Graft stenose vormt een kritische obstakel in weefsel ontworpen airway vervanging. Om te onderzoeken cellulaire mechanismen ten grondslag liggen aan stenose, gebruiken we een lymfkliertest model van weefsel ontworpen tracheale vervanging met geplaatste beenmerg mononucleaire cellen (BM-MNC). Hier, detail we onze protocol, met inbegrip van de steiger productie, BM-MNC isolatie, graft zaaien en implantatie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Zaaien en implantatie van een Biosynthetic weefsel-engineered tracheale Graft in een muismodel
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Behandelingsopties voor aangeboren of secundaire lange segment tracheale gebreken historisch beperkt gebleven als gevolg van een onvermogen om functionele weefsel vervangen. Weefselengineering houdt grote belofte als een mogelijke oplossing met haar vermogen om te integreren van cellen en signalering moleculen in een 3-dimensionale steiger. Recent werk met weefsel ontworpen tracheale transplantaties (TETGs) heeft gezien enig succes, maar hun vertaling heeft is beperkt door de stenose van de graft, graft ineenstorting en epithelialization vertraagd. Om te onderzoeken de mechanismen die deze kwesties rijden, hebben we een muismodel voor weefsel ontworpen tracheale graft implantatie. TETGs werden gebouwd met behulp van electrospun polymeren polyethyleentereftalaat (PET) en polyurethaan (PU) in een mengsel van PET en PU (20:80 percentage gewicht). Steigers werden vervolgens bezaaid met behulp van beenmerg mononucleaire cellen geïsoleerd van 6-8 week-oude C57BL/6 muizen door kleurovergang centrifugeren. Tien miljoen cellen per graft waren uitgezaaid op het lumen van de steiger en toegestaan om te broeden 's nachts vóór implantatie tussen de derde en zevende de tracheale ringen. Deze transplantaties in staat waren om de bevindingen van stenose recapituleren en vertraagd epithelialization zoals blijkt uit de histologische analyse en gebrek aan keratine 5 en keratine 14 basale epitheliale cellen op immunofluorescentie. Dit model zal dienen als een instrument voor het onderzoeken van cellulaire en moleculaire mechanismen die betrokken zijn in het remodelleren van de ontvangst.
Inleiding
Lange-segment tracheale gebreken kunnen presenteren als zeldzame aangeboren aandoeningen zoals volledige tracheale ringen tracheale agenesie, evenals trauma, maligniteit en infectie. Wanneer meer dan 6 cm in volwassenen of 30% van de trachea lengte bij kinderen, worden deze gebreken niet behandeld door chirurgische reconstructie. Pogingen om de luchtweg vervangen door autoloog weefsel, dode foetussen transplantaties en kunstmatige constructies hebben geteisterd door chronische infectie, granulatie, mechanische storing en stenose.
Weefsel ontworpen tracheale transplantaties (TETGs) kunnen potentieel deze problemen aangepakt terwijl het vermijden van de noodzaak van levenslang bij immuunsuppressie. In het laatste decennium, zijn TETGs getest in diermodellen en klinisch gebruikt in zeldzame gevallen voor gebruik in schrijnende gevallen1,2,3. In zowel de klinische als de grote dierproeven, post-operatieve herstel van weefsel ontworpen airway vervanging vereist vele interventies voor de bestrijding stenose (gedefinieerd als > 50% luminal vernauwing) en onderhouden van de luchtwegen bij. Extra TETG werk heeft getracht om deze stenose door evaluatie van de rol van cel seeding keuze, vascularisatie en steiger ontwerp. Cel seeding keuzes en steiger ontwerp voor het herstel van de inheemse luchtpijp structuur/functie hebben hoofdzakelijk gericht geweest op de luchtwegen epitheliale cellen en chondrocyten ontpit op verschillende resorbeerbare, niet-resorbeerbare en decellularized steigers. Zoals vascularisatie waarschijnlijk een belangrijke rol in de ontwikkeling van stenose speelt, hebben andere groepen gericht op het optimaliseren van in vitro of heterotopic modellen voor het versnellen van revascularisatie of neoangiogenesis4. Succesvolle vascularisatie ook behoud van een mechanisch bevoegde en functionele TETG bereiken blijft echter een uitdaging. Ondanks de recente vooruitgang blijft minimaliseren van stenose een belangrijke belemmering klinische vertaling.
