Met behulp van Nanoplasmon-Enhanced verstrooiing en low-vergroting Microscoop Imaging te kwantificeren tumor-afgeleide Exosomes

Samenvatting

De klinische vertaling van exosoom biomarkers voor zieke en kwaadaardige cellen wordt belemmerd door het ontbreken van snelle en accurate kwantificatie methoden. Dit rapport beschrijft het gebruik van low-vergroting Dark-Field Microscoop beelden te kwantificeren specifieke exosoom subtypen in kleine volume serum of plasma monsters.

Samenvatting

Geïnfecteerde of kwaadaardige cellen vaak afscheiden meer exosomes, wat leidt tot verhoogde niveaus van ziekte-geassocieerde exosomes in de circulatie. Deze exosomes hebben het potentieel om als biomarkers voor ziektediagnose te dienen en ziektevooruitgang en behandelings reactie te controleren. Nochtans, vereisen de meeste exosoom analyseprocedures exosoom isolatie en reinigingsstappen, die gewoonlijk tijdrovend en arbeidsintensief, en zo van beperkt nut in klinische montages zijn. Dit rapport beschrijft een snelle procedure om specifieke biomarkers op het buitenmembraan van exosomes te analyseren zonder afzonderlijke isolatie en reinigingsstappen te vereisen. In deze methode, exosomes worden gevangen op het oppervlak van een dia door exosoom antilichamen en vervolgens gekruist met nano partikel-geconjugeerde antilichaam sondes die specifiek zijn voor een ziekte. Na hybridisatie, de overvloed van de doelgroep exosoom bevolking wordt bepaald door het analyseren van low-vergroting Dark-Field Microscoop (LMDFM) beelden van de gebonden nanodeeltjes. Deze aanpak kan gemakkelijk worden vastgesteld voor onderzoek en klinisch gebruik te analyseren membraan-geassocieerde exosoom biomarkers in verband met ziekte.

Inleiding

Exosomes worden vrijgegeven van de meeste soorten cellen en spelen een belangrijke rol in cel-naar-cel communicatie, met inbegrip van pathofysiologische processen in verband met verschillende ziekten, omdat ze kunnen worden naar huis om specifieke weefsels of cel types, en bevatten een verscheidenheid van nucleïnezuren , eiwitten en lipiden die hun cel van oorsprong weerspiegelen en kunnen regulerende effecten uitoefenen op de ontvanger cellen¹,^2,3,4. Exosomes worden vaak afgescheiden op verhoogde niveaus in de ziekte van Staten, kunnen interageren met zowel aangrenzende en verre cellen, en zijn te vinden op relatief hoge concentratie in de circulatie en de meeste andere lichaamsvloeistoffen, waaronder speeksel, urine, pancreas en gal SAP, en bronchoalveolaire lavage vloeistof^{5,6,7,8,9,10,11}. Deze overvloed en stabiliteit van exosomes in menselijk lichaam vloeistoffen, in combinatie met hun informatie-rijke aard, maakt ze ideaal biomarkers voor de ziekte van diagnose en behandeling monitoring.

Dit omvat tumor-afgeleide exosomes (TDEs), die tumor-specifieke of selectieve factoren bevatten, die als ziekte biomarkers, met inbegrip van tumor-geassocieerde gemuteerde alleles kunnen dienen. TDEs kan deelnemen aan de verbouwing van de tumor microenvironment te vergemakkelijken tumorontwikkeling en metastase, en reguleren anti-tumor reacties¹². Verhoogde TDE secretie is een gemeenschappelijk fenotype van de meeste vormen van kanker en verschillende kenmerken van de tumor microenvironment, met inbegrip van hypoxie, zure pH, en ontsteking, zijn bekend om exosoom secretie te bevorderen. Verrassend, gezien het aantal cellen dat afscheiden exosomes, een stijging van de totale exosoom niveau kan, zelf, functioneren als een kanker biomarker. Bijvoorbeeld, een recente studie bleek dat de totale EV concentratie in de gal SAP discrimineert maligne en niet-maligne in het gemeenschappelijk galwegen stenose patiënten met 100% nauwkeurigheid⁷. Vergelijkbare resultaten zijn gevonden met studies met behulp van andere lichaamsvloeistoffen, met inbegrip van plasma. Nochtans, wegens het potentieel voor onderworpen aan onderworpen variatie, en andere verwarrende factoren, hebben de meeste studies die exosomes als ziekte biomarkers onderzoeken zich op opsporing van biomarker geconcentreerd die selectief met TDEs in plaats van totale exosoom wordt geassocieerd Getallen.

