Methodenartikel

Medium-throughput Screening tests voor de beoordeling van effecten op Ca2 +-signalering en Acrosoom reactie in het menselijk sperma

DOI:

10.3791/59212

⸱

1 maart 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Growth and Reproduction, Copenhagen University Hospital, 2International Center for Research and Research Training in Endocrine Disruption of Male Reproduction and Child Health (EDMaRC), University of Copenhagen

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier, twee medium-throughput assays voor de beoordeling van effecten op Ca2 +-signalering en Acrosoom reactie in het menselijk sperma worden beschreven. Deze tests kunnen worden gebruikt om te sluiten snel en eenvoudig grote hoeveelheden compounds voor effecten op Ca2 +-signalering en Acrosoom reactie in het menselijk sperma.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CA2 +-signalering is essentieel voor normale spermacel functie en mannelijke vruchtbaarheid. Ook is de Acrosoom reactie essentieel voor het vermogen van een menselijke spermacel bevruchten van de eicel te doordringen van de zona zitten. Het is daarom van groot belang voor het testen van de verbindingen (bijvoorbeeld milieu chemicaliën of drugkandidaten) voor hun effect op Ca2 +-signalering en Acrosoom reactie in het menselijk sperma te onderzoeken van de potentiële schadelijke effecten op de menselijke spermacel functie of om te onderzoeken een mogelijke rol als een voorbehoedsmiddel. Hier twee medium-throughput assays worden beschreven: 1) een fluorescentie gebaseerde assay voor de beoordeling van effecten op Ca2 +-signalering in menselijk sperma, en 2) een kwantitatieve analyse van beeld, cytometrische voor beoordeling van Acrosoom reactie in het menselijk sperma. Deze tests kunnen worden gebruikt om een groot aantal compounds voor effecten op Ca2 +scherm-signalering en Acrosoom reactie in het menselijk sperma. Bovendien, de testen te genereren zeer specifieke dosis / respons-curven van afzonderlijke verbindingen, potentiële additiviteit/synergie voor twee of meer verbindingen bepalen, en te bestuderen van het farmacologische werkingsmechanisme via competitieve remming kunnen worden gebruikt experimenten met CatSper-remmers.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van de twee tests die hier beschreven is het onderzoeken van de effecten op Ca2 +-signalering en Acrosoom reactie in het menselijk sperma, zoals is aangetoond voor meerdere verbindingen in diverse publicaties met deze testen1,2, 3,4,,5,,6,7. CA2 +-signalering en de Acrosoom reactie zijn beide essentieel voor normale menselijke spermacel functie en mannelijke vruchtbaarheid.

Het algemene doel van een menselijke zaadcel is om te bevruchten het ei. Om te kunnen met succes en natuurlijk bevruchten het ei, moeten de functies van de spermacel strak worden geregeld tijdens de reis van de spermacel tot en met het vrouwelijke voortplantingssysteem8,9. Veel van de functies van de spermacel worden geregeld via de intracellulaire Ca2 +-concentratie [Ca2 +]ik (bijvoorbeeld een sperma motiliteit, chemotaxis en Acrosoom reactie)10. Ook is een rijpingsproces genaamd rechtsbevoegdheid, waardoor de spermacel kan de eicel bevruchten, deels gereguleerd door [Ca2 +]ik10. CA2 +-diepte Ca2 +-ATPase pompen11 handhaven een ongeveer 20.000 vouw Ca2 +-gradiënt over het menselijk sperma celmembraan, met een rust [Ca2 +]ik van 50-100 nM. Als Ca2 + is toegestaan te steken van de celmembraan (bijvoorbeeld door de opening van Ca2 +-kanalen), een flinke toestroom van Ca2 + optreedt, die aanleiding geven tot een hoogte van [Ca2 +]ik. De spermacel draagt echter ook intracellulaire Ca2 +-winkels, die Ca2 vrijkomen kunnen + en, derhalve, ook geven een hoogte van [Ca2 +]i12stijgen. Interessant is dat alle kanaal-gemedieerde Ca2 +-instroom in menselijke zaadcellen tot nu toe is gebleken dat optreden via CatSper (katIonische kanaal van Sperm), die alleen wordt uitgedrukt in zaadcellen11. In menselijke zaadcellen, CatSper wordt geactiveerd door de endogene liganden progesteron en prostaglandines via verschillende ligand bindend sites13,14,15, leiden tot een snelle Ca2 +-instroom in de spermacel. Twee hoofdbronnen in de buurt van het ei bevatten hoge niveaus van deze endogene liganden. Een is de folliculaire vloeistof die hoge niveaus van progesteron16 bevat. De folliculaire vloeistof wordt vrijgelaten uit de rijpe follikels samen met de eicel bij ovulatie en mixen met de vloeistof binnen de oviducts17. De andere belangrijkste bron is de cumulus cellen die omringen het ei en vrijgeven van hoge niveaus van progesteron en prostaglandines. De progesteron geïnduceerde Ca2 +-instroom in de zaadcellen heeft aangetoond dat bemiddelen chemotaxis naar de ei9,18,19,20 van de beweeglijkheid van de zaadcellen bepalen en stimuleren het Acrosoom reactie21. Triggering van deze individuele [Ca2 +]ik-gereglementeerde sperma functies in de juiste volgorde en op het juiste moment is van cruciaal belang voor de bevruchting van de eicel8. In overeenstemming met deze, een suboptimaal progesteron geïnduceerde Ca2 +-instroom is gebleken dat geassocieerd met verminderde mannelijke vruchtbaarheid22,23,24,25,26 ,27,28,29 en functionele CatSper is essentieel voor de mannelijke vruchtbaarheid26,30,31,32, 33,34,35,,36.

