Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Remming van de groei van de Aspergillus flavus en aflatoxine productie in transgene maïs uiten van de α-amylase Inhibitor van Lablab purpureus L.

9.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59169

⸱

15 februari 2019

 ,  ,  ,  , 
1Southern Regional Research Center, USDA-ARS, Food and Feed Safety Research Unit, 2Department of Plant Pathology, University of Arkansas

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om Aspergillus flavus groei en productie van aflatoxine in maïs kernels uiting van een antischimmel eiwit te analyseren.  Met behulp van een stam GFP-uiten A. flavus bewaakt we de infectie en de verspreiding van de schimmel in volwassen kernels in real-time. De bepaling is snel, betrouwbaar en reproduceerbaar.

Samenvatting

Van verontreiniging met aflatoxinen in levensmiddelen en diervoeders gewassen is een grote uitdaging wereldwijd. Aflatoxinen, geproduceerd door de schimmel Aspergillus flavus (A. flavus) zijn krachtige carcinogenen zijn die aanzienlijke vermindering van de waarde van het gewas in maïs en andere gewassen olie rijk zoals pinda naast ernstige bedreiging voor de gezondheid van mens en dier. Verschillende benaderingen, met inbegrip van traditionele fokken, transgene uiting van weerstand geassocieerde eiwitten en RNA-interferentie (RNAi)-gebaseerde host-geïnduceerde gene monddood maken van kritische A. flavus gene doelstellingen, worden geëvalueerd om te vergroten aflatoxine resistentie bij gevoelige gewassen. Afgelopen studies hebben aangetoond dat een belangrijke rol van α-amylase in A. flavus pathogenese en aflatoxine productie, suggereert dit gen/enzym is een potentieel doelwit zowel A. flavus groei en aflatoxine productie te verminderen. In dit opzicht werd de huidige studie uitgevoerd om te evalueren van heterologe expressie (onder controle van de constitutieve CaMV 35S promotor) van een Lablab purpureus L. α-amylase Inhibitor van de omwenteling-achtige eiwitten (AILP) in maïs tegen A. flavus. AILP is een 36-kDa proteïne, die een concurrerende Inhibitor van A. flavus α-amylase enzym en behoort tot de familie van de eiwitten lectine – arcelin – α-amylase-remmer gemeen Boon. In vitro onderzoek voorafgaand aan de lopende werkzaamheden had aangetoond de rol van AILP in remming van A. flavus α-amylase activiteit en de groei van zwammen. De groei van zwammen en aflatoxine productie in volwassen kernels werden gevolgd in real time via een uiting van het GFP A. flavus stam. Deze kernel screening test (KSA) is zeer eenvoudig op te zetten en biedt betrouwbare en reproduceerbare gegevens over infectie en de mate van verspreiding, die kan worden gekwantificeerd voor evaluatie van kiemplasma en transgene lijnen. De fluorescentie van het GFP-stam is nauw gecorreleerde aan schimmel groei en in het verlengde daarvan, het is goed gecorreleerd aan aflatoxine waarden.  Het doel van het huidige werk was om deze voorkennis in een commercieel belangrijk gewas als maïs om aflatoxine weerstand te verhogen. Onze resultaten tonen een korting van 35% – 72% in A. flavus groei in AILP-uiten transgene maïs kernels die, beurtelings, vertaald in 62%-88% vermindering aflatoxine.

Inleiding

Mycotoxine besmetting door de schimmel geslachten, Aspergillus, Fusariumen Penicillium, Alternaria is een groot probleem van voedsel en diervoeders geteelde gewassen wereldwijd1,2,3. Onder deze plantpathogene schimmels heeft Aspergillus het hoogste nadelige effect op de waarde van het gewas en de gezondheid van mens en dier. Aspergillus flavus (A. flavus) is een opportunistische plant pathogenen die olie rijk gewassen zoals maïs-, katoenzaad- en pinda infecteert en produceert de potente kankerverwekkende stoffen, aflatoxinen, evenals talrijke giftige secundaire metabolieten (SMs). Maïs is een belangrijk voedsel en diervoeders gewas geteeld wereldwijd en is zeer gevoelig voor besmetting door A. flavus. De economische impact van de aflatoxineverontreiniging op verliest en lagere waarde in maïs kunnen maar liefst $686.6 miljoen per jaar in de VS2 met voorspelde veranderingen in het wereldklimaat, de impact van aflatoxinen kan leiden tot grotere economische verliezen in maïs met schatting zo hoog als $1,68 miljard per jaar in de nabije toekomst2. Gezien de negatieve effecten van de economische en de gezondheid van aflatoxinen in mens en vee, misschien controle van de wachttermijnen tot de oogst aflatoxine in maïs wel de meest efficiënte manier ter voorkoming van verontreiniging met aflatoxinen in levensmiddelen en diervoeders.