Het vertalen van exosoom biomarkers in de klinische praktijk, blijft echter uitdagend, aangezien de meeste gemelde exosoom assay benaderingen vergen tijdrovende en arbeidsintensieve isolatie procedures ¹³. Momenteel populaire exosoom isolatie methoden omvatten ultracentrifugation, dichtheidsgradiënten, grootte-uitsluiting, co-precipitatie, affiniteit vast te leggen, en microvloeiende isolatie benaderingen. Ultracentrifugation is de "Gold Standard" methode, en wordt meestal gebruikt voor exosoom isolaties, maar deze procedure is tijdrovend en resulteert in exosoom schade en exosoom membraan Clustering, en produceert exosoom monsters die zijn verontreinigd met eiwitten, lipoproteïnen en andere factoren die de daaropvolgende analyses kunnen beïnvloeden¹⁴. De meeste exosoom isolatiemethodes, met inbegrip van ultracentrifugation, kunnen exosomes (30-150 Nm) van micro-blaasjes (100 – 1000 Nm) en apoptotic organismen (100 – 5000 nm) niet scheiden, die door verschillende mechanismen ontstaan en verschillende functies hebben, wegens de grootte overlap tussen deze groepen, en de diversiteit van exosoom bevolking¹⁵. Nieuwe benaderingen zijn nodig om de gevoeligheid en reproduceerbaarheid van exosoom assays te verbeteren door het verbeteren van exosoom herstel, terwijl het verminderen van exosoom schade en vervuiling, hoewel alle analyses op basis van dergelijke methoden zal ook moeten worden geoptimaliseerd om ze te maken geschikt voor vertaling naar toepassingen in klinische settings.

Verscheidene recente studies hebben voorgesteld om geïntegreerde platforms in dienst te nemen om exosomes van lichaamsvloeistoffen direct te vangen en te analyseren. Deze methoden maken gebruik van microvloeistoffen, electrokinetic, affiniteit vast te leggen, en diverse andere methoden voor exosoom isolatie, en electrochemistry, oppervlak Plasmon resonantie, en andere methoden op te sporen gevangen exosomes. Het is niet duidelijk hoe haalbaar veel van deze benaderingen zal worden in de klinische instellingen, vanwege hun complexiteit, kosten, lage doorvoersnelheid of andere kwesties.

We hebben een snelle en goedkope assay ontwikkeld die gebruikt kan worden voor de gevoelige en specifieke kwantificering van totale exosomes en specifieke exosoom subtypen, inclusief ziekte-geassocieerde exosomes, zoals TDEs, die slechts een kleine hoeveelheid monster vereist en die maakt gebruik van een gestroomlijnde workflow geschikt voor klinische omgevingen. In deze Assay, een dia is bedekt met antilichamen die binden ofwel een exosoom-specifieke of ziekte-specifieke marker uitgedrukt op de exosoom oppervlak om direct te vangen doel exosomes aanwezig in kleine volume plasma-of serummonsters toegepast op putten op de Dia. Gevangen exosomes worden vervolgens gekruist met een antilichaam-geconjugeerde nanodeeltjes die de biomarker van belang erkent op deze exosomes, die kan worden ofwel een algemene exosoom marker of een factor die specifiek zijn voor een exosoom subtype van belang. Beelden van deze monster putten worden vervolgens gevangen met behulp van een donkere veld Microscoop (dfm) en geanalyseerd om het licht te meten verspreid van nanodeeltjes gebonden aan exosomes van belang gevangen in elk monster goed^6,16,17. Met name, Imaging een hele steekproef goed door lage-vergroting DFM (LMDFM) vermijdt een selectie bias ondervonden met een hoge vergroting DFM analyses wanneer gebruikers moeten direct kiezen welke velden te vangen voor de daaropvolgende beeldanalyse. LMDFM beeldanalyse is onderworpen aan lichtverstrooiing artefacten van oppervlakte onregelmatigheden, met inbegrip van krassen en monster puin, maar deze achtergrond kan worden verlaagd met behulp van een eenvoudige Noise-reductie algoritme ontwikkeld om te draaien op de NIH beeldanalyse-programma, ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Dit algoritme past eerst een input contour drempel die wordt gebruikt om de grenzen van het monster goed te detecteren om de regio van de afbeelding voor de volgende analyse te definiëren. Het gebied dat door dit contour gebied wordt bepaald wordt dan verdeeld aan afzonderlijk signaal aanwezig in de rode, blauwe en groene kanalen van het beeld en het blauwe kanaal wordt afgetrokken van het rode kanaal om signaal te verwijderen die uit oppervlakte artefacten en ongelijke verlichting van nano staafje Signaal.