Als de zaadcellen de eicel te bereiken, een opeenvolging van gebeurtenissen moet plaatsvinden voor bevruchting optreden: 1) de zaadcellen moeten doordringen in de omringende cellaag van cumulus, 2) binden aan de zona zitten, 3) de acrosomal inhoud, de zogenaamde Acrosoom reactie exocytose 37, 4) dringen de zona zitten, en 5) zekering met het membraan van de eicel te voltooien bevruchting38. Om te kunnen deze stappen doorlopen en bevruchten het ei, moet de spermacel eerst rechtsbevoegdheid11, die begint als de zaadcellen verlaten de zaadvocht vloeistof met "decapacitating" factoren39 en in het vocht van de vrouw zwemmen ondergaan voortplantingssysteem met hoge niveaus van bicarbonaat en albumine37. Rechtsbevoegdheid maakt kundig voor hyperactivering, een vorm van beweeglijkheid met een krachtige gewonnen van het flagellum en Acrosoom reactie37ondergaan de zaadcellen. De beweeglijkheid van de Hyperactivated is vereist voor de penetratie van de zona zitten40, en de Acrosoom bevat verschillende hydrolytische enzymen die deze penetratie proces41 helpen. Bovendien maakt de Acrosoom reactie de zaadcellen kunnen versmelten met het ei door specifieke membraaneiwitten op het sperma oppervlak nodig voor sperma-ei fusion42bloot te leggen. Bijgevolg, het vermogen om te hyperactivering en Acrosoom reactie ondergaan zijn beide nodig zijn voor een succesvolle bevruchting van de eicel40,42. In tegenstelling tot wat is gezien voor muis zaadcellen43,44,45, kunt alleen menselijk sperma cellen die Acrosoom-intacte binden aan de zona zitten46. Wanneer de menselijke zaadcellen zijn gebonden aan de zona zitten die zij moeten ondergaan de Acrosoom reactie te doordringen van de zona zitten41 zowel specifieke membraaneiwitten die nodig zijn voor de fusie met de ei-38bloot te stellen. De timing van de Acrosoom reactie in het menselijk sperma is dus essentieel voor bevruchting optreden.

Zoals hierboven beschreven, Ca2 +-signalering is van vitaal belang voor sperma van normale cel functie8, en het is daarom van groot belang voor zitten kundig voor scherm groot aantal compounds voor effecten op Ca2 +-signalering in menselijke zaadcellen. Op dezelfde manier zoals alleen menselijke zaadcellen die ondergaan Acrosoom reactie op de juiste tijd en plaats kan doordringen van de zona zitten en het ei46,47 bevruchten, is het ook van groot belang om het testen van de verbindingen om hun vermogen om te kunnen invloed op de reactie van de Acrosoom in menselijk sperma. Te dien einde twee medium-throughput screening tests worden beschreven: 1) een bepaling voor effecten op Ca2 +-signalering in menselijke zaadcellen, en 2) een bepaling voor de capaciteit voor het opwekken van Acrosoom reactie in menselijke zaadcellen.

Assay 1 is een medium-doorvoer Ca2 +-signalering assay. Deze fluorescentie plaat lezer gebaseerde techniek registreert wijzigingen in fluorescentie als functie van de tijd gelijktijdig in meerdere wells. De Ca2 +-gevoelige fluorescente kleurstof, Fluo-4 heeft een Kd voor Ca2 +≈ 335 nM en is cel-permeant in de vorm van de ester AM (acetoxymethyl). Met behulp van Fluo-4, is het mogelijk voor het meten van veranderingen in [Ca2 +]i na verloop van tijd en na toevoeging van verbindingen van belang zijn voor de zaadcellen. De test werd ontwikkeld door het laboratorium van Timo Strünker in 201113 en wordt sindsdien gebruikt in verschillende studies naar scherm verbindingen voor effecten op Ca2 +-signalering in menselijk sperma1,2,3, 4,5. Ook is een gelijkaardige methode gebruikt om het scherm van meerdere drugs kandidaten48. Bovendien, is deze test ook nuttig voor de beoordeling van de farmacologische modus van actie1,2,3,4,5, dosis / respons-curven1, 2,3,4,5, competitieve remming1,2, additiviteit1,2en synergie3 van verbindingen van belang.

Assay 2 is een medium-doorvoer Acrosoom reactie test. Deze afbeelding cytometer gebaseerde techniek meet de hoeveelheid levensvatbare Acrosoom reageerde zaadcellen in een monster met behulp van drie fluorescente kleurstoffen: propidium jodide (PI), FITC-coupled lectine van Pisum sativum (FITC-PSA) en Hoechst-33342. De bepaling van een gelijkaardige stroom cytometry gebaseerde methode is bewerkt door Zoppino et al.49 en is gebruikt in diverse studies6,7. Wat betreft de Ca2 +-signalering assay, deze Acrosoom reactie test kan ook worden gebruikt om te beoordelen van de dosis / respons-curven, remming, additiviteit en synergie van stoffen van belang.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De verzameling en analyse van menselijk sperma monsters in de protocollen volgt de richtsnoeren van de ethische commissie van onderzoek voor de regio van de hoofdstad van Denemarken. Alle sperma monsters zijn verkregen na de geïnformeerde toestemming van vrijwillige donoren. Na de levering, de monsters werden volledig anoniem gemaakt. Voor hun ongemak ontvangen elke donor een vergoeding van 500 DKK (ongeveer $75 dollar) per monster. De monsters werden geanalyseerd op de dag van levering en vervolgens vernietigd onmiddellijk na de laboratoriumexperimenten.

Opmerking: De middellange doorvoer Ca2 +-signalering assay wordt beschreven in stap 4 en 5 en de middellange doorvoer Acrosoom reactie kwantitatieve analyse in stap 6-7. Het protocol bij het bereiden van menselijke tubal vloeistof (HTF+) medium wordt beschreven in stap 1 en de zuivering van zaadcellen voor het testen wordt beschreven in stappen 2-3.

