaal van de achtergrond (bijvoorbeeld, status van de activering van de neutrofielen). De-voudige toename voor elke stimulans in vergelijking met het ongestimuleerde monster wordt weergegeven om consistente resultaten over verschillende experimenten met behulp van de dezelfde stimulus.

Een belangrijke factor voor een mogelijk hoge achtergrond is kleuring van extracellulaire DNA dat niets te maken met het proces van de vorming van de netto. De huidige bepaling geprobeerd te verminderen dit doordat de extracellulaire DNA kleuring onmiddellijk na de korte incubatietijd van 15 min en door het analyseren van de plaat direct na fixatie. Daarom is het essentieel om te gebruiken een geavanceerde confocal microscoop met voldoende snelheid en analytische kracht te vangen van de 96-wells-plaat binnen 1 tot 2 h. automatische instelling van de blootstellingstijd en de focus wordt aanbevolen. Als zodanig, is de instelling van de microscoop kan variëren tussen elk monster en experimenteren met betrekking tot de kleurdrempel intensiteit die nodig voor de algehele optimale beeldkwaliteit is. De laatste invloeden het uiteindelijke vermogen om correct te kwantificeren neutrofielen en netten en de optimale instelling moet derhalve worden bevestigd met behulp van meerdere controlemonsters (bijvoorbeeld serum van gezonde controles). Tijdens de analyse van opnames zorgt het gebruik van een pixel drempel en de drempel voor grootte in de analyseprogramma voor een betere selectie van netto vorming.

Extracellulaire DNA afgeleid van netto vorming kunnen het resultaat van verschillende dood trajecten, met inbegrip van NETosis, necroptosis, pyroptosis, ferroptosis of zelfs niet-lytische proces van vitale netto vorming1. Als zodanig is een beperking van de huidige bepaling dat door kleuring alleen voor extracellulaire DNA er geen onderscheid gemaakt tussen netto vorming en andere relevante cel dood trajecten mogelijk wordt. Het is mogelijk om dit te bereiken door gebruik te maken van beide selectieve inhibitors van verschillende dood opleidingstrajecten te discrimineren tussen de verschillende vormen die netto vorming of de aanwezigheid van specifieke netto markers, zoals citH3 en NE, door aparte immunostainings te bevestigen Co gelokaliseerd met DNA. De co lokalisatie van extracellulaire DNA met citH3 en NE heeft onlangs bevestigd voor deze bepaling10. Het voordeel van het vermijden van netto specifieke markers in deze test, toestaat om te beoordelen alle vormen van netto vorming leidde tot de extrusie van DNA door neutrofiele granulocyten zo volledig en zo objectief mogelijk met de mogelijkheden van high-throughput screening. De toepasselijkheid van dit protocol is gebleken bij het bestuderen van lage niveau netto inductie gemedieerd door immuuncomplexen in auto-immuun ziekte waarin de mogelijkheid om te detecteren van kwalitatieve en kwantitatieve verschillen misschien wel belangrijker dan het soort proces betrokken10,21,22. Illustreren dat deze roman netto kwantificering assay voor verschillende onderzoekers te onderzoeken van verschillende aspecten van de vorming van de netto toegevoegde waarde kan zijn. Kleine aanpassingen aan de bepaling zijn eenvoudig toe te passen: aanpassing van de stimulatie-periode, het gebruik van een favoriete netto marker te concentreren op één specifieke dood traject leidt tot de vorming van de netto, het gebruik van een verschillende vergroting of het gebruik van verschillende netto criteria in de kwantificering en analyse.

