Malignant en Non-Malignant B cellen isoleren uit lck:eGFP zebravis

Samenvatting

Transgene lck:eGFP zebrafish express GFP zeer in T lymfocyten en zijn gebruikt voor het bestuderen van de T cel ontwikkeling en acute lymfatische leukemie. Deze regel kan worden gebruikt voor studie B-cellen, die lck op lagere niveaus uitdrukken. Dit protocol beschrijft zuivering van kwaadaardige en niet-kwaadaardige B-cellen uit lck:eGFP zebrafish.

Samenvatting

Zebrafish (Danio rerio) zijn een krachtig model om te studeren lymfocyt ontwikkeling. Zoals zoogdieren bezitten D. rerio een adaptieve immuunsysteem waarin B en T-lymfocyten. Studies van zebravis lymphopoiesis zijn moeilijk, omdat de antistoffen herkennen D. rerio cel oppervlakte markeringen zijn doorgaans niet beschikbaar, complicerende isolatie en karakterisatie van verschillende lymfocyt bevolking, met inbegrip van B-geslacht cellen. Transgene lijnen met geslacht-specifieke fluorophore expressie worden vaak gebruikt voor het omzeilen van deze uitdaging. De transgene lck:eGFP lijn is gebruikt voor het bestuderen van D. rerio T cel ontwikkeling en is ook gebruikt voor model T cel ontwikkeling en acute lymfatische leukemie (T-ALL). Hoewel lck:eGFP vis wijd gebruikt zijn voor het analyseren van de T-bloedlijn, zijn ze niet gebruikt om te studeren van B-cellen. Onlangs ontdekten we dat veel zebrafish B-cellen ook express lck, weliswaar op lagere niveaus. Lck:eGFP B cellen express bijgevolg eveneens lage niveaus van GFP. Op basis van deze bevinding, ontwikkeld wij een protocol om te zuiveren van B-bloedlijn cellen uit lck:eGFP zebrafish, die wij hier rapporteren. Onze werkwijze wordt beschreven hoe u gebruik maken van een TL-geactiveerde cel sorter (FACS) om te zuiveren van B-cellen van de lck:eGFP vis of verwante lijnen, zoals dubbel-transgene rag2:hMYC; lck:eGFP vis. In deze lijnen, B-cellen, zodat vooral onvolwassen B-cellen, uitdrukkelijke GFP op laag maar detecteerbare niveaus, ze kunnen worden onderscheiden van T-cellen, die zeer GFP uitdrukken. B cellen kunnen worden geïsoleerd uit het beenmerg, thymus, milt, bloed of andere weefsels. Dit protocol biedt een nieuwe methode om te zuiveren van D. rerio B-cellen, waardoor studies gericht op onderwerpen zoals B cel ontwikkeling en B-lymfocyt maligniteiten.

Inleiding

Zebravis bieden krachtige kenmerken, zoals genetische oorlogsmachinerie, hoge vruchtbaarheid, optische translucentie en snelle ontwikkeling die studeren gewervelde ontwikkelen met behulp van genetische benaderingen te vergemakkelijken. Deze voordelen, samen met de gedeelde kenmerken van teleost en zoogdieren Haematopoiese, maken D. rerio ideaal voor in vivo analyses van lymphopoiesis en lymfocyt functie, vanaf hun vroegste verschijning in larven in de volwassenheid. Bloed ontwikkeling in zebrafish berust op goed geconserveerde genetische processen die worden gedeeld met zoogdieren, en deze uit te breiden naar het adaptieve immuunsysteem. Moleculaire mechanismen bestuur lymfoïde ontwikkeling zijn bovendien opmerkelijk bewaard tussen zebravis en zoogdieren¹.

In de afgelopen 2 decennia, transgene D. rerio lijnen dat etiket specifieke bloed lineages en mutant lijnen tekort aan deze geslachten zijn^2,3,4,5gemaakt. Een van deze, de transgene lijn van lck:eGFP , gebruikt de zebravis lymfocyt eiwit tyrosine kinase (lck) promotor voor GFP expressie⁶. Dit gen, die sterk wordt uitgedrukt door zowel T-bloedlijn precursoren en volwassen T-lymfocyten, kan in vivo bijhouden van de ontwikkeling van de serie T-cel en ex vivo zuivering van T-bloedlijn cellen door FACS⁷. Eerder, we gebruikten deze regel in een voorwaarts-genetische ENU mutagenese scherm te identificeren germline mutanten vatbaar voor T-ALL en te bestuderen somatically verworven genetische gebeurtenissen gekoppeld aan T cel oncogenese^8,9.