1. bereiding van menselijke Tubal vloeistof (HTF+) Medium

Opmerking: De volumetrische kolven gebruik van passende grootte, een 1 L meten cilinder, een magneetroerder, zouten zoals vermeld in tabel 1 en tabel 2, gezuiverd water, een 0,2 µm porie filter en 50 mL plastic buizen.

  1. Bereiden van stamoplossingen van zouten in gezuiverd water (tabel 1).
    1. Toevoegen van de hoeveelheid zout die zijn vermeld in tabel 1 over in een volumetrische maatkolf van de juiste grootte, gezuiverd water toevoegen aan een beetje hieronder het gewenste volume en meng goed met een magneetroerder.
    2. Wanneer het zout wordt volledig ontbonden, verwijder de magneet en de opvulling met gezuiverde water tot de gewenste eindvolume.
  2. Stockoplossing overbrengen in een fles en bewaar tot gebruik.
    Opmerking: Stamoplossingen gehouden en opnieuw gebruikt voor langere tijd kunnen worden: glucose en HEPES bij-20 ° C en de andere voorraadoplossingen bij kamertemperatuur (RT).
  3. Bereiden 1 L van HTF+ medium van stamoplossingen (tabel 2).
    1. Ervoor zorgen dat alle stamoplossingen volledig is opgelost en goed gemengd vóór gebruik.
    2. Het bedrag van de stockoplossing en zout vermeld in tabel 2 van een 1 L cilinder meten en voeg gezuiverd water toe tot 900 mL.
    3. Meng goed met een magneetroerder en pH 7,35 met NaOH-oplossing aan te passen.
    4. Verwijder van de magneet en voeg gezuiverd water tot 1000 mL.
  4. Steriele filtraat HTF+ medium via een 0,2 µm porie filter, aliquoot HTF+ gemiddeld 50 mL plastic buizen te bewaren bij 4 ° C tot gebruik.
  5. Net voor het uitvoeren van een experiment, voeg toe 165 µL van nb-pyruvaat aan het afgepipetteerde deel 50 mL. om een eindconcentratie van de nb-pyruvaat van 0.33 mM.
    Opmerking: Menselijke tubal vloeibaar medium kan ook verkregen worden bij verschillende commerciële aanbieders. Bij het gebruik van het 4 mM HCO3- medium, kunnen monsters worden geïncubeerd met gesloten deksels in een incubator zonder extra CO2 in de lucht zonder grote driften in pH. Als een CO2 incubator beschikbaar is, kunnen de overeenkomstige hoeveelheid CO2 kan worden berekend met behulp van de Henderson-Hasselbalch vergelijking en gebruikt. Als het 25 mM HCO3- medium gebruikt, moeten monsters worden geïncubeerd met open deksels in een incubator CO2 met lucht met een overeenkomstige hoeveelheid CO2 (afhankelijk van de luchtdruk, meestal tussen 5-10%) om te voorkomen dat een drift in pH. De exacte hoeveelheid CO2 kan worden berekend met behulp van de Henderson-Hasselbalch vergelijking.

2. de zuivering van Motile zaadcellen via Swim-up (figuur 1)

Opmerking: Gebruik een schone Wijdmondse plastic container voor het sperma monster, een incubator, een rek voor 50 mL plastic buizen te plaatsen in een hoek van 45°, HTF+ medium (bereid in stap 1 of verkregen van commerciële aanbieder), een centrifuge en menselijk serum 50 mL plastic buizen albumine (HSA).

  1. Het verkrijgen van een vers gedoneerde menselijke sperma monster geproduceerd via masturbatie en ejaculatie in een Wijdmondse schone plastic container. Gebruik alleen sperma monsters die voldoen aan de parameters vastgesteld door de WHO laboratorium handleiding voor onderzoek en behandeling van menselijk sperma.
  2. Incubeer het monster bij 37 ° C gedurende 15-30 minuten toe te staan tot het vloeibaar.
  3. Opwarmen van 50 mL HTF+ medium met 4 mM HCO3- tot 37 ° C.
  4. Plaats schoon 50 mL plastic buizen in een rek op een hoek van 45° (om de oppervlakte tussen vloeistoffen). Gebruik 1 tube per mL rauwe sperma.
  5. Voeg 4 mL van het voorverwarmde HTF+ -medium aan elk van de buizen.
  6. Zorgvuldig Pipetteer 1 mL van het monster vloeibaar sperma naar de onderkant van elke buis met 4 mL voorverwarmde HTF+. Voorkom lozing van luchtbellen.
  7. Sluit de deksels en Incubeer de buizen bij 37 ° C gedurende 1 uur.
  8. Zachtjes gecombineerd en breng zoveel mogelijk van het bovenste gedeelte (HTF+ met motile zaadcellen) mogelijk naar een nieuwe plastic tube van 15 mL, terwijl de aandacht dat er niets uit de bodem afvalfractie (sperma met immotile en dode cellen) opgenomen is. In het algemeen, is het veilig overbrengen van 3,5 mL van het bovenste gedeelte, zonder verstoring van de Fractie van de bodem. Voorkom zuig turbulentie, afsnijden de ultraperifere 1-2 mm van het uiteinde van de pipet op een hoek van 45° te verkrijgen van een grotere opening.
  9. Vullen van de kunststof tube van 15 mL met HTF+ te wassen van cellen en centrifugeer de buis bij 700 x g gedurende 10 minuten op RT.
  10. Zachtjes gecombineerd en verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet zaadcel in 2 mL zuiver HTF+.
  11. Breng 20 µL van de schorsing van het sperma aan twee kleine plastic buizen voor de beoordeling van de concentratie sperma (zie stap 3).
  12. Vullen van de kunststof tube van 15 mL met HTF+ te wassen van cellen en centrifugeer de buis bij 700 x g gedurende 10 minuten op RT.
  13. Zachtjes gecombineerd en verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet spermacel tot 10 x 106 cellen/mL (gebaseerd op de concentratie van de cel beoordeeld in stap 2.11).
    1. Voor experimenten met behulp van on-capacitated zaadcellen (routine Ca2 +-signalering assay)
      1. Resuspendeer de cellen in de HTF+ met 4 mM HCO3-.
      2. Voeg 30 µL van menselijk serum albumine (HSA) (100 mg/mL) per mL HTF+ om een eindconcentratie van 3 mg/mL.
      3. Sluit de deksels en incubeer gedurende ≥1 h bij 37 ° C.
    2. Capacitated voor experimenten met behulp van zaadcellen (Acrosoom reactie assay)
      1. Resuspendeer de cellen in de HTF+ met 25 mM HCO3-.
      2. Voeg 30 µL van HSA (100 mg/mL) per mL HTF+ om een eindconcentratie van 3 mg/mL.
      3. Deksels los te koppelen en Incubeer bij 37 ° C met de overeenkomstige hoeveelheid CO2 urenlang ≥3 (zie stap 1, meestal tussen 5-10% CO2).