De aanpak van de grote wachttermijnen tot de oogst controle voor aflatoxine resistentie in maïs die uitgebreid in de afgelopen decennia is gebruikt is voornamelijk door het kweken, waarvoor een aanzienlijke hoeveelheid tijd4. Biocontrol had onlangs, heeft enig succes in vermindering van aflatoxine in grote schaal veld toepassingen5,6. Naast biocontrol heeft toepassing van geavanceerde moleculaire tools zoals 'Host geïnduceerde Gene Silencing' (HIGS) door middel van RNAi en transgene expressie van weerstand-geassocieerde eiwitten enig succes in vermindering van A. flavus groei en aflatoxine productie in kleine schaal laboratorium en veld studies. Deze benaderingen zijn momenteel naast het identificeren van nieuwe A. flavus gene doelwit voor toekomstige manipulatie wordt geoptimaliseerd.

Naast genen die rechtstreeks bij mycotoxine productie als doelwit van transgene bestrijdingsstrategieën betrokken zijn, is schimmel amylasen aangetoond dat ze spelen een cruciale rol bij het handhaven van succesvolle pathogenese en mycotoxine productie tijdens de vroege stadia van host plant infectie. Een paar voorbeelden zijn Pythium pleroticum (causale agent van gember rizoom rot), Fusarium solani (causale agent van bloemkool verwelken), waar positieve correlaties tussen pathogeniteit en α-amylase expressie en activiteit werden waargenomen 7,8. Remming van de activiteit van de α-amylase gen knock-out of vechtpartij benaderingen beïnvloedt negatief schimmel groei en toxine productie. Een α-amylase knockout mutant van A. flavus kon produceren van aflatoxinen als volwassen op zetmeel substraat of degermed maïs kernels9. Evenzo, Fusarium verticillioides een α-amylase knockout stam niet produceren fumonisine B1 (mycotoxine) tijdens de infectie van maïs kernels10. In een meer recente studie, Gilbert et al. (2018) aangetoond dat een RNAi gebaseerde knock down van A. flavus α-amylase meningsuiting via HIGS aanzienlijk verminderd A. flavus groei en aflatoxine productie tijdens maïs kernel infectie11 .

Specifieke remmers van α-amylase activiteit hebben ook soortgelijke resultaten opgeleverd, zoals down-regulatie van α-amylase expressie verkregen. Het eerste verslag over de rol van een α-amylase-remmer in schimmel weerstand kwam uit de isolatie en de karakterisering van een 14-kDa trypsine-α-amylase-remmer van maïs resistent tegen A. flavus12lijnen. Verder screening van honderden plantensoorten door Fakhoury en Woloshuk leidde tot de identificatie van een 36-kDa α-amylase Inhibitor van de omwenteling-achtige eiwitten (AILP) uit de zaden van de hyacint bonen, Lablab purpureus L.13. De volgorde van de peptide van de AILP leek op lectines behorend tot de familie van de lectine-arcelin-α-amylase-remmer gemeld gemeen bean14,15. Gezuiverde AILP doet niet elke inhiberende activiteit naar zoogdieren trypsine en verder in vitro karakterisering toonde significante remming van de groei van A. flavus en conidial kiemkracht13vertonen. De verslagen hier duidelijk toont α-amylase kan dienen als een doel in controle benaderingen te beperken van pathogenen of plagen die afhankelijk zijn van zetmeel mobilisatie (via α-amylase activiteit) en verwerving van oplosbare suikers als energiebron tijdens hun pathogene interactie met waardplanten.