Kortom, is het protocol geboden een zeer gevoelige breed toepasbare assay voor de semi-automatische kwantificering van netto formatie voor de evaluatie van ex vivo inductie van netten op verschillende stimuli.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Het werk van Eline J. Arends en Y.K. Onno Teng wordt ondersteund door de Nederlandse Kidney Foundation (17OKG04), klinische Fellowship van de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijkonderzoek (90713460). Laura S. van Dam werk wordt ondersteund door de Foundation for Research in Reumatologie (FOREUM).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Aqua Sterile H2OB. Braun, Melsungen, Germany12604052
Fetaal bovien serum (FCS)Bodinco, Alkmaar, NederlandIn hoge concentraties kan het de NET-vorming beïnvloeden
Ficoll 5,7% - amidotrizoaat 9% dichtheid 1,077 g/mLLUMC, Leiden, Nederland97902861
Immunofluorescence confocale microscoopImage Xpress Micro Confocal (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)
Neutralisatie PBS (10x)Gibco, Paisley, UK70011-036
Penicilline/streptomycine (p/s)Gibco, Paisley, UK15070063
Fenolrode vrije RPMI 1640 (1x)Gibco, Paisley, UK11835-063Fenolrood kan interfereren met het immunofluorescence signaal
Fosfaatgebufferde saline (PBS)B. Braun, Melsungen, Germany174628062
PKH26 2 μM Rode fluorescente cel linkerSigma Aldrich Saint-Louis, MO, USAPKH26GL-1KTPKH zijn gepatenteerde fluorescente kleurstoffen en een cellabelingtechnologie vernoemd naar hun ontdekker Paul Karl Horan
Programma voor wetenschappelijke multidimensionale beeldanalyseImageJ, Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA
RPMI medium 1640 (1x)Gibco, Paisley, UK52400-025
Sytox groen 5 mM Impermeable DNA kleurstofGibco, Paisley, UK57020
Trypanblauw kleurstof 0,4%Sigma Aldrich, Germany17942E
96 wells, zwarte, platte bodem, voor weefselkweek behandelde plaatFalcon, NY, USA353219

Referenties

  1. Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. Programmed cell death as a defence against infection. Nature Reviews Immunology. 17 (3), 151-164 (2017).
  2. Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases? World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).
  3. Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).
  4. Garcia-Romo, G. S., et al. Netting neutrophils are major inducers of type I IFN production in pediatric systemic lupus erythematosus. Science Translational Medicine. 3 (73), 73ra20(2011).
  5. Lande, R., et al. Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus. Science Translational Medicine. 3 (73), 73ra19(2011).
  6. Meng, H., Yalavarthi, S., et al. In Vivo Role of Neutrophil Extracellular Traps in Antiphospholipid Antibody-Mediated Venous Thrombosis. Arthritis & Rheumatology. 69 (3), 655-667 (2017).
  7. Desai, J., et al. Particles of different sizes and shapes induce neutrophil necroptosis followed by the release of neutrophil extracellular trap-like chromatin. Scientific Reports - Nature. 7 (1), 15003(2017).
  8. Desai, J., et al. PMA and crystal-induced neutrophil extracellular trap formation involves RIPK1-RIPK3-MLKL signaling. European Journal of Immunology. 46 (1), 223-229 (2016).
  9. Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases. Nature Reviews Rheumatology. , (2018).
  10. Kraaij, T., et al. A novel method for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps reveals ROS-independent NET release with immune complexes. Autoimmunity Reviews. 15 (6), 577-584 (2016).
  11. Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
  12. Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413(2012).
  13. Nakazawa, D., et al. Enhanced formation and disordered regulation of NETs in myeloperoxidase-ANCA-associated microscopic polyangiitis. Journals of the American Society of Nephrology. 25 (5), 990-997 (2014).
  14. Konig, M. F., Andrade, F. A Critical Reappraisal of Neutrophil Extracellular Traps and NETosis Mimics Based on Differential Requirements for Protein Citrullination. Frontiers in Immunology. 7, 461(2016).
  15. Kenny, E. F., et al. Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways. Elife. 6, (2017).
  16. Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).
  17. Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. The Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
  18. Tanaka, K., et al. In vivo characterization of neutrophil extracellular traps in various organs of a murine sepsis model. PLoS One. 9 (11), e111888(2014).
  19. Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 176 (2), 231-241 (2007).
  20. von Köckritz-Blickwede, M., Chow, O., Nizet, V. Fetal calf serum contains heat-stable nucleases that degrade neutrophil extracellular traps. Blood. 114 (25), 5245-5246 (2009).
  21. Kraaij, T., et al. Excessive neutrophil extracellular trap formation in ANCA-associated vasculitis is independent of ANCA. Kidney International. , (2018).
  22. Kraaij, T., et al. The NET-effect of combining rituximab with belimumab in severe systemic lupus erythematosus. Journal of Autoimmunity. , (2018).
  23. Hahn, J., Schauer, C., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps resolve inflammation by proteolysis of cytokines and chemokines and protection from antiproteases. The FASEB Journal. (Aug 21), (2018).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Neutrofiele extracellulaire trapsassay voor NET vorminghigh throughput NET kwantificeringdriedimensionale immunofluorescentieconfocale microscopieisolatie van neutrofielendichtheidsgradi ntcentrifugatierood fluorescerende cellinkerimpermeabele DNA kleurstofz stack analyse
Een High-throughput Assay voor het beoordelen en kwantificeren van neutrofiele extracellulaire Trap vorming
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.