3. het tellen van de zaadcellen

Opmerking: Zaadcellen kunnen worden geteld handmatig50 of met behulp van een afbeelding cytometer51, zoals hier is beschreven. Gebruik een beeld cytometer, een vortexer, S100 buffer, een SP1-cassette, swim-up gezuiverd zaadcellen (bereid in stap 2).

  1. Verdun een 20 µL aliquoot tot een factor van 10, 20, 30, 50 of 90 in S100 buffer met behulp van een ronde bodem 2 mL buis volgens de verwachte concentratie (geëvalueerd door handmatige inspectie van de pellet in stap 2.10). Gebruik de verdunning die het dichtst bij de concentratie verwacht (dat wil zeggen, als een concentratie van 15 x 106 zaadcellen per mL na swim-up verwachting verdund dan de 20 µL spermastaaltje met 380 µL van S100 buffer [verdunningsfactor 20]).
  2. Mix goed voor 10 s met behulp van een vortex-mixer op de maximale 700 rpm, onderdompelen van de SP1-cassette in de steekproef en druk op de witte plunjer volledig neer aan aspirate een aliquoot gedeelte van het monster in de cassette.
  3. Open de afbeelding cytometer, plaats de cassette in de lade en het uitvoeren van de bepaling van de Graaf van PI gekleurd menselijke zaadcellen Assay volgens de toegepaste verdunningsfactor (gekozen in stap 3.1).
  4. Herhaal stap 3.1-3.3 met ander 20 µL monster, met behulp van een dichtst bij de gemeten concentratie verkregen uit de eerste 20 µL monster verdunningsfactor.
  5. Bereken de gemiddelde spermacel concentratie van de twee metingen.
  6. Vermenigvuldigen: sperma cel concentratie met het oorspronkelijke volume te verkrijgen van de telling van het totale spermacel (in stap 2, is deze oorspronkelijke volume 2 mL).

4. meting van de veranderingen in de gratis intracellulaire Ca2 +-concentratie ([Ca2 +]Ik) gebruik van Ca2 +- fluorimetrie (figuur 2)

Opmerking: Gebruik een fluorescentie-afleesapparaat, 384 multi goed platen, Fluo-4 AM, swim-up gezuiverde zaadcellen (bereid in stap 2), verbindingen van belang als goed als positieve en negatieve controles, een automatische repeater pipet en een 12-kanaals pipet.