Alpha-amylase is bekend om zijn kritische in A. flavus pathogeniteit9,10,11, en gezien het belang van AILP als een krachtige anti-A. flavus agent (α-amylase remming/antigrowth)13, We genereerden transgene maïs planten uitdrukken Lablab AILP gen onder de constitutieve CaMV 35S promotor. Het doel was om te onderzoeken als heterologe expressie van deze α-amylase-remmer in maïs effectief tegen A. flavus pathogenese en aflatoxine productie tijdens maïs kernel infectie is. Onze resultaten tonen aan dat transgene maïs kernels uiting van AILP aanzienlijk verminderd A. flavus groei en aflatoxine productie tijdens kernel infectie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. plasmide constructies en maïs transformatie

  1. PCR versterken Lablab AILP invoegen met behulp van de inleidingen 5'-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 'en 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3'. De PCR voorwaarden omvatten een eerste denaturatie stap bij 98 ° C gedurende 30 s (stap 1), gevolgd door denaturatie bij 98 ° C gedurende 10 s (stap 2), gloeien bij 55 ° C gedurende 30 s (stap 3), rek bij 72 ° C gedurende 20 s (stap 4), 31 cycli van stap 2 naar stap 4 , en een definitieve rek stap bij 72 ° C gedurende 5 min. kloon het PCR-product in een gewijzigde pCAMBIA 1.300 vector met behulp van de Xbaik en Pstik beperkingsplaatsen. Het volgnummer van de laatste plant bestemming vector om te bevestigen de oriëntatie en de volgorde van de gekloonde AILP gen in de vector.
  2. Transformeren Agrobacterium stam EHA101 met de definitieve vector construct (Figuur 1) als eerder beschreven 16.
  3. Gebruik getransformeerd Agrobacterium met de laatste plant bestemming vector te transformeren van onrijpe maïs (Zea mays L. Hi-II) embryo's (uitgevoerd op de Plant transformatie faciliteit van Iowa State University) 16.
  4. T0 planten groeien in de kas (26-29 ° C; 16/8 h fotoperiode aangevuld met hogedruk nb-lampen) en herhaaldelijk self-pollinate om te verkrijgen T6 generatie om homozygosity voor de transgene karaktertrek.

2. spore kiemkracht assay

  1. Blad monsters oogsten en opslaan bij-80 ° C. Fijn blad monsters met een mortier en een stamper met behulp van vloeibare stikstof. Weeg 0,5 g in 2 mL microcentrifuge buizen, voeg 17 µL van proteaseinhibitor en buizen te plaatsen op het ijs.
  2. Buizen voor 10 min bij 16.000 x gcentrifugeren. Breng 225 µL van plant extract 0,5 mL microcentrifuge buizen en plaats op ijs.
  3. Maak een suspensie van de spore 5 mL van Aspergillus flavus 70 – GFP in 1% aardappel dextrose Bouillon (w/v) in een centrifugebuis 15 mL. Vortex en spore concentratie tot 105 sporen/mL met een haemocytometer aan te passen.
    Let op: A. flavus produceert aflatoxinen, all work met deze schimmel moet worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast.
  4. Incubeer in VOB bij 28 ° C tot cultuur 50% inleiding van spore kiemkracht behaalt zoals aangegeven door de bolling van sporen.
  5. Vortex en aliquoot 25 µL spore oplossing voor de 225 µL plant extract. Incubeer monsters gedurende 20 uur bij 28 ° C met intermitterende schudden.
  6. Aliquot 25 µL van spore oplossing op een microscoopglaasje en meet de lengte van de kiem buizen sporen met behulp van de software van de digitale camera. Gebruik een minimum van 20 replicate metingen voor elke regel.
    Opmerking: In dit stadium plaats alle culturen bij 4 ° C om kolonie groei tot klaar om te tellen te stoppen.

3. kernel Screening Assay (KSA)