Om te onderzoeken dit histopathologisch antwoord op TETG implantatie in vivo, ontwikkelden we een schapen model van weefsel ontworpen tracheale vervanging. De prothese was samengesteld uit een gemengde polyethyleentereftalaat (PET) en polyurethaan (PU) electrospun steiger bezaaid met beenmerg-afgeleide mononucleaire cellen (BM-MDL). In dit kleine cohort bewezen we dat geplaatste autologe BM-MDL opnieuw epithelialization versnelde en vertraagd stenose5. Hoewel zaaien met autologe BM-MDL verbeterd overleven, blijft de cellulaire mechanisme waarmee BM-MDL de vorming van functionele neotissue moduleren onduidelijk.
Onderzoek op het cellulaire niveau vereist ontwikkeling van een lymfkliertest model van weefsel ontworpen tracheale vervanging. Gelijkaardig aan de schapen studie, wij gebruikt een PET:PU electrospun steiger bezaaid met BM-MDL. Consistent met de schapen model, TETG stenose ontwikkelde in de loop van de eerste twee weken na implantatie1,2,3 ,5. Dit stelde dat de lymfkliertest model gerecapituleerd de pathologie waargenomen eerder, zodat we kunnen verder ondervragen de cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de luchtweg stenose.
In dit verslag detailleren wij ons protocol voor weefsel ontworpen tracheale vervanging in het muismodel met inbegrip van de steiger productie, BM-MNC isolatie, graft zaaien en implantatie (Figuur 1, Figuur 2).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) in landelijk Children's Hospital.
1. steiger productie
- Bereid een polymeer nanofiber voorloper oplossing door: 1) oplossen 8 wt % PET in 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol en verwarming van de oplossing tot 60 ° C en door 2) 3 wt % PU in 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol bij kamertemperatuur.
- Eenmaal afgekoeld, combineren de oplossingen voor het maken van een definitieve polymeer mengsel van PET en PU (20:80).
- Electrospin de PET+ PU-oplossing op een Inox staafjes diam. (1 mm diameter) met behulp van een naald van 20 G botte uiteinde op een 60 mL spuit gevuld met de PET:PU oplossing met behulp van een hoogspannings-DC power supply ingesteld op + 14 kV op de naald, een andere hoogspannings-DC power supply ingesteld op -3 kV , een debiet van 5 mL/h en een afstand van 20 cm tip-naar-substraat. De staaf van 350 toeren per minuut draaien tijdens vezel afzetting.
- Totdat de electrospinning om de gewenste steiger wanddikte van 300 µm wordt bereikt. Schuif de steiger van de staaf, dan houd het onder vacuüm 's nachts te verwijderen van alle resterende oplosmiddel.
- Het steriliseren van de steiger met behulp van een ultraviolet licht dosering van 350 mJ/cm2 vóór.
2. het beenmerg-afgeleide mononucleaire cellen (BM-MNC) oogsten
- Euthanaseren van een 6-8 weken oud, vrouwelijke C57BL/6 muis met een cocktail van ketamine (200 mg/kg), xylazine (20 mg/kg) en ketoprofen (10 mg/kg). Controleer volledige euthanasie door staart-snuifje methode. Zorg ervoor dat lokale richtsnoeren voor euthanasie.
- Onder steriele condities, verwijder de huid over het dijbeen en zijn verbeend bot met behulp van fijn schaar en pincet micro-Adson bloot te stellen. Dumont #5 pincet en Dumont #5/45 pincet gebruiken om de fascia en de pezen te verwijderen. Scheiden van de botten en snijd elk van hen aan de beide uiteinden. Met behulp van een spuit 5 mL en een 25G naald, spoel het beenmerg in een petrischaal met 30 mL Rosewell Park Memorial Instituut (RPMI) media. Filtreer deze RPMI met het beenmerg door een 70 µm nylon cel zeef in een tube van 50 mL.
- Plaats in een kabinet van bioveiligheid, 5 mL van polysurcrose en natrium diatrizoate in een tube van 15 mL. Zachtjes toevoegen de RPMI met het beenmerg mononucleaire cellen langs de zijkant van de buis om te voorkomen dat het mengen van de twee lagen. Centrifugeer bij 461 x g gedurende 30 min met "rem 1" bij 24 ° C.
Opmerking: Op onze centrifuge, rem 1 staat voor de langste uitgeput tijd tijdens het vertragen. - Uit de drie lagen gevormd, negeren de (roze) toplaag van plasma en verzamelen de middelste (doorzichtig) laag bestaande uit de mononucleaire cellen van het beenmerg. Gooi de neerslag van rode bloedcellen.
- Verdun de beenmerg mononucleaire cellen (BM-MNC) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een 1:1 verhouding en centrifuge op 461 x g gedurende 10 minuten met "rem 9" bij 24 ° C.