Ons laboratorium verder breidden het nut van lck:eGFP zebrafish. In dubbel-transgene rag2:hMYC (menselijke MYC), lck:eGFP D. rerio waarvan bekend is dat het ontwikkelen van T-ALL ¹⁰, ontdekten we dat B-bloedlijn allemaal ook optreden¹¹. In tegenstelling tot T-ALL in dit model, die lichten helder als gevolg van hoge GFP expressie, B-ALL zijn vaag-belichting fluorescerende als gevolg van lage GFP niveaus, waardoor vis met B-ALL te onderscheiden Grove van degenen met T-ALL door fluorescent microscopie. Deze differentiële GFP-expressie staat ook de scheiding van GFP^lo B-ALL cellen van GFP^Hallo T-ALL cellen met behulp van FACS¹¹. Bovendien, lage lck expressie is niet uniek voor zebrafish B-ALL, als menselijke B-ALL ook express lage niveaus van LCK^11,12. Ook de normale B-bloedlijn cellen van D. rerio, muizen en mensen ook lage niveaus van lckexpress /Lck/LCK, met onrijpe B-cellen die de hoogste expressie^11,13. Op basis van het per cel express B-bloedlijn cellen lckeGFP zebrafish of afgeleide regels 1-10% zoveel GFP als T-lymfocyten. Deze GFP^lo cellen uitdrukkelijke karakteristiek B-cel mRNAs zoals pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighz, en anderen, en gezuiverd kan worden uit het beenmerg, thymus, milt of randapparaat bloed¹¹. Daarom beide B - en T-bloedlijn cellen kunnen, geïsoleerd uit lckeGFP zebrafish, en in het geval van rag2hMYC, lckeGFP dieren, B - en T-ALL cellen ook¹¹.

Hier presenteren we ons protocol naar efficiënt FACS-zuiveren niet-maligne B cellen van lck:eGFP zebrafish, en niet-kwaadaardige of kwaadaardige B-cellen van de rag2hMYC; lck:eGFP vis, met behulp van verschillende weefsels van de bron. Deze cellen kunnen eveneens worden gekwantificeerd door stroom cytometry zonder FACS isolatie, indien gewenst. Ontdekking van lage lck expressie- en dus lage GFP expressie-door B cellen opent nieuwe deuren voor experimentele mogelijkheden voor lckeGFP zebrafish, zoals in vivo B cel developmental studies. Dus, deze transgene lijn, eerst gemeld in 2004, heeft nieuw leven zoals we willen gebruiken om te achterhalen van de nieuwe inzichten inzake de zebravis adaptieve immuniteit.

Protocol

Alle procedures waarbij zebrafish werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) op de Universiteit van Oklahoma Health Sciences Center.

1. het isoleren van niet-kwaadaardige B en T-lymfocyten van transgene lck:eGFP vis

1. Anesthetize de vis met behulp van 0,02% tricaïne (MS-222) in vis systeem water.
2. Onderzoeken van 2 – 6 maand oud vis voor TL thymi, die zich bevinden op het aspect van de dorsomedial van de branchial holte van zebravis en andere teleosts¹⁴. Gebruik een epifluorescence Microscoop (470/40 excitatie golflengte en 525/50 emissie filter) te detecteren GFP.
3. Bereiden in 50 mL filter-gesteriliseerde 1 x Roswell Park Memorial Instituut Medium (RPMI) met 1% foetale boviene serum en 1% penicilline-streptomycine (sorteren media). Ongebruikte sorteren media kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor maximaal 2 maanden.
4. De vis euthanaseren door deze te plaatsen in een bekerglas van 0,2% tricaïne voor ongeveer 5 min, gevolgd door ijs bad onderdompeling. Bevestig dood door de beëindiging van de operculaire (gill) beweging.
5. Plaats de euthanized vis in een petrischaal en ontleden van lymfoïde organen van belang, met behulp van de fluorescente microscoop te ontleden de GFP⁺ thymi¹⁴, en de lichte microscopie Veldinstellingen de nier merg en milt¹⁵ontleden. Resultaten die hier gepresenteerd werden verkregen met behulp van 3 maand-oude vis. Lymfocyt proporties en absolute aantallen variëren per leeftijd en genotype (zie bespreking voor verder detail).
6. Plaats elke ontleed orgel in een tube van 1,5 mL met 500 µL van koude media sorteren.
7. Meng het weefsel op het ijs met behulp van een stamper micro-buis homogenizer.
8. Gehomogeniseerde weefsel passeren een 35 µm mesh filter voor het genereren van een enkel celsuspensie. Houd de cellen op het ijs tot analyse.