  1. KSA caps construeren door lijmen 4 module caps (22 mm) in een petrischaal 60 x 15 mm. Lijm gedurende 48 uur drogen voordat u caps is toegestaan. Elk KSA cap vormt een rep. (Figuur 2).
  2. In een steriele biologische veiligheidskast, spray een vierkante bioassay lade (24 x 24 cm) met 70% ethanol: H2O (v/v) en laat lucht drogen. Toevoegen steriele chromatografie papier in de lade. Spray 9 KSA caps met 70% ethanol, laat de lucht drogen, en in de bioassay lade plaatsen.
  3. Voor elke transgene maïs regel wordt getest, selecteer 20 onbeschadigd kernels en plaatst in een centrifugebuis 50 mL. Voeg 70% ethanol en laat 4 minuten zitten. Schud zachtjes buizen tijdens sterilisatie. Giet af de ethanol en spoel kernels driemaal in steriel gedeïoniseerd H2O.
  4. Maak een suspensie van de spore van Aspergillus flavus 70 – GFP17 uit een 6 dag oude cultuur geteeld op de drager van de V8 (5% V8 sap, 2% agar, pH 5.2).
    1. Voeg 20 mL steriele 0,02% Triton X-100/gedeïoniseerd H2O (v/v) en schroot uit sporen met een steriele lus. Pipetteer af de plaats in een steriele bekerglas van 300 mL en het entmateriaal.
    2. Maak een 5-fold verdunning met 0,02% Triton X-100, voer een spore count en voorzien van een haemocytometer. Verdun weer eventueel te verkrijgen met een concentratie van 4 x 106 sporen/mL 100 mL.
  5. Plaats de pitten in een steriele 300 mL-bekerglas met een roer-bar. Entmateriaal toevoegen aan het bekerglas.
    Let op: Het toevoegen van kernels aan entmateriaal tot oplossing voor splash. Plaats het bekerglas op een bord roer gedurende 3 minuten. Na 3 minuten, giet af entmateriaal in een bekerglas van leeg.
  6. Plaats met een pincet, kernels in de bioassay schotel (1 kernel/cap). Voeg 30 mL gedeïoniseerd water naar de bodem van elke bioassay-lade en Incubeer bij 31 ° C in het donker gedurende 7 dagen.
  7. Bereiden kernels voor fotografie.
    1. Gereserveerd 4 pitten van elke regel voor microscopische analyse en fotografie.
      Opmerking: Kernels kunnen worden achtergelaten bij 4 ° C niet langer dan 5 dagen vóór de voltooiing van de fotografie.
    2. Neem foto's van de kernels na zeven dagen na inoculatie met A. flavus (Figuur 3).
    3. Schone buitenkant van kernels met een zacht weefsel en gedeïoniseerd water. Het uitvoeren van de longitudinale secties voor kernels en direct fotograferen onder de fluorescente microscoop.
  8. Bereiden kernels voor analyse.
    1. Schone buitenkant van resterende kernels met een zacht weefsel en gedeïoniseerd water.
    2. Plaats 4 pitten, vormen 1 rep, in een 15 mL schroefdop polycarbonaat ampul met 2 roestvast stalen ballen. Onmiddellijk bevriezen flesjes in vloeibare stikstof en winkel bij-80 ° C tot verdere verwerking en analyse.
    3. Verwijderen van flesjes uit de diepvries-80 ° C en vermalen kernels in een homogenizer bij 1500 t/min gedurende 3 minuten.
      Opmerking: Houd kernels met vloeibare stikstof bevroren.

4. PCR screening van transgene maïs kernels

  1. DNA isolatie kit gebruiken om te isoleren genomic DNA (gDNA) van verpulverde maïs kernels besmet met A. flavus volgens de instructies van de fabrikant. Kort, 280 µL buffer F, 20 µL protease en 3 µL dithiothreitol (DTT) toevoegen aan 10-15 mg van verpulverde maïs kernels. Incubeer en schudden in een thermomixer (56 ° C, 1200 rpm, 30 min). Centrifugeer bij 10.000 x g voor 1 min en overdracht van het supernatans dat duidelijk aan geëquilibreerd kolom. Incubeer bij kamertemperatuur voor 3 min en centrifuge bij 700 x g gedurende 1 minuut te elueren gDNA.
  2. Neem 0.8 µL van uitgepakte gDNA instellen op een 20 µL PCR reactie voor elk monster met behulp van een PCR-kit. Volg thermocycling voorwaarden zoals aanbevolen in het protocol van de fabrikant. De PCR voorwaarden omvatten een eerste denaturatie stap bij 98 ° C gedurende 5 min (stap 1) gevolgd door denaturatie bij 98 ° C gedurende 5 s (stap 2), gloeien bij 55 ° C gedurende 5 s (stap 3), rek bij 72 ° C gedurende 20 s (stap 4), 40 cycli van stap 2 naar stap 4 , en een definitieve rek stap bij 72 ° C gedurende 1 min (stap 5).
  3. Voorwaartse primer 5'-TATACCACCCCCATCCGTGT-3 gebruikt ' en reverse primer 5'-AGCTCGGAAGCAAAAGACCA-3' ter bevestiging van de aanwezigheid van de Lablab AILP gen in de transgene maïs kernels.