  1. Bereiden van een 2 mM Fluo-4 AM voorraad door 22.7 µL van dimethylsulfoxide (DMSO) toe te voegen aan een flesje van 50 µg Fluo-4 AM en meng de buis goed.
  2. Een aliquoot gedeelte van 700 µL swim-up herstelde sperma schorsing (capacitated of un-capacitated als omschreven in stap 2) toevoegen aan een nieuwe test-buis. 700 µL van spermastaaltje is het bedrag dat nodig is voor het analyseren van één rij 24 putjes in de plaat van de 384-microwell (gebruikt voor het testen van 3 besturingselementen en 9 verbindingen in paren).
  3. Voeg 3,5 µL van Fluo-4 AM stockoplossing aan de 700 µL van sperma schorsing te verkrijgen van een eindconcentratie van 10 µM Fluo-4 AM.
  4. Incubeer monster gedurende 45 minuten bij 37 ° C, beschermd tegen licht.
  5. Centrifugeer monster bij 700 x g gedurende 10 min, gecombineerd en verwijder het supernatant Schakel overtollige Fluo-4.
  6. Resuspendeer gebeitst pellet in HTF+ tot 5 x 106 cellen/mL (d.w.z., gebruik 2 x de hoeveelheid celsuspensie genomen in stap 4.2)
  7. Maak verdunningen van verbindingen en besturingselementen (kan gebeuren tijdens de incubatie en centrifugeren periodes in stap 4.4 en 4.5, respectievelijk).
    1. Verdun verbindingen, evenals een negatieve controle (buffer met voertuig) en een positieve controle (progesteron) in HTF+. Verdun verbindingen en besturingselementen tot 3 x de gewenste eindconcentratie, zoals ze verdunde 1:3, zijn wanneer ze worden toegevoegd aan de zaadcellen in stap 4.16.
    2. Plaats de buizen met verdunningen in een rack met een afstand tussen de buizen die overeenkomt met de afstand tussen de uiteinden van de Pipet van de 12-kanaals pipet gebruikt in stap 4.16.
  8. Gebruik een automatische repeater Pipet (24 stappen van 50 µL).
    1. Mix Fluo-4 gekleurd spermastaaltje zachtjes door pipetteren keer op en neer het volledige bedrag.
    2. Voeg aliquots van 50 µL toe aan de 24 putjes van een rij in de 384-microwell-plaat.
  9. Plaats de microwell plaat in een fluorescentie-afleesapparaat bij 30 ° C en sluit de lade.
  10. Selecteer het juiste protocol voor Fluo-4. Excite fluorescentie bij 480 nm en record emissie bij 520 nm. Gebruik de snelste cyclus tijd mogelijk met de instelling.
    Opmerking: Gebruik minstens 10 flitsen per goed en onderkant optica, indien mogelijk.
  11. Selecteer een put in de rij en winst voor een streefwaarde van 20% aan te passen.
  12. Start de meting.
  13. Bepalen van de basislijn tijdens de eerste 5 cycli.
    1. Als de fluorescerende uitlezing stijgt of daalt na verloop van tijd, het experiment beëindigen, passen de winst en het experiment opnieuwweergeven.
    2. Als de basislijn veel tussen individuele putten in een rij verschilt, ofwel de pipetteren in stap 4.8 onprecies is geweest of het monster was niet goed genoeg voor pipetteren gemengd. Gooi het experiment.
    3. Als de fluorescerende uitlezing vergelijkbaar tussen de putten in de rij en gestage tijdens de 5 eerste cycli is, gaat u verder met de volgende stap.
  14. Na 10 cycli (gebruikt voor baseline), plaatst u het experiment.
  15. Verwijder de lade met de microwell plaat.
  16. Met behulp van een precisiepipet van de 12-kanaals (2 stappen van 25 µL), snel 25 µL van het bereide oplossingen van verbindingen en -controles (uit stap 4.7) de 12 goed duplicaten (24 wells) van een rij toevoegen. Oplossingen worden verdund 1:3, als de putjes al 50 µL van gebeitst spermastaaltje bevatten.
  17. Blijven de meting zo spoedig mogelijk (lade zal automatisch sluiten) om te voorkomen dat ontbreekt elke fluorescerende signalen geïnduceerd door de toegevoegde stoffen en besturingselementen. Wijzigingen in de fluorescentie (ΔF) na de toevoeging van verbindingen en besturingselementen zal nu worden gevangen.
  18. Voer het experiment tot fluorescerende signalen geconstateerd van de positieve controle en van de verbindingen van belang.
  19. Het experiment beëindigen en exporteren van de gegevens van de rauwe fluorescentie om deze te analyseren zoals in stap 5.
    Opmerking: Over het algemeen Fluo-4 AM is gebruikt als de Ca2 +-gevoelige fluorophore in de test, maar andere Ca2 +-gevoelige fluorophores kan ook worden gebruikt als excitatie en emissie spectra met de filters in de fluorescentie-afleesapparaat past. Afhankelijk van de keuze van fluorophore, door ervoor te zorgen dat het niveau van de winst is ingesteld op een "veilige" het niveau waar de geïnduceerde fluorescerende pieken binnen het meetbereik van het instrument. Dit kan worden getest door ionomycin toe te voegen aan een één putje op de instelling van een specifieke winst. Als dit een fluorescent signaal boven de drempel veroorzaakte, verlaagt de winst en probeer het opnieuw. Sommige Pluronic F-127 gebruiken om te helpen het laden van Fluo-41,13, maar het is gebleken dat dit niet noodzakelijk2is. Het maximale aantal rijen tegelijkertijd gemeten, hangt af van twee factoren. 1) de cyclustijd van het instrument: indien de cyclustijd te lang is, geïnduceerde pieken in [Ca2 +]ik zou kunnen worden gemist. Meten van een maximum van twee rijen tegelijk de cyclustijd om laag te houden; 2) de snelheid van pipetteren in stap 4.16: met behulp van de 12-kanaals precisiepipet, is het mogelijk om snel te voegen 12 verschillende oplossingen aan de 12 dubbele putjes (24 wells) van 1 of 2 rijen (bijvoorbeeld één rij vooraf geïncubeerd met voertuig en één rij vooraf geïncubeerd met een remmer) , zonder te hoeven missen van de geïnduceerde Ca2 + toppen. Het is echter niet aanbevolen om te proberen toe te voegen 24 verschillende oplossingen aan twee rijen voor het meten van de gelijktijdige, zoals pipetting tips vervangen worden tussen de twee opeenvolgende pipetting stappen moeten zal, waarbij geïnduceerde Ca2 + pieken kon worden gemist.

5. analyse van gegevens van Ca2 +- fluorimetrie

  1. Open de gegevens van de rauwe fluorescentie verkregen en geëxporteerd in stap 4.
  2. Bereken het gemiddelde van dubbele putten. Als er grote verschillen bestaan tussen duplicaten, gooi gegevens uit de specifieke putten.
  3. Basislijn definieert als de 10 eerste cycli.
  4. Berekenen van ΔF/F0 (%) Als het percentage wijzigen in fluorescentie (ΔF) na verloop van tijd na toevoeging van verbindingen en controles met betrekking tot de gemiddelde basale fluorescentie (F0) tijdens de 10 eerste cycli (basislijn).
  5. Als de gegevens in voor de generatie van de dosis / respons-curven, aftrekken de uitlezing van de negatieve controle van de andere wells, pipetting artefacten verwijderen.

6. meting van de Acrosoom reactie

Opmerking: Gebruik de cytometer van een afbeelding, een incubator, fluorescente kleurstoffen: PI FITC-PSA en Hoechst-33342, verbindingen van rente, alsmede positieve en negatieve controles, een immobilizing oplossing met 0,6 M NaHCO3 en 0,37% (v/v) formaldehyde in gedestilleerd water, een A2 dia en capacitated zwemmen-up gezuiverd zaadcellen (bereid in stap 2).