2. het isoleren van maligne lymfocyten van Double-transgene rag2:hMYC; lck:eGFP zebravis

1. Beginnen bij 2-4 maanden, microscopisch scherm rag2:hMYC; lck:eGFP vis voor abnormale GFP patronen.
   Opmerking: B cellen zijn GFP^lo op de achtergrond van de lck:eGFP , dus B-ALL praktijk vereist te herkennen; T-ALL is duidelijk, omdat T-cellen GFP^{Hallo zijn}. Bijgevolg, het rag2:hMYC, lck:eGFP dual-transgene lijn heeft twee fenotypes: helder-belichting fluorescerende T-ALL, die meestal ontstaan uit de zwezerik en uit te breiden naar het lichaam, en vaag-TL B-ALL.
   1. De vis met behulp van de "lage" belichtingsinstellingen (200 ms, 2,4 x winst) om heldere T-ALL (figuur 1A) en "hoge blootstelling" te identificeren met behulp van een fluorescente microscoop, scherm (1.5 s, 3.4 x winst) om te identificeren dim B-ALL (figuur 1A). WT besturingselementen en vooraf leukemische vis hebben GFP gelokaliseerd alleen in de thymus (figuur 1B).
2. Anesthetize en onderzoeken van de vis zoals beschreven in stappen 1.1-1.2.
3. Categoriseren van de vis die op basis van de omvang van GFP fluorescentie, met behulp van een eenvoudig drie categorieënsysteem:
   Opmerking: Niveau 1: Fluorescentie blijkt als een serie tumor met slechts beperkte lokale verspreiding.
   Niveau 2: Fluorescentie blijkt dan de thymus, waarbij < 50% van het lichaam.
   Niveau 3: Fluorescentie overschrijdt 50% van het lichaam.
4. Scheid de vis met allemaal van die zonder kanker. Toezicht vooraf leukemische vis (dat wil zeggen, de vis zonder GFP⁺ tumoren) eens maandelijks voor de ontwikkeling van nieuwe ALL. Door ~ 9 maanden, alle rag2:hMYC, lck:eGFP vis ontwikkelen T-ALL, B-ALL, of beide.
5. Voor T - of B-ALL cel isolatie, selecteer niveau 3 vis (alle waarbij > 50% van het lichaam), die opbrengst meer dan 2 x 10⁶ alle cellen, en meestal veel meer.
6. Euthanaseren van de vis zoals in stap 1.4.
   Opmerking: Er zijn twee methoden voor het verkrijgen van alle cellen: hele lichaam homogenisering en een peritoneale wassen techniek¹⁶. De methoden verschillen in het absolute aantal cellen verzameld voor het sorteren, en dus de hoeveelheid FACS tijd vereist en kosten (zie bespreking voor verder detail).
7. Voor beide methoden, eerst plaatst u de euthanized vis in een petrischaal en het hoofd met inbegrip van de serie regio met een scheermesje, verwijderen. Dit kan apart als gewenst, of voor histologisch kleuring gebruikt worden verwerkt.
8. Peritoneale Wash methode
   1. Met behulp van een pipet P1000, wassen de vis peritoneale holte met 500 µL van koude sorteren van media, het verzamelen van de cellen en de media in een tube van 5 mL.
   2. Met behulp van een verse pipette uiteinde, injecteren een extra 200-300 µL van koude sorteren media in de lichaamsholte. Vervolgens met behulp van het uiteinde van de pipet, zachte druk uitoefenen op het lichaam van de vis te extruderen van de cellen uit de lichaamsholte. Het verzamelen van deze media en toevoegen aan de tube van 5 mL.
   3. Herhaal stap 2.8.2 2 tot 3 keer. Houd de verzamelde cellen sorteren van media op het ijs.
   4. Filter de celsuspensie al een maaswijdte van 35 µm filter voorafgaand aan stroom cytometry/FACS en houden van de cellen op het ijs tot analyse.
9. Hele lichaam homogenisering
   1. Na het verwijderen van het hoofd van de vis, het lichaam in een tube van 1,5 mL met 200 µL van het sorteren van de media te plaatsen.
   2. Meng het lichaam met behulp van een stamper micro-buis homogenizer.
   3. Voeg een extra 300 µL van koude media sorteren. Filter de celsuspensie al een 35 µm mesh filter. Sorteer media toevoegen als nodig te wassen van alle cellen door het filter, totdat alleen weefsel puin op het filter blijft. Houd de cellen op het ijs tot analyse.