In dit artikel wordt beschreven hoe u deze test gebruiken om de totale of specifieke exosoom niveaus in plasma-of serummonsters snel te kwantificeren.

Protocol

1. voorbereiding van nanodeeltjes sondes

Opmerking: deze test maakt gebruik van gefunctioneerde goud nanorods (AuNRs; 25 nm diameter x 71 nm lengte) die zijn polyvalent vervoegd met neutravidin polymeren (AV) en hebben een oppervlakte Plasmon resonantie piek die een rode (641 nm piek) verstrooiing signaal produceert op DFM Verlichting.

1. Was 40 µ L van AuNR-AV (2,56 x 10¹¹ deeltjes) drie keer met 200 µ l PBS (pH 7,0) door centrifugeren en aspiratie (8.500 x g bij 4 °c gedurende 10 minuten), gevolgd door een definitieve centrifuge en aspiratie stap waarna de AuNR-AV-pellet is geschorst in 40 µ L PBS.
2. Meng deze AuNR-AV suspensie met 10 µ L biotinylated antilichaam (0,5 mg/mL) specifiek voor een antigeen op het oppervlak van de exosoom subtype van belang en 150 µ L van PBS en meng bij 4 ° c voor 2 h met behulp van een mixer om neutravidin-Biotine binding om de voltooiing te bereiken.
3. Was het resulterende antilichaam-geconjugeerde AuNRs (AuNR-IgG) drie keer door centrifugeren en aspiratie (6.500 x g bij 4 °c 10 minuten), en dan opschorten hen in 200 µ l PBS en bewaar hen bij 4 °c tot gebruik.
   Opmerking: steriele techniek en korte opslagtijden moeten worden gebruikt om verontreiniging en degradatie van de AuNR-IgG te voorkomen. Het is best om antilichaam-geconjugeerde AuNRs binnen 24 uren van hun vervoeging te gebruiken.

2. voorbereiding van EV Capture dia's

1. Verdun geselecteerde exosoom Vang antilichamen aan 0,025 mg/mL in PBS en voeg 1 µ L/put van deze verdunning op een multi-well proteïne A/G dia toe, en dan Incubeer deze dia bij 37 °C voor 1 h in een bevochtigde kamer om vangst antilichamen te toestaan verbindend aan proteïne A/G immobiled op de dia.
2. Aspireren putten om ongebonden antilichamen te verwijderen, en was putten drie keer door de toevoeging en de aspiratie van 1 µ L/well van PBS, laadt dan elk goed met 1 µ L van blokkerende buffer (Zie lijst van materialen) en Incubeer de dia voor 2 h bij 37 °c in een bevochtigde kamer aan b Vergrendel alle resterende eiwitbinding sites.
3. Aspireren Wells te verwijderen blokkering buffer, wassen putten drie keer door de toevoeging en aspiratie van 1 µ L/put van PBS, en onmiddellijk gebruik maken van de geblokkeerde dia's voor exosoom vastleggen en analyse.

