Methodenartikel

Bepaling van het tarief van de bevruchting ei van Bemisia tabaci met behulp van een cytogenetische techniek

DOI:

10.3791/59213

⸱

1 april 2019

 , 
1Graduate Interdisciplinary Program in Entomology and Insect Science, University of Arizona, 2Department of Entomology, University of Arizona

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij presenteren een eenvoudige cytogenetische techniek met behulp van 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) om te bepalen van het tarief van de bevruchting en primaire sex-ratio van de haplodiploid invasieve plaag Bemisia tabaci.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een paar soorten sap-zuigende wittevlieg zijn enkele van de meest schadelijke terrestrische plagen wereldwijd vanwege de gewas-schade die ze toebrengen en plantenvirussen die ze vector. Ondanks talrijke studies van de biologie van deze soorten in verschillende omgevingen, een belangrijke levensgeschiedenis parameter, offspring sex ratio's, weinig aandacht heeft gekregen, maar is belangrijk voor het voorspellen van de populatiedynamiek. De primaire verhouding van de sex (sex ratio op oviposition) van Bemisia tabaci is nooit gemeld maar kan worden gevonden door de bepaling van het tarief van de bevruchting ei van dit insect van de haplodiploid. De techniek gaat de dechorionation van de eieren met bleekmiddel, een reeks fixatie stappen en de toepassing van de algemene DNA fluorescerende vlek, DAPI (4 ': 6-diamidino-2-phenylindole, een DNA-bindende fluorescente kleurstof), te binden aan mannelijke en vrouwelijke pronuclei. Hier presenteren we de techniek, en een voorbeeld van de toepassing ervan, om te testen of een endosymbiotic bacterie Rickettsia sp. nr. bellii, beïnvloed de primaire sex-ratio van B. tabaci. Deze methode kan helpen bij bevolkingsonderzoeken van wittevlieg, of vast te stellen of geslacht toewijzing bestaat met bepaalde milieu prikkels.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De studie van geslacht verdeling, of de relatieve investering in mannelijke en vrouwelijke nakomelingen, is een hoeksteen van gedragsecologie1,2,3. Naast de macht voor het testen van adaptieve modellen van gedrag, kan te weten de seks toewijzing strategie van een organisme modellen voor de populatiedynamica verbeteren. In vele soorten, wordt seks toewijzing gecontroleerd door moeders. Ter vaststelling van geslacht toewijzing, is het belangrijk om te bepalen van de primaire sex-ratio of het aandeel van vrouwen op het moment van de ei-afzetting. Hoewel de sex ratio op volwassen opkomst aanknopingspunten seks toewijzing bieden kan, kan differentiële developmental sterfte tussen mannelijke en vrouwelijke exemplaren het volwassen sex-ratio aanzienlijk en algemeen scheeftrekken. In sommige soorten Hymenoptera (Vliesvleugeligen), de volgorde van insecten, mieren, bijen en wespen, met is de primaire sex-ratio vastgesteld met cytogenetische tests, kleuring van de embryo's om weer te geven van de genetische DNA. Omdat hymenopterans haplodiploid, een beginnende mannelijke ei is haploïde en bevat alleen de vrouwelijke pronucleus (n), terwijl beginnende vrouwelijke eieren diploïde zijn en zowel mannelijke als vrouwelijke pronuclei (2n bevatten). Hoewel Aleyrodidae, de sap-voeding-familie van true bugs (Hemiptera) bekend als wittevlieg, ook haplodiploid, is er geen een gevestigde assay te vinden van de primaire sex-ratio in deze insecten. Dit is misschien verwonderlijk gezien de intensiteit van de studie van de paar kosmopolitische ernstige plagen uit deze familie en het belang van de sex ratio's in concurrerende interacties van wittevlieg4,5,6,7 ,8,9,10 en in de populatiedynamiek in het algemeen. In haplodiploid insecten ook zijn sex ratio's onbeperkt door geslacht bepaling systemen, waardoor de mogelijkheid van selectieve bevruchting en onstabiele sex-ratio's die met de milieu-2 variëren. Hier presenteren we een techniek om te bepalen van de primaire sex-ratio van het complex van de soorten van wittevlieg gezamenlijk bekend als de sweetpotato wittevlieg, B. tabaci. Deze naam voor één soort omvat meer dan 28 soorten wereldwijd11en omvat enkele van de meest schadelijke global invasieve ongedierte12,13. De toepassing van deze techniek om seks patronen van geheugentoewijzingen die in B. tabaci en andere Aleyrodidae toestaat een strenger onderzoek van variabelen, met inbegrip van temperatuur, waardplant, endosymbiotic bacteriën of plant/wittevlieg ziekteverwekkers, die invloed op de wittevlieg primaire sex ratio's en de populatiedynamiek van de wittevlieg hebben kunnen.