  1. Bereiden van een kleurstofoplossing met PI (5 µg/mL), FITC-PSA (50 µg/mL) en Hoechst-33342 (100 µg/mL) in HTF+, meng goed met behulp van een vortex-mixer en beschermen tegen licht tot gebruik.
  2. Bereid oplossingen van verbindingen en controles op 10 x de gewenste eindconcentratie, zoals ze verdunde 1:10 in stap 6.5 zijn. Altijd een negatieve (medium) controle en twee positieve besturingselementen bevatten: progesteron 10 µM eindconcentratie en ionomycin 2 µM eindconcentratie.
  3. Aliquots van 240 µL van capacitated zaadcellen (bereid in stap 2) overbrengen in plastic buizen.
  4. Voeg 30 µL van kleurstofoplossing aan elke buis toe. Eindconcentratie van vlekken zal worden: 0,5 µg/mL PI, 5 µg/mL FITC-PSA en 10 µg Fe/mL Hoechst-33342.
  5. Voeg 30 µL van oplossingen met besturingselementen of verbindingen aan elke buis (1:10 verdunning).
  6. Meng voorzichtig de monsters door pipetteren omhoog en omlaag een paar keer of milde vortexing. Te wijten aan mechanische stress, te voorkomen dat buitensporige mengen.
  7. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
  8. Nieuwe plastic buizen met 100 µL van een immobilizing oplossing met 0,6 M NaHCO3 en 0,37% (v/v) formaldehyde in gedistilleerd water, één per reageerbuis voor te bereiden.
  9. Na incubatie, meng de monsters goed door pipetteren en voeg 50 µL van het monster tot een koker met 100 µL immobilizing oplossing.
  10. Meng het monster goed door pipetteren vóór het laden van de kabinetten van de dia van een A2. Vul de kamers zorgvuldig met ongeveer 30 µL zonder dat er luchtbellen.
    Opmerking: Tijdens de incubatie, de motile zaadcellen neiging om aggregaat. Cel klontjes kunnen het verstoren van de metingen (hoewel ze zijn uitgesloten). Daarom is het zeer belangrijk een homogenisatie van het mengsel door pipetteren na incubatie. Evenzo, luchtbellen in de kamers kunnen het verstoren van de metingen. Daarom langzaam vullen van de kamer en de hoek van de Pipet wijzigen als de randen van de vloeistof zijn ongeveer te ontmoeten en maken een luchtbel.
  11. Plaats het geladen dia op de lade van de cytometer van de afbeelding en sluit de lade.
  12. Selecteer het FlexiCyte protocol en de oplage.
    1. De volgende instellingen kiezen voor het FlexiCyte-protocol: aantal analytische kanalen: 2; Maskeren van kanaal: UV (LED365), dit is het kanaal dat wordt gebruikt voor beeldsegmentatie; Kanaal 1: Blauw (LED475), belichtingstijd 3000 ms, emissie filter 560/35; Kanaal 2: Green (LED530), blootstelling tijd 500 ms, emissie filter 675/75; Minimum aantal geanalyseerde cellen: 5000; Samengevoegde cellen uitsluiten: Ja.
  13. Herhaal stap 6,9-6.12 totdat alle monsters zijn gemeten.

7. analyse van de gegevens uit afbeelding Cytometry

  1. Open gegevens die zijn verkregen in stap 6.
  2. Maak de twee volgende percelen te evalueren van de metingen.
    1. Maak een scatterplot van Hoechst-33342 intensiteit vs. Hoechst-33342 gebied op biexponential weegschaal. Dit perceel kan worden gebruikt naar gate Hoechst-33342 positieve objecten die te klein of te groot is om menselijk sperma cellen.
    2. Maak een scatterplot van FITC-PSA intensiteit en de intensiteit van de PI op biexponential weegschaal. Dit perceel kan worden gebruikt om ezels reageerde de hoeveelheid Acrosoom zaadcellen door gebruik van een Kwadrant-gate die scheidt van de vier fracties op het perceel (Figuur 3): 1) een PI positief en positieve FITC-PSA-groep: Acrosoom reageerde nonviable zaadcellen; 2) een PI negatieve en positieve FITC-PSA-groep: Acrosoom reageerde levensvatbare zaadcellen; 3) een PI positief en de FITC-PSA negatieve groep: Acrosoom intact nonviable zaadcellen; en 4) een PI negatief en de FITC-PSA negatieve groep: Acrosoom intact levensvatbare zaadcellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vertegenwoordiger resultaten van een experiment dat het testen van het effect van 4 verbindingen (A, B, C en D) samen met een positieve (progesteron) en negatieve (buffer) controle op [Ca2 +]i in menselijk sperma met behulp van de middellange-doorvoer Ca2 +-signalering bepaling kan worden gezien in figuur 4a. In figuur 4b, wordt een dosis-responscurve van progesteron weergegeven, die was afgeleid ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De middellange doorvoer Ca2 + signalering assay is gebaseerd op metingen van de fluorescentie van elk één microwells dat bevat ongeveer 250.000 zaadcellen. Het vastgelegde signaal is gemiddeld van alle individuele zaadcellen in de put. De bepaling vormt dus dat geen ruimtelijke informatie over waar u specifiek in de spermacel [Ca2 +]ik wordt gewijzigd, in hoe groot een deel van de zaadcellen een verandering in [Ca2 +]i vindt plaats, of hoe heterogene het antwoord is ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs wil erkennen het lab van Timo Strünker voor toezicht op de AR en DLE tijdens hun verblijf bij zijn lab. Voorts bedank we onze collega's van het departement van groei en voortplanting, Copenhagen University Hospital, Rigshospitalet voor hun hulp bij het opzetten van deze twee testen. Dit werk werd gesteund door subsidies van het innovatiefonds Denemarken (subsidie cijfers 005-2010-3 en 14-2013-4).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.2 µm pore filterThermo Fisher Scientific, USA296-4545
1 L maatcilinderThermo Fisher Scientific, USA3662-1000
1, 4, en 2 mL kunststof buizenEppendorf, Duitsland30120086 en 0030120094
12-kanaals pipetEppendorf, Duitsland4861000813
384 multi-well platenGreiner Bio-One, Duitsland781096
15 en 50 mL plastic buizenEppendorf, Duitsland0030122151 en 30122178
A2-slideChemoMetec, Denemarken942-0001
Automatische herhalingspipetEppendorf, Duitsland4987000010
CaCl2
Centrifuge
Schoon kunststof container met wijde opening voor spermamonster
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
FITC-gekoppelde lectin van Pisum sativum (FITC-PSA)Sigma-Aldrich, DuitslandL0770
Fluo-4 AMThermo Fisher Scientific, USAF14201
FLUOstar OMEGA fluorescentie microplaatlezerBMG Labtech, Duitsland
Glucose anhydrous
HEPES
Hoechst-33342ChemoMetec, Denemarken910-3015
Human serum albumine (HSA)Irvine Scientific9988Voor toevoeging aan HTF+
Imobilisatieoplossing bevattende 0,6 M NaHCO3 en 0,37% (v/v) formaldehyde in gedistilleerd water
Incubator
KCl
KH2PO4
Magnetische roerder
MgSO4
Na-Lactaat
NaCl
NaHCO3
NC-3000 beeldcytometerChemoMetec, Denemarken970-3003
Pipetten en pipette tips
Propidiumjodide (PI)ChemoMetec, Denemarken910-3002
Gezuiverd water
Rak voor het plaatsen van 50 mL kunststof buizen in een hoek van 45°
S100 bufferChemoMetec, Denemarken910-0101
SP1-cassetteChemoMetec, Denemarken941-0006
Volumetrische kolven van geschikte maten
Vortexer