- Verwijder het supernatant en verdunnen van de pellet met 5 mL PBS. Centrifugeer bij 461 x g gedurende 10 minuten met "rem 9" bij 24 ° C.
- Verwijder het supernatant en verdunnen van de pellet met ~ 10 mL RPMI.
- Verdun 10 µL van de BM-MNC oplossing met een gelijk volume 0,4% trypan blauw in een tube van 1 mL. Plaats 10 µL van de oplossing in een cel tellen kamer dia. Met behulp van een geautomatiseerde cel counter cellen tellen. Herhaal de stap en het gemiddelde aantal cellen berekenen.
Opmerking: Een gemiddelde cel tellen van 1 X 108 cellen is verkregen uit het gebruik van twee muizen van de donor. Dit zou gelijk aan twee dijbeen, en twee zijn verbeend die beenmerg is geïsoleerd uit. - De BM-MNC oplossing bij 461 x g gedurende 10 minuten met "Rem 9" Centrifugeer bij 24 ° C. Verwijder het supernatant en verdunnen van de concentratie van de cel op 107 cellen/graft.
Opmerking: We hebben studeerde efficiëntie tussen 1, 10 en 100 miljoen cellen zaaien en vonden dat 10 miljoen cellen per graft levert de hoogste seeding efficiëntie.
3. cel zaaien op de transplantaten
- Meten van de lengte van de steigers en indien nodig, snijd ze tot een lengte van 5 mm.
- Vooraf nat het schavot met 5 µL van RPMI voor 5 min. verwijderen de RPMI.
- Voeg toe 5 µL van de BM-MNC oplossing aan het lumen van de steiger voor 10 min.
- Passeren van een naald 21G via het lumen van de prothese en de prothese in 1000 µL van RPMI's nachts bij 37 ° C in een broedstoof uit te broeden.
4. graft implantatie
Opmerking: Zorg moet worden genomen om aseptische techniek tijdens de prothese implantatie procedure.
- 6-8-week-oude vrouwelijke C57BL/6 muizen als geadresseerden gebruiken voor de cel geplaatste protheses. Enrofloxacin (10mg/kg) injecteren subcutaan 24 uur voor de ingreep en net voordat de incisie.
- Weeg de muis en beheren van een dosis van 0,1 mL/10 g van de verdoving cocktail van ketamine (100 mg/kg), xylazine (10 mg/kg) en ketoprofen (5 mg/kg) als analgesie intraperitoneally.
- Controleer als het vliegtuig van de verdoving is bereikt door de staart-snuifje methode. Voor het bevestigen van het niveau van sedatie, een steriele ophthalmic zalf van toepassing op de ogen en knippen van de haren op de chirurgische site van kin sleutelbeenderen. Plaats het dier op een pad in een dorsale ligfiets positie. Desinfecteer de chirurgische site met eerst een Povidon-jodium prep pad, gevolgd door een prep pad van alcohol (70% alcohol), en eens te meer een Povidon-jodium prep pad.
- Plaats het dier onder de ontleden Microscoop met haar hoofd weg van de chirurg. Maak een insnijding van de middellijn gaande van de sleutelbeenderen tot op het bot van de hyoid met behulp van fijn schaar en pincet micro-Adson. Reinig de fascia met Dumont #5 en Dumont #7 fijne pincet, samen met een steriel katoenen doekje als nodig en voeg een zelfstandige behoud Colibri oprolmechanisme.
- Open de riem spieren (Figuur 3A) met een Dumont #5 en Dumont #7 fijne Tang bloot het kraakbeen van de schildklier, cricoid kraakbeen en de luchtpijp. Botweg de luchtpijp te scheiden van de terugkerende laryngeal zenuwen die parallel lopen aan weerszijden, gevolgd door ze scheiding van de luchtpijp van de slokdarm (Figuur 3B).
- Met behulp van een naald van 20G en chirurgische marker, vlek het voorste gedeelte van de luchtpijp.
- Identificeren van de luchtpijp en maak een incisie onder de derde ring van de trachea kraakbeen en transect van de luchtpijp met behulp van een paar Vannas-Tübingen voorjaar schaar en een paar fijne pincet Dumont #7. Houd het met de fijne gebogen verlostang en beveiligen de distale luchtpijp aan het borstbeen met behulp van steriele 9-0 nylon Sutuur (geologie) als u wilt maken van een tijdelijke tracheostomy (Figuur 3C). Opmerking: Een alternatieve hechtdraad materiaal dat gebruikt kan worden is de 9-0 PDS voor tracheale implantatie en spier reapproximation.
- Met een naald van 20G en een chirurgische marker, vlek de prothese te vertegenwoordigen het voorste gedeelte.