3. standaard curve voorbereiding

1. Om de absolute of relatieve overvloed van een specifiek exosoom subtype nauwkeurig te kwantificeren, moet de gebruiker een standaardkromme met een zuivere exosoom bevolking produceren die uniform de exosoom oppervlakte biomarker van belang uitdrukt. Deze studie analyseert de overvloed van exosomes het uitdrukken van een metastase-geassocieerde membraanproteïne, Ephrin a2 receptor, die een gemelde verhouding met alvleesklier-kanker stadium en prognose^6,18heeft.
   Opmerking: de menselijke alvleesklierkanker cel lijn PANC-1 en de exosomes is bekend dat dit eiwit en geïsoleerde exosomes uit deze cel lijn te uiten werden gebruikt om een standaard curve te genereren om het aantal exosomes dat deze eiwitten Express in complexe exosoom te kwantificeren Monsters.
2. De cellen van de cultuur voor 48 uren bij 37 °C in serum-vrije cultuurmedia om exosoom accumulatie in de media toe te staan, dan de supernatants van de cel cultuur door centrifugeren van opschortings culturen of directe aspiratie van cultuurmedia van aanhangende cel culturen te isoleren.
3. Centrifugeer de verzamelde media bij 2000 x g voor 30 min om puin te verwijderen en de bovendrijvende terug te krijgen.
4. Filtreer de verduidelijkte cultuur bovendrijvende door een 0,45 µm laag proteïne bindende filtereenheid van aangewezen capaciteit (b.v. een 250 mL polyethersulfone vacuümfiltratie eenheid).
5. Concentraat de resulterende filtraat door centrifugeren op 3200 x g met behulp van een 100.000 nominale molecuulgewicht limietfilter systeem om een 250 µ l Final volume. Verzamel het ingehouden volume van dit filter, dan was het filter met 200 µ L PBS, en combineer dit wassen volume met de verzamelde exosoom sample volume.
6. Centrifugeer deze steekproef bij 21.000 x g voor 45 notulen en herstel zorgvuldig de bovendrijvende, verzorgend om geen gestort materiaal te verzamelen.
7. Centrifugeer de teruggewonnen bovendrijvende bij 100.000 x g 3 uren om de exosomes te neerslaan. Aspireren weg de bovendrijvende en het verzamelen van de exosoom pellet in 100 µ L PBS.
8. Bewaar de resulterende exosoom suspensies bij 4 °C indien gebruikt binnen 24 uur of bij-80 °C voor lange termijn opslag.
   Opmerking: niet onderworpen exosoom monsters te herhalen Freeze-ontdooicycli.
9. Kwantificeren van een hoeveelheid van de exosoom schorsing na het mengen door directe meting van exosoom nummers (bijvoorbeeld door nanodeeltjes tracking analyse of tunable resistieve puls sensing of door het meten van de eiwitconcentratie van exosoom lysaten door micro-bicinchoninic zure analyse, of een gelijkwaardige methode, als middel om exosoom hoeveelheid te benaderen^16,19.
10. Genereer een reeks seriële verdunningen van de exosoom suspensie om de vergelijking van nanodeeltjes signaal naar input exosoom aantal of eiwitgehalte mogelijk te maken.
11. Breng 1 µ L van elke exosoom-norm over aan elk van zijn herhalings putten op de assay plaat.
    Opmerking: standaard krommen kunnen worden gebruikt om de helling van de correlatie lijn tussen nanodeeltjes signaal en exosoom concentratie te berekenen tot (1) de Testprestaties te evalueren en (2) de relatieve concentratie van doel exosomes in experimentele monsters te bepalen.

4. verwerking van menselijke plasma-of serummonsters

1. Verzamel plasma of serum steekproeven door standaardmethodes en opslag bij-80 °C tot nodig voor exosoom analyse. Snel ontdooien monsters in een kamer temperatuur water bad. Meng herhaaldelijk de ontdooide monsters door inversie ter bevordering van homogene schorsing.
   Nota: de resultaten van serum en plasma steekproeven kunnen niet gelijkwaardig zijn, aangezien er een significante versie van exosomes tijdens de het klonteren reactie is.
2. Centrifugeer plasma of serum steekproeven bij 500 x g 15 min om eiwitcomplexen en ander puin te neerslaan. Breng een hoeveelheid van het plasma of serummonster over naar een verse buis en voeg PBS toe om een 1:1 verdunning te genereren. Meng het verdunde monster door zachte vortexen of inversie, naar gelang van het geval. Breng 1 µ L van elke plasma-of serum suspensie over naar elk van zijn herhalings putten op de assay plaat.