5. isolatie van de RNA, cDNA synthese en semi-kwantitatieve RT-PCR

  1. Neem gehomogeniseerd A. flavus besmet maïs kernels eerder opgeslagen bij-80 ° C voor RNA extractie. Pak met behulp van een totaal RNA isolatie kit volgens protocol van de fabrikant maar met kleine wijziging18RNA. Na het toevoegen van 50 mg gehomogeniseerde maïs kernel poeder in de buffer van de extractie, meng dit goed (zonder vortexing) met behulp van een 1 mL pipet tip en laat het op ijs voor 5-6 minuten voordat u verdergaat naar latere stappen zoals beschreven in het protocol van de fabrikant.
  2. CDNA met behulp van een cDNA synthese kit volgens de fabrikant protocol 18voor te bereiden.
  3. 0,5 µL van onverdunde cDNA per PCR reactie voor semi-kwantitatieve RT-PCR gebruikt als eerder beschreven18. Gebruik van de voorwaartse en omgekeerde inleidingen qAILP-F 5'-TCCCAACAAGGCAACTACTG-3' en qAILP-R 5' - CGGTGTCGAAGAGACCTAGATA - 3' respectievelijk te detecteren Lablab AILP genexpressie, en forward en reverse van inleidingen qRib-F 5ʹ-GGCTTGGCTTAAAGGAAGGT-3ʹ en qRib-R 5ʹ-TCAGTCCAACTTCCAGAATGG-3ʹ respectievelijk voor expressie van maïs ribosomal structurele gen (Rib), GRMZM2G024838,19 als een huis-houden-gen.

6. GFP kwantificatie

  1. Bereiden van 50 mL elk van 0,2 M monobasisch natriumfosfaat (NaH2PO4) en dibasische natriumfosfaat (nb2HPO4·7H2O) van 0.2 M in gedeïoniseerd H2O.
  2. 100 mL fosfaatbuffer pH 7.0 Sorenson van make-up. Voor pH 7.0, 19.5 mL NaH2PO4 voorraad, 30,5 mL NaHPO4·7H2O voorraad en 50 mL gedeïoniseerd H2O. toevoegen
  3. Weeg 25 mg grond kernel materiaal (vers gewicht, FW) en plaats in een tube van 1,0 mL microcentrifuge. 500 µL fosfaatbuffer toevoegen aan de centrifugebuis en vortex voor 30 s.
  4. Monsters gedurende 15 minuten bij 16.000 x gcentrifugeren. Pipetteer 100 µL bovendrijvende substantie in een zwart 96 goed plaat. Lees de monsters met een Fluorimeter (excitatie 485 nm, emissie 528 nm).

7. totale gehalte aan aflatoxine analyse

  1. Monster verwerking en aflatoxine extractie
    1. Droge kernel monsters in een geforceerde lucht oven voor 2 dagen bij 60 ° C. Weeg monsters en breng in een 50 mL erlenmeyerkolf met een glazen stop.
    2. Voeg 25 mL methyleenchloride aan elke maatkolf in een zuurkast.
      Let op: Methyleenchloride is zeer vluchtig en wordt beschouwd als gevaarlijke (irriterende, kankerverwekkend). Noch latex als nitril handschoenen zijn veilig voor het werken met methyleenchloride. VERBETERDE organisch oplosmiddel bestendige PolyVinylAlcohol handschoenen te gebruiken.
    3. Schud de monsters gedurende 30 minuten op een pols actie shaker. Na 30 min, giet langzaam het extract door een cirkel gecanneleerde filtreerpapier in een bekerglas van 80 mL. Laat de bekerglazen droog 's nachts in een zuurkast.
    4. De volgende dag, spuiten methyleenchloride (circa 5 mL) rond de binnenkant van de rand van de droge bekers, wervelen rond en giet in 2 dram glazen flesjes. Verlof flesjes open's nachts drogen in een zuurkast.
  2. Aflatoxine analyse
    1. Toevoegen van 4,0 mL 80% methanol: gedeïoniseerd H2O (v/v) voor flesjes.
    2. Gebruik een aflatoxine extractie kit voor het filteren van zuiveren methanolische oplossing met de meegeleverde kolom. Analyseren totaalgehalte aan aflatoxine niveaus met een Fluorimeter, volgens de instructies van de fabrikant.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Maïs transformatie en moleculaire screening van transgene planten

Onrijpe embryo's van maïs Hi-II lijnen werden omgevormd met Agrobacterium tumefaciens EHA101 stam met de laatste plant bestemming vector die de AILP -gen uitdrukt Lablab purpureus onder de controle van de CaMV 35S promotor. Vijf onafhankelijk getransformeerde maïs lijnen werden schoof op naar de T6 generatie voo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Opbrengst verliezen in landbouwgewassen als gevolg van ziekteverwekkers en plagen is een mondiaal probleem20. Momenteel, toepassing van synthetische fungiciden en pesticiden is de overheersende middelen voor controle plant ziekteverwekkers en plagen, maar resterende toxiciteit van deze biochemische stoffen in levensmiddelen en diervoeders kan vormen ernstige bedreiging voor de gezondheid van mens en dier21. Gezien het economisch belang van maïs als voedsel en diervoeders ge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen conflict van belang.