- De prothese invoegen de proximale-posterior, proximale-laterale implantaat en proximale-anterior hechtingen, in die volgorde met 9-0 steriele nylon hechtdraad (Figuur 3D), Dumont #7 fijne pincet en de houder van een naald.
- Draai de dierlijke 180° om haar staart uit de buurt van de chirurg. Laat de tijdelijke tracheostomy. De distale luchtpijp is onvolledig verbeelde toestaan van het gebruik van de resected segment als een stomp voor retractie. Wanneer niet langer nodig is, is het segment van de luchtpijp 5 MM volledig verwijderd.
- De distale wapendrager voltooien door het plaatsen van de hechtingen op de dezelfde manier als de proximale anastomose.
- Opnieuw onderlinge aanpassing van de positie van de prothese en de spieren van de riem. Sluit de incisie met 9-0 steriele nylon hechtingen in een lopende patroon.
- Subcutaan injecteren van 0,1 mL van buprenorfine (0,1 mg/kg) en plaats het dier in een herstel kooi geplaatst op een verwarming pad zonder andere dieren in de kooi.
- Observeer de muis totdat het bewuste en kundig voor ambulate, dan de muis naar een nieuwe kooi met zacht beddengoed, vochtige chow en medicinale water (ibuprofen, 30 mg/kg) gedurende 48 uur. Na deze periode door de muis te keren naar een normale kooi met andere muizen.
Opmerking: Muizen die handhaven van respiratoire nood of activiteit daalde na implantatie worden waargenomen door personeel van het laboratorium en/of dier in een 32 ° C incubator. Als dit zo voor meer dan 48 uur doorgaat, moeten vervolgens de muizen worden euthanized.
5. histologie en Immunohistochemistry
Opmerking: De haematoxyline en eosine vlekken werden uitgevoerd met behulp van standaard techniek door landelijke kinder ziekenhuis morfologie Core. Immunohistochemistry werd uitgevoerd volgens de onderstaande stappen.
- Deparaffinize van de dia's met behulp van xyleen 1) voor 5 min, 2) xyleen gedurende 5 minuten, 3) 100% ethanol voor 5 min, 4) 90% ethanol voor 5 min, 5) 70% ethanol voor 5 min, 6) gedistilleerd H2O (dH2van O) gedurende 5 minuten.
- De dia's in de citraat buffer onderdompelen en plaatsen in de snelkookpan water gevulde. Verwarm gedurende 10 min laat vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur. Wassen met 0,1% bovien serumalbumine in PBS (BSA-PBS) voor 5 min. spoelen met dH2O.
Opmerking: Verwarming kan ook worden gedaan met een warm waterbad of magnetron gedurende 15 minuten. - Laat de dia's met 3% normale geit serum in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur inwerken. Wassen met 0,1% BSA-PBS voor 5 min. broeden in primair antilichaam met concentraties voor keratine 5 (1:1000)6, keratine 14 (1:250)6 en F4/80 (1:100)7 voor 18u 's nachts bij 4 ° C.
- Wassen met 0,1% BSA-PBS tweemaal voor 10 minuten elk wassen. Met passende secundair antilichaam bij concentratie van 1:500 voor K5/K14 en 1:300 F4/80 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur incuberen. Wassen met 0,1% BSA-PBS tweemaal voor 10 minuten elk wassen.
- Monteren met 4', 6-diamidino-2-phenolindole (DAPI) met montage media en glas cover slips. Laat het zitten voor 30 min vóór imaging.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 illustreert een schematische voorstelling van TETG zaaien en implantatie. Beenmerg is gekapt uit C57BL/6 muizen en gekweekt in vitro. BM-MDL waren geïsoleerd door dichtheid centrifugeren en ontpit op de TETG. Geplaatste TETGs waren een syngeneic C57BL/6 ontvangende muis ingeplant.