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schiffer, C., et al. Direct action of endocrine disrupting chemicals on human sperm. EMBO reports. , (2014).
  2. Rehfeld, A., Dissing, S., Skakkebæk, N. E. Chemical UV Filters Mimic the Effect of Progesterone on Ca(2+) Signaling in Human Sperm Cells. Endocrinology. 157 (11), 4297-4308 (2016).
  3. Brenker, C., et al. Synergistic activation of CatSper Ca2+ channels in human sperm by oviductal ligands and endocrine disrupting chemicals. Human Reproduction (Oxford, England). 33 (10), 1915-1923 (2018).
  4. Brenker, C., et al. The CatSper channel: a polymodal chemosensor in human sperm. The EMBO Journal. 31 (7), 1654-1665 (2012).
  5. Brenker, C., et al. Action of steroids and plant triterpenoids on CatSper Ca2+ channels in human sperm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E344-E346 (2018).
  6. Rehfeld, A., et al. Chemical UV filters can affect human sperm function in a progesterone-like manner. Endocrine Connections. , (2017).
  7. Egeberg Palme, D. L., et al. Viable acrosome-intact human spermatozoa in the ejaculate as a marker of semen quality and fertility status. Human Reproduction. , Oxford, England. (2018).
  8. Publicover, S., Harper, C. V., Barratt, C. [Ca2+]i signalling in sperm--making the most of what you've got. Nature Cell Biology. 9 (3), 235-242 (2007).
  9. Publicover, S. J., et al. Ca2+ signalling in the control of motility and guidance in mammalian sperm. Frontiers in Bioscience. 13, 5623-5637 (2008).
  10. Publicover, S., Harper, C. V., Barratt, C. [Ca2+]i signalling in sperm--making the most of what you've got. Nature Cell Biology. 9 (3), 235-242 (2007).
  11. Lishko, P. V., et al. The control of male fertility by spermatozoan ion channels. Annual Review Of Physiology. 74, 453-475 (2012).
  12. Morris, J., et al. Cell-penetrating peptides, targeting the regulation of store-operated channels, slow decay of the progesterone-induced [Ca2+]i signal in human sperm. Molecular Human Reproduction. 21 (7), 563-570 (2015).
  13. Strünker, T., et al. The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm. Nature. 471 (7338), 382-386 (2011).
  14. Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm. Nature. 471 (7338), 387-391 (2011).
  15. Miller, M. R., et al. Unconventional endocannabinoid signaling governs sperm activation via the sex hormone progesterone. Science (New York, N.Y.). 352 (6285), 555-559 (2016).
  16. Revelli, A., et al. Follicular fluid content and oocyte quality: from single biochemical markers to metabolomics. Reproductive Biology And Endocrinology RB&E. 7, 40(2009).
  17. Lyons, R. A., Saridogan, E., Djahanbakhch, O. The effect of ovarian follicular fluid and peritoneal fluid on Fallopian tube ciliary beat frequency. Human Reproduction. 21 (1), Oxford, England. 52-56 (2006).
  18. Eisenbach, M., Giojalas, L. C. Sperm guidance in mammals - an unpaved road to the egg. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 7 (4), 276-285 (2006).
  19. Alasmari, W., et al. The clinical significance of calcium-signalling pathways mediating human sperm hyperactivation. Human Reproduction. 28 (4), Oxford, England. 866-876 (2013).
  20. Alasmari, W., et al. Ca2+ signals generated by CatSper and Ca2+ stores regulate different behaviors in human sperm. The Journal of Biological Chemistry. 288 (9), 6248-6258 (2013).
  21. Tamburrino, L., et al. The CatSper calcium channel in human sperm: relation with motility and involvement in progesterone-induced acrosome reaction. Human Reproduction. 29 (3), Oxford, England. 418-428 (2014).
  22. Krausz, C., et al. Intracellular calcium increase and acrosome reaction in response to progesterone in human spermatozoa are correlated with in-vitro fertilization. Human Reproduction. 10 (1), Oxford, England. 120-124 (1995).
  23. Oehninger, S., et al. Defective calcium influx and acrosome reaction (spontaneous and progesterone-induced) in spermatozoa of infertile men with severe teratozoospermia. Fertility and Sterility. 61 (2), 349-354 (1994).
  24. Shimizu, Y., Nord, E. P., Bronson, R. A. Progesterone-evoked increases in sperm [Ca2+]i correlate with the egg penetrating ability of sperm from fertile but not infertile men. Fertility and Sterility. 60 (3), 526-532 (1993).
  25. Falsetti, C., et al. Decreased responsiveness to progesterone of spermatozoa in oligozoospermic patients. Journal of Andrology. 14 (1), 17-22 (1993).
  26. Williams, H. L., et al. Specific loss of CatSper function is sufficient to compromise fertilizing capacity of human spermatozoa. Human Reproduction. 30 (12), Oxford, England. 2737-2746 (2015).
  27. Forti, G., et al. Effects of progesterone on human spermatozoa: clinical implications. Annales d'Endocrinologie. 60 (2), 107-110 (1999).