5. exosoom vastleggen en detecteren

1. Laad putten van een geblokkeerde EV Capture dia met 1 µ L/put van exosoom monster, met behulp van 8 repliceert per monster, en Incubeer de dia overnachting bij 4 ° c in een bevochtigde kamer. Aspireren alle monster putten en voeg vervolgens 1 µ L/put van PBS om putten te wassen en te verwijderen ongebonden exosomes en andere contaminanten uit de geladen exosoom monster.
2. Laad monster putten met 1 µ L/put van een eerder geprepareerde AuNR-IgG Suspension (zie punt 1 hierboven) en broed de glijbaan voor 2 uur bij 37 °C in een bevochtigde kamer. Aspireren de nano partikel oplossing en was de glijbaan in PBS aangevuld met 0,01% tween-20 (PBST) voor 10 min met behulp van een mixer, dan aspireren en was alle monster putten met deioniseerde water voor 10 min met behulp van een roterende mixer, en de lucht drogen voor de daaropvolgende LMDFM beelden.
   Opmerking: de Inter-assay coëfficiënten van variatie (CVs) worden beoordeeld vanaf acht herhalingen van hetzelfde monster. Monsters die CVs > 20% vertonen, worden als niet-informatief beschouwd en moeten worden herhaald, als er voldoende steekproef is.

6. DFM beeld vast te leggen

1. Capture beelden voor exosoom kwantificering onder consistente verlichting met behulp van een digitale camera bevestigd aan een Microscoop uitgerust met een donkere veld condensator (1,2 < NA < 1,4) en een 4x doelstelling met een 1/220 s belichtingstijd.
2. Open de Image Capture software.
   Opmerking: we gebruiken NIS-Elements Microscoop imaging software (Zie de lijst van materialen) voor het protocol hieronder beschreven, maar het is mogelijk om een andere software die kan overeenkomen met de Image Capture parameters te gebruiken. NIS-Elements viewer Imaging software is een gratis standalone programma om beeldbestanden en datasets die analyse, visualisatie en archivering tools bevat te bekijken. De parameters hieronder zijn ook voor een microscoop met autofocus en een geautomatiseerde fase die het mogelijk maakt meerdere beelden automatisch worden vastgelegd en gestikt in een enkel beeld.
3. Plaats de dia ondersteboven op de Microscoop fase, pas de dia positie en breng een kleine druppel onderdompeling olie op de achterkant van de glijbaan, waar de condensor lens contact met de dia.
4. Klik op de knop Live in de software-interface, en pas de belichtingstijd tegen een hoge concentratie standaard goed om ervoor te zorgen het beeld is niet verzadigd.
5. Open het venster grote afbeelding scannen op het tabblad overnemen en stel de software interface parameters als volgt in: macro image Optical conf = Current; Doelstelling: 2:10x, Scanning Optical conf = Current, doelstelling: 2:10x; Stiksels overlap ping = 20%; Stiksels via = optimaal pad.
6. Kies Maak grote afbeelding, sluit actieve sluitertijd tijdens het podium beweging, wacht voordat elke Capture: 20 MS, focus handmatig bij het begin, en het gebruik stap-voor-stap focus elke 20 veld. Deze instelling wordt opgeslagen met de gescande afbeeldingen.
7. Verplaats de Microscoop fase om de linker bovenkant rechtsonder grenzen van de target scan veld te definiëren. Pas de focus aan om een duidelijk beeld op de monitor te bereiken en pas de condensor-instellingen en omgevingsverlichting zo nodig aan om eventuele belichtings onregelmatigheden in het gefocuste beeld te minimaliseren.
8. Noem het beeld outputdossier in de software. Klik op de knop scannen en laat de Microscoop te scannen en te creëren en een gestikt beeld van de hele dia op te slaan.
9. Open de opgeslagen afbeelding met de Image Capture software die u gebruikt en sla het op 1/8 schaal voor de daaropvolgende analyse van de DSM-plugin in ImageJ.

7. DFM beeldanalyse

1. Download het ImageJ programma (https://imagej.nih.gov/ij/). Installeer de DSM Algorithm plugin in ImageJ met behulp van de instructies vermeld op https://imagej.net/Plugins#Installing_plugins_manually.
2. Open de ImageJ software en stel de volgende invoerparameters in binnen het DSM-algoritme: Contour drempel (CT) = 253,020, type = rood, middelste schaal (S) = 0,8, lage (lt)/High (HT) kwantificatie limiet = 0/62.
3. Open de opgeslagen afbeelding uit sectie 6,8 met ImageJ. Kies de DSM-scan knop op het tabblad Plug-ins en definieer vervolgens het aantal kolommen en rijen op basis van de geopende afbeelding. Het programma kan herkennen de detectie gebieden en de analyse van de spreiding intensiteit van nanodeeltjes in de gebieden automatisch. Stel de volgende invoerparameters in het DSM-scan venster in: Resize percentage = 25, Spot diameter (in pixels) = 190 – 200, diameter bereik = 32, increment diameter (in pixels) = 8, DSM-configuratie-laag Limit = 0, hoge limiet = 62, aangrenzende afstand = 100, aftrekken bias = 0.
   Opmerking: de resultaten van de Scatter-intensiteit van nanodeeltjes weerspiegelen de hoeveelheid gebonden exosomes op de dia.