Figuur 2 is een overzicht van de PET:PU TETG steiger productieproces. Pe...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Ontwikkeling van een muismodel voor weefsel ontworpen tracheas is essentieel in het begrip van de factoren die hebben beperkte klinische vertaling van de TETGs; namelijk graft ineenstorting, stenose en vertraagde epithelialization4. Een paar factoren die aan deze beperkingen bijdragen omvatten selectie van graft materiaal, het productieproces, de steiger ontwerp en de cel protocollen zaaien. Dit model zorgt voor snellere evaluatie van deze factoren om te begrijpen van de cellulaire en moleculaire ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Wij willen erkennen van Robert Strouse en de Research Information Solutions & innovaties divisie in landelijk Children's Hospital voor hun steun in grafisch ontwerp. Dit werk werd gesteund door een subsidie van de NIH (NHLBI K08HL138460).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.9% Sodium chloride injectie | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-186-10 | |
| 10cc serologische pipet | Falcon | 357551 | |
| 18G 1.5in. Naald | BD | 305190 | |
| 1mL Spuit | BD | 309659 | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25cc serologische pipet | Falcon | 356535 | |
| 25G 1in. Naald | BD | 305125 | |
| 50cc buis | BD | 352070 | |
| Alcohol prep pads | Fisher Healthcare | NDC 69250-661-02 | |
| Baytril (enrofloxacin) oplossing | Bayer Healthcare, LLC | NDC 0859-2267-01 | |
| Zwarte polyamide monofilament hechtdraad, 9-0 | AROSurgical Instruments Corporation | T05A09N10-13 | |
| C57BL/6, vrouwelijk | Jackson laboratories | 664 | 6-8 weken oud |
| Citraat Buffer pH 6.0 20x concentraat | ThermoFisher | 5000 | |
| Colibri retractoren | F.S.T | 17000-04 | |
| Wattenstaafjes met katoen | Fisher scientific | 23-400-118 | |
| Cytokeratin 14 Monoclonale Antilichaam | ThermoFisher | MA5-11599 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | F.S.T | 11251-35 | |
| Dumont #7 - Fijne Forceps | F.S.T | 11274-20 | |
| F4/80 Rat anti-muis antilichaam | Bio-Rad | MCA497R | |
| Ficoll | Sigma | 10831-100mL | |
| Fijne schaar- Scherp-bluntje | F.S.T | 14028-10 | |
| Fisherbrand Premium Cover Glasses | ThermoFisher | 12-548-5M | |
| Fluoroshield Montage Media met DAPI | Abcam | ab104139 | |
| Geit-anti muis IgG Secundair Antilichaam Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11001 | |
| Geit-anti Konijn IgG Secundair Antilichaam Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11012 | |
| Geit-anti Rat IgG Secundair Antilichaam Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | A-21247 | |
| Ibuprofen | Precision Dose, Inc | NDC 68094-494-59 | |
| Jodium prep pads | Professional disposables international, Inc. | NDC 10819-3883-1 | |
| Keratin 5 Polyclonal Antilichaam, Gezuiverd | BioLegend | 905501 | |
| Ketamine hydrochloride injectie | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Micro-Adson forceps | F.S.T | 11018-12 | |
| Microscoop | Leica | M80 | |
| Niet-geweven sponzen | Covidien | 441401 | |
| Oftalmische zalf | Dechra Veterinary products | NDC 17033-211-38 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| PET/PU (Polyethyleen tereftalaat & Polyurethaan) scaffol | Nanofiber solutions | Op maat besteld | |
| Petri schotel | BD | 353003 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875-093 | |
| TISH Naaldhouder/Forceps | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | F.S.T | 15008-08 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-700 | |
| Xylazine steriele oplossing | Akorn animal health | NDC 59399-110-20 |
Referenties
- Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. The Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
- Jungebluth, P., et al. Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: A proof-of-concept study. The Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).
- Elliott, M. J., et al. Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: A 2-year follow-up study. The Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).
- Chiang, T., Pepper, V., Best, C., Onwuka, E., Breuer, C. K. Clinical Translation of Tissue Engineered Trachea Grafts. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 125 (11), 873-885 (2016).
- Clark, E. S., et al. Effect of cell seeding on neotissue formation in a tissue engineered trachea. Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 49-55 (2016).
- Cole, B. B., Smith, R. W., Jenkins, K. M., Graham, B. B., Reynolds, P. R., Reynolds, S. D. Tracheal basal cells: A facultative progenitor cell pool. American Journal of Pathology. 177 (1), 362-376 (2010).
- Onwuka, E., et al. The role of myeloid cell-derived PDGF-B in neotissue formation in a tissue-engineered vascular graft. Regenerative Medicine. 12 (3), 249-261 (2017).
- Grimmer, J. F., et al. Tracheal reconstruction using tissue-engineered cartilage. Archives of Otolaryngology - Head and Neck Surgery. 130 (10), 1191-1196 (2004).
- Wood, M. W., Murphy, S. V., Feng, X., Wright, S. C. Tracheal reconstruction in a canine model. Otolaryngology - Head and Neck Surgery (United States). 150 (3), 428-433 (2014).
- Haag, J., et al. Biomechanical and angiogenic properties of tissue-engineered rat trachea using genipin cross-linked decellularized tissue. Biomaterials. 33 (3), 780-789 (2012).
- Best, C. A., et al. Designing a tissue-engineered tracheal scaffold for preclinical evaluation. International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 104, 155-160 (2018).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