Dankbetuigingen

Wij danken David Meints, Universiteit van Arkansas voor zijn hulp bij de ontwikkeling en het analyseren van de transgene maïs tijdens de vroege generaties. Dit werk kreeg financiële steun van de USDA-ARS CRIS project 6054-42000-025-00D. Vermelding van handelsnamen of commerciële producten in dit artikel is uitsluitend met het oog op het verstrekken van specifieke informatie en houdt geen aanbeveling of bekrachtiging door het Amerikaanse ministerie van landbouw. USDA-ARS gelijke kansen van de werkgelegenheid (eet) beleid mandaten van gelijke kansen voor alle personen en verbiedt discriminatie op alle aspecten van het personeelsbeleid van het Agentschap, praktijken en bewerkingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AgarCaisson
Amazing Marine GoopEclectic Products
C1000 Touch CFX96 Real-Time SystemBio-Rad
Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mmFisher Scientific08-772F
Eppendorf 5424 MicrocentrifugeFisher Scientific
Erlenmeyer flask with stopper, 50 mLAce Glass6999-10
Ethanol
FluoroQuant AflaRomer LabsCOKFA1010
Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cmFisher Scientific09-790-14E
Force Air OvenVWR
FQ-ReaderRomer LabsEQFFM3010
Geno/Grinder 2010OPS DiagnosticsSP 2010-115
Improved PolyVinylAlcohol Organic Solvent Resistant GlovesAnsell012-15-554
Innova 44 Incubator ShakerBrunswick Scientific
iScript cDNA Synthesis KitBio-Rad1708890
liquid Nitrogen
Low Form Griffin Beakers, 100 mLDKW Life Sciences14000-100
Methanol
Methylene Chloride
Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for PlantsNexttec47N
Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 cameraNikon
Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS cameraNikon
Nunc Square BioAssay DishesThermoFisher Scientific240835
Phire Plant Direct PCR KitThermoFisher ScientificF130WH
Polycarbonate Vials, 15 mlOPS DiagnosticsPCRV 15-100-23
Potato Dextrose Broth
Snap Cap, 22 mmDKW Life Sciences242612
Sodium Phosphate dibasic heptahydrateSigma-Aldrich
Sodium Phosphate monobasicSigma-Aldrich
Spectrum Plant Total RNA KitSigma-AldrichSTRN50
Stainless Steel Grinding Balls, 3/8''OPS DiagnosticsGBSS 375-1000-02
Stir Plate
Synergy 4 FluorometerBiotek
T100 Thermal CyclerBio-Rad
Triton X-100Sigma-AldrichT-9284
V8 juiceCampbell's
Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3Fisher Scientific09-820P
Wrist-Action ShakerBurrell Scientific