Resultaten

Multi-well proteïne A/G met een laag bedekte dia's (Figuur 1a) werden gefunctioneerd met anti-EphA2 antilichaam en dan gebruikt om EphA2-positieve exosomes van serum steekproeven van patiënten met en zonder alvleesklier-kanker (1 µ l/well) specifiek te vangen en bebroede met goud nanorods vervoegd met een anti-CD9 antilichaam (Figuur 1b). DFM beelden van licht verspreid uit deze nanodeeltjes werden geanalyseerd met behulp van de DSM-plugin in ImageJ software om de gebonden EphA-2 positieve exosomes in elk goed te kwantificeren. Het DSM-algoritme definieert automatisch de grens van een monster, filtert het geluid van artefacten, berekent het verspreide signaal van elk goed en geeft deze informatie uit (Figuur 2). Het DSM-algoritme verzwakt sterk licht verstrooiende artefacten van krassen of puin aanwezig in het monster en verbetert de gevoeligheid en reproduceerbaarheid van nanodeeltjes detectie en kan automatisch een batch van dia-afbeeldingen verwerken voor een hoge doorvoersnelheid Gebruiken. Dit algoritme gebruikt ImageJ commando's en parameters input door de gebruiker om de Beeldachtergrond af te trekken, het verstrooiings signaal te berekenen van elk goed, en de uitgang van een Data-en image-bestand (Figuur 3). Regio's van belang zijn gedefinieerd door de hoge intensiteit goed grenzen in de Capture beeld met behulp van de contour drempel functie van de ImageJ macro-programma. Beeld analyses maken gebruik van een predefined contour drempel en beeld parameters om de intensiteit van de deeltjes spreiding voor elk goed te berekenen.

Zoals gerapporteerd in ons vorige werk (aanvullende informatie van Liang et al.⁶), exosomes GEÏSOLEERD van PANC-1 cel culturen die door transmissie worden gekenmerkt elektronenmicroscopie en westelijke vlek tentoongesteld de groottewaaier, de morfologie, en eiwit teller expressie in overeenstemming met een hoge zuiverheid exosoom monster. De PANC-1 exosomes, bereid met dezelfde procedure als ons vorige werk, werden hier gebruikt om onze nPES assay voor exosoom kwantificering te valideren. Deze analyse gebruikte een anti-EphA2 antilichaam om een grote bevolking van exosomes van de totale exosoom bevolking en een antilichaam tegen de algemene exosoom proteïne CD9 te vangen om gevangen exosomes te ontdekken. Resultaten verkregen met behulp van serieel verdunde PANC-1 exosoom monsters, met eiwit concentraties variërend van 0,24 tot 1,2 µ g/µ L, toonde goede reproduceerbaarheid in repliceren putten (figuur 4a) en een sterke lineaire correlatie tussen de spreiding respons en exosoom eiwitconcentratie (figuur 4b).

Om de potentiële toepassing van deze methode aan te tonen, werden de serum steekproeven van patiënten met en zonder alvleesklier-kanker geanalyseerd om de overvloed van serum exosomes te ontdekken die de kanker-bijbehorende biomarker EphA2 uitdrukt, gebruikend een anti-EphA2 antilichaam aan direct Capture target exosomes van serum en nanodeeltjes geconjugeerd met een anti-CD9 antilichaam op te sporen gebonden exosomes. Deze analyse bleek dat serummonsters van de alvleesklierkanker patiënten hadden significantly hogere niveaus van EphA2 + exosomes (Figuur 5) dan hun controles.