  28. Krausz, C., et al. Two functional assays of sperm responsiveness to progesterone and their predictive values in in-vitro fertilization. Human Reproduction. 11 (8), Oxford, England. 1661-1667 (1996).
  29. Kelly, M. C., et al. Single-cell analysis of [Ca2+]i signalling in sub-fertile men: characteristics and relation to fertilization outcome. Human Reproduction. 33 (6), Oxford, England. 1023-1033 (2018).
  30. Brown, S. G., et al. Homozygous in-frame deletion in CATSPERE in a man producing spermatozoa with loss of CatSper function and compromised fertilizing capacity. Human Reproduction. 33 (10), Oxford, England. 1812-1816 (2018).
  31. Avenarius, M. R., et al. Human male infertility caused by mutations in the CATSPER1 channel protein. American Journal of Human Genetics. 84 (4), 505-510 (2009).
  32. Smith, J. F., et al. Disruption of the principal, progesterone-activated sperm Ca2+ channel in a CatSper2-deficient infertile patient. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6823-6828 (2013).
  33. Hildebrand, M. S., et al. Genetic male infertility and mutation of CATSPER ion channels. European Journal of Human Genetics. 18 (11), 1178-1184 (2010).
  34. Avidan, N., et al. CATSPER2, a human autosomal nonsyndromic male infertility gene. European Journal of Human Genetic. 11 (7), 497-502 (2003).
  35. Zhang, Y., et al. Sensorineural deafness and male infertility: a contiguous gene deletion syndrome. BMJ Case Reports. 2009, (2009).
  36. Jaiswal, D., Singh, V., Dwivedi, U. S., Trivedi, S., Singh, K. Chromosome microarray analysis: a case report of infertile brothers with CATSPER gene deletion. Gene. 542 (2), 263-265 (2014).
  37. Visconti, P. E., Krapf, D., de la Vega-Beltrán, J. L., Acevedo, J. J., Darszon, A. Ion channels, phosphorylation and mammalian sperm capacitation. Asian Journal of Andrology. 13 (3), 395-405 (2011).
  38. Wassarman, P. M., Jovine, L., Litscher, E. S. A profile of fertilization in mammals. Nature Cell Biology. 3 (2), E59-E64 (2001).
  39. Leahy, T., Gadella, B. M. Sperm surface changes and physiological consequences induced by sperm handling and storage. Reproduction. 142 (6), Cambridge, England. 759-778 (2011).
  40. Suarez, S. S. Control of hyperactivation in sperm. Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).
  41. Liu, D. Y., Baker, H. W. Inhibition of acrosin activity with a trypsin inhibitor blocks human sperm penetration of the zona pellucida. Biology of Reproduction. 48 (2), 340-348 (1993).
  42. Okabe, M. The cell biology of mammalian fertilization. Development. 140 (22), Cambridge, England. 4471-4479 (2013).
  43. Inoue, N., Satouh, Y., Ikawa, M., Okabe, M., Yanagimachi, R. Acrosome-reacted mouse spermatozoa recovered from the perivitelline space can fertilize other eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20008-20011 (2011).
  44. Jin, M., et al. Most fertilizing mouse spermatozoa begin their acrosome reaction before contact with the zona pellucida during in vitro fertilization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4892-4896 (2011).
  45. Hirohashi, N., Yanagimachi, R. Sperm acrosome reaction: its site and role in fertilization. Biology of Reproduction. 99 (1), 127-133 (2018).
  46. Liu, D. Y., Garrett, C., Baker, H. W. G. Acrosome-reacted human sperm in insemination medium do not bind to the zona pellucida of human oocytes. International Journal of Andrology. 29 (4), 475-481 (2006).
  47. Overstreet, J. W., Hembree, W. C. Penetration of the zona pellucida of nonliving human oocytes by human spermatozoa in vitro. Fertility and Sterility. 27 (7), 815-831 (1976).
  48. Martins da Silva, S. J., et al. Drug discovery for male subfertility using high-throughput screening: a new approach to an unsolved problem. Human Reproduction. , Oxford, England. 1-11 (2017).
  49. Zoppino, F. C. M., Halón, N. D., Bustos, M. A., Pavarotti, M. A., Mayorga, L. S. Recording and sorting live human sperm undergoing acrosome reaction. Fertility and Sterility. 97 (6), 1309-1315 (2012).
  50. Mata-Martínez, E., et al. Measuring intracellular Ca2+ changes in human sperm using four techniques: conventional fluorometry, stopped flow fluorometry, flow cytometry and single cell imaging. Journal of Visualized Experiments. (75), e50344(2013).
  51. Egeberg, D. L., et al. Image cytometer method for automated assessment of human spermatozoa concentration. Andrology. 1 (4), 615-623 (2013).
  52. Nash, K., et al. Techniques for imaging Ca2+ signaling in human sperm. Journal of Visualized Experiments. (40), (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

CalciumsignaleringassayAcrosomreactieassayFluorescentiegebaseerde assayImagecytometrische assayDosis responscurvesCompetitieve inhibitieCatSper remmersSpermacelfunctie

Gerelateerde artikelen