3. cytometrische analyse van normale of kwaadaardige B-lymfocyten

1. Set flow cytometrische analyse en/of FACS parameters volgens fabrikant gids.
2. Gewenste aantal gebeurtenissen te karakteriseren in eerste instantie het monster te verwerven. 1 x 10,⁴ , 5 x 10⁴ gebeurtenissen vóór sorteren aan de hand van specifieke poorten voor latere sorteren stappen te analyseren.
   1. Poorten bepalen: Define lymfocyt en progenitor cel poorten met voorwaartse scatter (FSC) en kant scatter (SSC) parameters, met uitzondering van cellulaire puin (figuur 2A-C)¹⁷. FSC en SSC corresponderen met de cel grootte/diameter en granulariteit, respectievelijk.
      Opmerking: GFP^-, GFP^loen GFP^Hallo cellen verschillen 10-tot-100-Vouw in termen van de intensiteit van de fluorescentie GFP, maken van de scheiding van deze populaties eenvoudig (cijfers 2-5). Live-dode discriminatie kan worden beoordeeld op dit punt met behulp van propidium jodium (PI) of 7-aminoactinomycin D (7-AAAD) levensvatbaarheid kleuring. Eerdere experimenten met PI typisch tonen > 95% levensvatbaarheid van cellen van het GFP⁺ na FACS.
   2. Het uitsluiten van de cel paren, volgens de parameters van de FACS machine wordt gebruikt.
   3. Binnen de lymfe en/of precursor poorten, bepaalt het aantal en percentage van GFP⁺ cellen.
3. Gebruik phycoerythrin (PE) en GFP intensiteiten, gate definiëren voor GFP^- vs. GFP^lo vs. GFP^Hallo cellen.
   Opmerking: B cellen dim GFP fluorescentie vertonen en T-cellen in lck:eGFP lijnen helder GFP weergeven. Vele lymfoïde organen of tumor monsters bevatten beide populaties GFP⁺ . B-bloedlijn cellen/B-ALL GFP^lo en T-bloedlijn cellen/T-ALL zijn GFP^Hallo. Gates onderscheid maken tussen GFP^-, GFP^loen GFP^Hallo cellen te definiëren en verzamelen van deze bevolkingsgroepen afzonderlijk (figuur 2A-C, figuur 3A-C, figuur 4A en figuur 5a).
4. Sorteren van de bevolking van elke cel in verschillende 15 mL polypropyleen buizen met 2 mL media sorteren, of rechtstreeks in verschillende 1,5 mL tubes met een geschikte buffer voor verdere analyses (bijv. RNA, DNA of eiwit extractie, allo-transplantatie, enz.).
5. Houd gezuiverde cellen op ijs voorafgaand aan verdere analyses.

Resultaten

We gebruikten stroom cytometry te analyseren en FACS om GFP^lo en GFP^Hallo cellen van zwezerik, beenmerg van de nier en milt van lck:eGFP transgene zebrafish te isoleren. Analyse van 3-maand-oude vis bleek dat de zwezerik bevatte meestal GFP⁺ lymfocyten. GFP⁺ cellen werden grotendeels beperkt tot de lymfoïde poort eerder beschreven door Traver et al.¹⁷. Twee verschillende populaties van GFP⁺ , GFP^l...

Discussie

Wij bieden een protocol om te isoleren van de B-cellen uit lck:eGFP transgene zebrafish, het toevoegen van deze tot andere D. rerio modellen met B-bloedlijn etiketten^3,4en ontwikkeld. Enigszins verrassend, ging de identificatie van GFP^lo B cellen in deze lijn onopgemerkt sinds de bijbehorende beschrijving in 2004. In het algemeen lck wordt beschouwd als T-cel-specifieke⁶, maar recente studies gevonden ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
35 µm mesh	Sefar Filter technology	7050-1220-000-13
5 mL Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap	Falcon Corning Brand	352235
50 mL conical tube	VWR international	525-0448
AZ APO 100 Fluorescent microscope	Nikon
Cytoflex	Beckman Coulter
DS-Qi1MC camara	Nikon
Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222	Sigma	E-10521
FACSJazz	BD Biosciences
Fetal bovine Serum	Thermo Fisher	10437028
FlowJo v10.2	FlowJo, LLC
lck:eGFP			Zie Langeneu et al., 2004
NIS Elements software	Nikon	Versie 4.13
Penicilin-Streptomycin	Sigma	P4333
Pestle micro-tube homogenizers	Electron Microscopy Sciences	64788-20
Plastic Transfer pippetes
rag2:hMYC-ER			Zie Gutierrez et al., 2011
RPMI Media 1640 1x	Life Technologies	11835-030