Figuur 1: exosoom kwantificatie schema. (A) schematische van multi-goed eiwit A/G dia's (192 putten) gebruikt in deze test. (B) doel exosomes worden rechtstreeks gevangen uit monsters, met inbegrip van serum en plasma, door oppervlakte immobilisatie op de Capture antilichaam (bijv. anti-EphA2 antilichaam) gebonden aan de glijbaan, en vervolgens uitgebroed met goud nanorods geconjugeerd met een detectie antilichaam (b.v. anti-CD9 antilichaam) vóór analyse door DFM beeldanalyse. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: exosoom kwantificering door het DSM-algoritme toe te passen op LMDFM images. Low-vergroting beelden worden verwerkt met de DSM-algoritme om achtergrond signaal en signaal artefacten die kunnen ontstaan door krassen, het mengen van vides, puin, en ongelijke steekproef verlichting te elimineren om robuuste detectie van goud nano staafje signaal, dat correleert met exosoom concentratie. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Sun, D. et al. Noise Reduction methode voor het kwantificeren van nanodeeltjes lichtverstrooiing in lage vergroting Dark-veld Microscoop ver-veld beelden. Analytische chemie. 88 (24), 12001-12005 (2016). Auteursrecht (2016) de Amerikaanse chemische maatschappij. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: schematisch van de DSM-algoritme opdrachten en-uitgangen. De vermelde stappen gebruiken inheemse bevelen van ImageJ en alle InputParameters worden geselecteerd volgens de vereisten van experimenten via grafisch gebruikersinterface. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Sun, D. et al. Noise Reduction methode voor het kwantificeren van nanodeeltjes lichtverstrooiing in lage vergroting Dark-veld Microscoop ver-veld beelden. Analytische chemie. 88 (24), 12001-12005 (2016). Auteursrecht (2016) de Amerikaanse chemische maatschappij. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: representatieve NPES LMDFM images en DSM output data. (A) LMDFM beeld van een nPES assay analyse van een concentratiegradiënt van PANC-1 exosomes en (B) de lineaire correlatie van het optische signaal en de exosoom concentratie van deze dia (van links naar rechts: 0,24, 0,356, 0,53, 0,80, 1,20 µ g/µ l respectievelijk voor elke kolom). De gegevens worden gepresenteerd als mean ± SE, n = 6, met een Pearson correlatiecoëfficiënt R² = 0,99 en coëfficiënt van variatie voor de replicatie van elke concentratie < 0,2. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: LMDFM signaal van EphA2⁺ exosomes verschilt in serum van patiënten met en zonder pancreaskanker. Serummonsters geanalyseerd door nPES met behulp van een anti-EphA2 Capture antilichaam (kanker-geassocieerde) en een anti-CD9 detectie antilichaam (General exosoom marker) tentoongesteld een significant verschil in de concentratie van EphA2 + exosomes in serummonsters van patiënten met en zonder pancreaskanker (N = 7/groep). De resultaten worden gepresenteerd als mean ± SE. * *p = 0,002 door Mann-Whitney U-test (dubbelzijdig). Dit cijfer is gewijzigd van [Sun, D. et al. Noise Reduction methode voor het kwantificeren van nanodeeltjes lichtverstrooiing in lage vergroting Dark-veld Microscoop ver-veld beelden. Analytische chemie. 88 (24), 12001-12005 (2016)]. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussie

Exosomes ontstaan uit gereguleerde invaginations van de buitenste endosome membraan dat de productie van multivesiculaire lichamen, een gespecialiseerde subset van endosomes die een groot aantal intraluminal blaasjes die fusie ondergaan met het plasmamembraan om volwassen release bevatten exosomes in de extracellulaire ruimte. Door deze biogenese pathway, exosomes kan dragen membraan-gebonden factoren geassocieerd met membraan fracties die bestaan uit of fuseren met de endosome membraan, evenals meerdere verschillende soorten cytosolische componenten, en dus bevatten ladingen van eiwitten, DNA en diverse subtypen van RNA (mRNAs, microase, lange non-coding ASE) die het fenotype van hun cel van oorsprong kunnen weerspiegelen²⁰. Aangezien exosomes worden afgescheiden door de meeste, zo niet alle soorten cellen, kan vertonen verhoogde secretie van zieke of kwaadaardige cellen, en accumuleren in de meeste lichaamsvloeistoffen, exosomes zijn het onderwerp van een alomvattend en systematisch onderzoek als een veelbelovende minimaal invasieve middelen om specifieke ziektevoorwaarden te ontdekken en hun reacties op behandeling²¹te controleren.