Wij zijn niet op de hoogte van eventuele vergelijkbare ei-kleuring technieken voor B. tabaci. Het protocol is handig in vergelijking met verkleurende methoden die worden gebruikt voor andere insecten eieren14 omdat het nalaat een overnachting fixatie stap en, dus, kan worden voltooid binnen de 3 uur. Als een voorbeeld van een toepassing, een endosymbiotic bacterie Rickettsia sp. nr. bellii, wordt geassocieerd met vrouwelijke bias in ons laboratorium lijnen B. tabaci Midden-Oosten en Azië kleine 1 (MEAM1)15,16. In één B. tabaci MEAM1 laboratorium regel ("MAC1," verzameld vanuit het midden van de landbouw Maricopa), testen we of Rickettsia-besmette (R+) vrouwen bevruchten meer eieren dan niet-geïnfecteerde (R-) vrouwtjes.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opmerking: Zorg ervoor dat alle werkzaamheden wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur in een goed geventileerde ruimte of in een zuurkast. Alle 'druppels' in dit protocol worden gedefinieerd als 5 – 20 µL, afhankelijk van de voorkeur van de exploitant.

1. eerste Setup

  1. Toestaan dat vrouwelijke wittevlieg te oviposit op schone bladeren. Voorbeelden voor oviposition arenas zijn clip kooien of bladeren gesneden te passen op agar in een petrischaal. Maak een coverable gat in de kooi van de clip of de petrischaal cover invoegen en verwijderen van de volwassenen. Alternatief, zet snel een vaartuig van de verzamelde volwassenen op ijs en dan storten ze op het blad. Beperk de tijd tussen oviposition en eieren fixatie aan niet meer dan 60 min, zodat de waarneming van de overgang van de zaadcellen in de vaderlijke pronucleus in eieren.
    Opmerking: Eieren niet verwijderd uit het blad kunnen naar volwassenheid opnemen van volwassen sex-ratio's worden gehouden.
  2. Vóór of tijdens de wittevlieg oviposition, bereid een microscoopglaasje door het schoonmaken met water en zeep, drogen goed, en vervolgens het uitrekken van een stuk van paraffine film over één uiteinde, ervoor te zorgen dat het oppervlak van de film paraffine niet breekt (Figuur 1).
    Opmerking: De paraffine film is hydrofoob en semi-dekkend, zodat vloeistoffen aan formulier druppels en eieren te bezien gemakkelijker.