Referenties

  1. Ismaiel, A., Papenbrock, J. Mycotoxins: Producing fungi and mechanisms of phytotoxicity. Agriculture. 5 (3), 492-537 (2015).
  2. Mitchell, N., Bowers, E., Hurburgh, C., Wu, F. Potential economic losses to the USA corn industry from aflatoxin contamination. Food Additives & Contaminants: Part A. 33 (3), 540-550 (2016).
  3. Umesha, S., Manukumar, H. M., Chandrasekhar, B., Shivakumara, P., Shiva Kumar, J., Raghava, S., Avinash, P., Shirin, M., Bharathi, T. R., Rajini, S. B., Nandhini, M., Vinaya Rani, G., Shobha, M., Prakash, H. S. Aflatoxins and food pathogens: Impact of biologically active aflatoxins and their control strategies. Journal of the Science of Food and Agriculture. , (2016).
  4. Brown, R. L., Menkir, A., Chen, Z. Y., Bhatnagar, D., Yu, J., Yao, H., Cleveland, T. E. Breeding aflatoxin-resistant maize lines using recent advances in technologies - a review. Food Additives & Contaminants - Part A Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 30 (8), 1382-1391 (2013).
  5. Abbas, H., Accinelli, C., Shier, W. T. Biological control of aflatoxin contamination in U.S. crops and the use of bioplastic formulations of Aspergillus flavus biocontrol strains to optimize application strategies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65, 7081-7087 (2017).
  6. Udomkun, P., Wiredu, A. N., Nagle, M., Müller, J., Vanlauwe, B., Bandyopadhyay, R. Innovative technologies to manage aflatoxins in foods and feeds and the profitability of application – A review. Food Control. 76, 127-138 (2017).
  7. Dohroo, N. P., Bhardwaj, S. S., Shyram, K. R. Amylase and invertase activity as influenced by Pythium pleroticum causing rhizome rot of ginger. Plant Disease Research. 2, 106-107 (1987).
  8. Singh, R., Saxena, V. S., Singh, R. Pectinolytic, cellulolytic, amylase and protease production by three isolates of Fusarium solani variable in their virulence. Indian Journal of Mycology and Plant Pathology. 19, 22-29 (1989).
  9. Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Amy1, the α-amylase gene of Aspergillus flavus: Involvement in aflatoxin biosynthesis in maize kernels. Phytopathology. 89 (10), 908-914 (1999).
  10. Bluhm, B. H., Woloshuk, C. P. Amylopectin induces Fumonisin B1 production by Fusarium verticillioides during colonization of maize kernels. Molecular Plant-Microbe Interactions. 18 (12), 1333-1339 (2005).
  11. Gilbert, M. K., Majumdar, R., Rajasekaran, K., Chen, Z. Y., Wei, Q., Sickler, C. M., Lebar, M. D., Cary, J. W., Frame, B. R., Wang, K. RNA interference-based silencing of the a-amylase (amy1) gene in Aspergillus flavus decreases fungal growth and aflatoxin production in maize kernels. Planta. 247 (6), 1465-1473 (2018).
  12. Chen, Z. Y., Brown, R. L., Russin, J. S., Lax, A. R., Cleveland, T. E. A corn trypsin inhibitor with antifungal activity inhibits Aspergillus flavus α-amylase. Phytopathology. 89 (18944733), 902-907 (1999).
  13. Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Inhibition of growth of Aspergillus flavus and fungal α-amylases by a lectin-like protein from Lablab purpureus. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (8), 955-961 (2001).
  14. Mirkov, T. E., Wahlstrom, J. M., Hagiwara, K., Finardi-Filho, F., Kjemtrup, S., Chrispeels, M. J. Evolutionary relationships among proteins in the phytohemagglutinin-arcelin-a-amylase inhibitor family of the common bean and its relatives. Plant Molecular Biology. 26 (4), 1103-1113 (1994).
  15. Kim, Y. H., Woloshuk, C. P., Cho, E. H., Bae, J. M., Song, Y. S., Huh, G. H. Cloning and functional expression of the gene encoding an inhibitor against Aspergillus flavus a-amylase, a novel seed lectin from Lablab purpureus (Dolichos lablab). Plant Cell Reports. 26 (4), 395-405 (2007).
  16. Frame, B., Main, M., Schick, R., Wang, K. Ch. 22. Plant Embryo Culture. Thorpe, T. A., Yeung, E. C. 710, Humana Press. Methods in Molecular Biology 327-341 (2011).
  17. Rajasekaran, K., Sickler, C. M., Brown, R. L., Cary, J. W., Bhatnagar, D. Evaluation of resistance to aflatoxin contamination in kernels of maize genotypes using a GFP-expressing Aspergillus flavus strain. World Mycotoxin Journal. 6 (2), 151-158 (2013).
  18. Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Sickler, C. M., Majumdar, R., Jaynes, J. M., Cary, J. W. Control of Aspergillus flavus growth and aflatoxin production in transgenic maize kernels expressing a tachyplesin-derived synthetic peptide, AGM182. Plant Science. , 150-156 (2018).