Exosoom isolatie, die nodig is voor de meeste huidige exosoom analyses, is een langdurige en arbeidsintensieve procedure, het beperken van de klinische vertaling van exosoom-geassocieerde biomarkers met potentiële medische relevantie. Veel gemeenschappelijke isolatie methoden (ultracentrifugation, grootte-uitsluiting, neerslag, enz.) vaak niet voldoende te onderscheiden exosomes (30-100 nm) van micro-blaasjes (100 – 1000 Nm) en apoptotic lichamen (100 – 5000 nm) als gevolg van overlappingen in hun grootte varieert of fysische eigenschappen of kan schade exosoom integriteit¹⁵. Nieuwe benaderingen zijn in ontwikkeling die kunnen toelaten meer snelle exosoom analyses, maar het is niet duidelijk hoe haalbaar het kan zijn om veel van deze platforms in de klinische instellingen te wijten te voeren.

In dit rapport presenteren we een nieuwe aanpak die het mogelijk maakt op nanodeeltjes gebaseerde High-throughput exosoom kwantificering met behulp van lage vergroting donkere veld Microscoop beelden. Deze methode vereist geen exosoom zuivering, dure dedicated apparatuur, of nieuwe technische expertise en moet dus vatbaar zijn voor snelle vertaling in de meeste onderzoek en klinische instellingen. Onze analyse kan worden toegepast om precies te kwantificeren van de concentratie van een doelgroep exosoom bevolking met een specifieke biomarker wanneer assay resultaten worden vergeleken met een standaard curve, omdat onze resultaten vertonen is er een sterke lineaire correlatie (R² = 0,99) tussen optische respons en exosoom concentratie. Om het echte potentieel van de wereld van deze benadering aan te tonen, hebben wij gegevens verstrekt waar wij deze methode aanwendden om de concentratie van een exosoom biomarker te kwantificeren verbonden aan alvleesklier-kanker in serum steekproeven die van patiënten met en zonder worden verkregen pancreaskanker.

In LMDFM, het hele monster goed is afgebeeld om te voorkomen dat de selectie bias gevonden in high-vergroting DFM analyses, waar gebruikers moeten direct kiezen voor de monster velden te vangen voor de daaropvolgende beeldanalyse, maar is onderworpen aan lichtverstrooiing artefacten van het oppervlak onregelmatigheden, met inbegrip van krassen en monster puin. Deze achtergrond kan worden verlaagd om Target exosoom-afgeleide signaal te detecteren met behulp van onze DSM Noise-reductie algoritme dat draait op de NIH Image Analysis Program, ImageJ, maar zorg moet nog worden genomen om te voorkomen dat de invoering van dergelijke artefacten die kunnen verminderen het dynamisch bereik van de assay.

Materialen gebruikt in deze test:

Multi-well superprotein A/G dia's Holding 1 µ L/well werden gekocht bij Arrayit Corporation (AGMSM192BC). Nanodeeltjes werden verkregen uit Nanopartz (C12-25 -650-TN-DIH-50-1, 6,4 x 10¹²/ml). DFM beelden werden gevangen met een Nikon map2 digitale camera bevestigd aan een Nikon Ti-Eclipse Microscoop, met consistente verlichting en een 1/220 s belichtingstijd. De PANC-1 Cell lijn gebruikt in deze studie werd gekocht van de American Type Culture Collection.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Eppendorf Repeater stream	Fisher Scientific	05-401-040
Eppendorf Research plus	Eppendorf	3120000011	0.1 – 2.5 µL, donker grijs
Functionalized Gold Nanorods	Nanopartz	C12-25-650-TN-DIH-50-1	In vitro neutravidin polymeer functionalisatie
HulaMixer Sample Mixer	Thermo Fisher Scientific	15920D
Incu-shaker 10L	Benchmark Scientific	H1010
Inverted Research Microscope	Nikon	Ti-DH	Met Dark field condensor, DS-Ri2 camera, en Ti-SH-U universele houder, en gemotoriseerde stage
NIS-Elements	Nikon		Microscoop beeldvormingssoftware
Phosphate Buffered Saline (1X)	GE Healthcare Life Sciences	SH30256.02	HyClone
Protein A/G Treated Glass Substrate Slides	Arrayit Corp.	AGMSM192BC	Premium microarray substraat
Q500 Sonicator	Qsonica, LLC	Q500-110	Met standaard sonde (#4220)
Superblock blocking buffer	Thermo Scientific
TWEEN 20	Sigma Life Sciences	9005-64-5