  19. Shu, X., Livingston, D. P., Franks, R. G., Boston, R. S., Woloshuk, C. P., Payne, G. A. Tissue-specific gene expression in maize seeds during colonization by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides. Molecular Plant Pathology. 16 (4), 662-674 (2015).
  20. Savary, S., Ficke, A., Aubertot, J. -N., Hollier, C. Crop losses due to diseases and their implications for global food production losses and food security. Food Security. 4, 519-537 (2012).
  21. Damalas, C. A., Eleftherohorinos, I. G. Pesticide exposure, safety issues, and risk assessment indicators. International Journal of Environmental Research and Public Health. 8 (5), 1402-1419 (2011).
  22. Kowalska, A., Walkiewicz, K., Kozieł, P., Muc-Wierzgoń, M. Aflatoxins: Characterisitcs and impact on human health. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej (Online). 71, 315-327 (2017).
  23. Rajasekaran, K., Cary, J. W., Cotty, P. J., Cleveland, T. E. Development of a GFP-expressing Aspergillus flavus strain to study fungal invasion, colonization, and resistance in cottonseed. Mycopathologia. 165 (2), 89-97 (2008).
  24. Punt, P., Dingemanse, M. A., Kuyvenhoven, A., Soede, R. D., Pouwels, P. H., van den Hondel, C. A. Functional elements in the promoter region of the Aspergillus nidulans gpdA gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Gene. 93 (1), 101-109 (1990).
  25. Lee, L. W., Chiou, C. H., Klomparens, K. L., Cary, J. W., Linz, J. E. Subcellular localization of aflatoxin biosynthetic enzymes Nor-1, Ver-1, and OmtA in time-dependent fractionated colonies of Aspergillus parasiticus. Archives of Microbiology. 181 (3), 204-214 (2004).
  26. Bhatnagar, D., Cary, J. W., Ehrlich, K., Yu, J., Cleveland, T. E. Understanding the genetics of regulation of aflatoxin production and Aspergillus flavus development. Mycopathologia. 162, 155-166 (2006).
  27. Williams, W. P., Krakowsky, M. D., Scully, B. T., Brown, R. L., Menkir, A., Warburton, M. L., Windham, G. L. Identifying and developing maize germplasm with resistance to accumulation of aflatoxins. World Mycotoxin Journal. 8 (2), 193-209 (2015).
  28. Broekaert, W. F., van Parijs, J., Leyns, F., Joos, H., Peumans, W. J. A chitin-binding lectin from stinging nettle rhizomes with antifungal properties. Science. 245 (4922), 1100-1102 (1989).
  29. Vanparijs, J., Broekaert, W. F., Goldstein, I. J., Peumans, W. J. Hevein-an antifungal protein from rubber-tree (Hevea brasiliensis) latex. Planta. 183, 258-264 (1991).
  30. Gozia, O., Ciopraga, J., Bentia, T., Lungu, M., Zamfirescu, I., Tudor, R., Roseanu, A., Nitu, F. Antifungal properties of lectin and new chitinases from potato tubers. Comptes Rendus de l'Academie des Sciences - Series III. 316 (8), 788-792 (1993).
  31. Wisessing, A., Choowongkomon, K. Amylase inhibitors in plants: Structures, Functions and Applications. Functional Plant Science and Biotechnology. 6 (1), 31-41 (2012).
  32. Tyagi, B., Trivedi, N., Dubey, A. a-amylase inhibitor: A compelling plant defense mechanism against insect/pests. Environment & Ecology. 32 (3), 995-999 (2014).
  33. Powers, J. R., Culbertson, J. D. In vitro effect of bean amylase inhibitor on insect amylases. Journal of Food Protection. 45, 655-657 (1982).
  34. Gatehouse, A. M. R., Fenton, K. A., Jepson, I., Pavey, D. J. The effects of a-amylase inhibitors on insect storage pests: Inhibition of a-amylase in vitro and effects on development in vivo. Journal of the Science of Food and Agriculture. 37, 727-734 (1986).
  35. Blanco-Labra, A., Chagolla-Lopez, A., Martinez-Gallardo, N., Valdes-Rodriguez, S. Further characterization of the 12-kDa protease a-amylase inhibitor present in maize seeds. Journal of Food Biochemistry. 19, 27-41 (1995).
  36. Abdollahi, A., Buchanan, R. L. Regulation of aflatoxin biosynthesis: Induction of aflatoxin production by various carbohydrates. Journal of Food Science. 46, 633-635 (1981).
  37. Liu, J., Sun, L., Zhang, N., Zhang, J., Guo, J., Li, C., Rajput, S. A., Qi, D. Effects of nutrients in substrates of different grains on aflatoxin B1 production by Aspergillus flavus. BioMed Research International. 2016, (2016).
  38. Uppala, S. S., Bowen, K. L., Woods, F. M. Pre-harvest aflatoxin contamination and soluble sugars of peanut. Peanut Science. 40 (1), 40-51 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Kernel-screeningassayGFP-expresserende stamRemming van schimmelgroeiAILP-expressieAgrobacterium-transformatieSporentellingFluorometeranalyse
Remming van de groei van de Aspergillus flavus en aflatoxine productie in transgene maïs uiten van de α-amylase Inhibitor van Lablab purpureus L.
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.