2. Dechorionation

  1. Pipetteer met een glas Pasteur, bleekwater oplossing (0,83% natriumhypochloriet) druppels toevoegen aan de paraffine-film.
    Opmerking: Het is makkelijker om bij te houden eieren als slechts 2-3 eieren verpakt in elke druppel zijn. Als alternatief voor het beheren van een groot ei nummer, verzamelen de eieren in druppels 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    Let op: Bleach is bijtend; Draag handschoenen bij het verwerken van bleekmiddel en niet inademen.
  2. De volwassen wittevlieg uit het blad verwijderen.
  3. Plaats het blad onder een microscoop te zien van de eieren en het verzamelen van de eieren afzonderlijk en zorgvuldig met een dunne sonde. Aanbrengen van een sonde, invoegen van een minuten nadel pin op 45°, of in een comfortabele hoek van het werken in een gesmolten pipette uiteinde (Figuur 2).
  4. De eieren overbrengen met bleekmiddel of 1 x PBS. Als met behulp van 1 x PBS, verwijdert u de 1 x PBS met een glas Pasteur Pipetteer zodra de eieren zijn verzameld en, dan, Voeg bleekwater op de eieren.
    Opmerking: Bij het verzamelen van eieren, lift langzaam het ei vanuit zijn basis tot de pedicel wordt verwijderd uit het blad. De pedicel is kleverig, en het ei zal vaak vasthouden aan de sondepunt totdat het is ondergedompeld in het bleekmiddel.
    Opmerking: Het wordt aanbevolen om aparte glas Pasteur pipettes gebruiken voor alle reagentia en de pipetten kunnen worden gewijzigd met warmte aan de tips smaller maken en het risico van per ongeluk zuigen wittevlieg eieren. Om te voorkomen dat residuen en besmetting, reinig de pipetten met gedeïoniseerd water na elk gebruik.
  5. Wacht 10 minuten. Als er belangstelling voor embryogenese in eieren die ouder zijn dan 1 h, laat de eieren in bleekmiddel gedurende maximaal 15 minuten.
    Opmerking: Voor eieren die maximaal 1 uur oud zijn, is 10 minuten voldoende.

3. fixatie

Opmerking: Deze stappen zijn ontleend aan een Hymenoptere protocol17.

  1. Verwijder het bleekmiddel (met het chorion fragmenten) met een glazen pipet van Pasteur en verwerpen. Voeg druppels ijsazijn met een glas Pasteur Pipetteer en 3 min wachten.
    Let op: Ga verder met deze stap in een zuurkast. Ijsazijn is corrosief; Draag handschoenen wanneer omgaan met ijsazijn en niet inademen, vooral in combinatie met het residuele bleekmiddel.
  2. Verwijder de ijsazijn met een glazen pipet van Pasteur en voeg druppels van Clarke's oplossing (3:1 van absolute ethanol: ijsazijn) met een glas Pasteur Pipetteer. Wacht totdat het grootste deel van de oplossing is verdampt (of 10 min max).
  3. Voeg druppels van 70% ethanol op de eieren met een glazen pipet van Pasteur en wacht totdat het grootste deel van de ethanol is verdampt (of 10 min-max).

4. vlekken

  1. Verwijder eventuele resterende ethanol met een glazen pipet van Pasteur en voeg druppels 1 x PBS op de eieren met een glazen pipet van Pasteur om de pH dichtbij 7.0. Stel de microscoopglaasje in een zaal van de luchtvochtigheid ter voorkoming van uitdroging, bijvoorbeeld in een lege pipette uiteinde doos met een natte papieren handdoek binnen (Figuur 3). Wacht minstens 30 min.
    Opmerking: Dit is het beste punt als een pauze nodig is, zolang de kamer vochtigheid kan uitdroging voorkomen.
  2. Verwijderen van de PBS 1 x met een glazen pipet van Pasteur, en voeg druppels 0.1 μg/mL DAPI, een fluorescerende vlek van DNA, met een glas Pasteur Pipetteer. Stel het microscoopglaasje in een donkere vochtigheid kamer en wacht ten minste 15 minuten.
    Let op: DAPI is een irriterend, dus omgaan met handschoenen.

5. wassen

  1. Verwijder de DAPI met een glazen pipet van Pasteur.
  2. Voeg druppels 1 x TBST (5 x oplossing gemaakt van 30 g van Tris, 43.8 g NaCl, Polysorbaat 20 5 mL en 1,0 g van NaN3 [pH 7.5], en bracht aan 1 L met PCR rang water) op de eieren met een glas Pasteur Pipetteer. 5 min wachten met het verwijderen van de 1 x TBST met een glazen pipet van Pasteur. Herhaal deze stap 2 keer.

6. montage

  1. Na de definitieve wash, Pipetteer zorgvuldig alle eieren uit de paraffine film op een schoon deel van het microscoopglaasje. Verwijderen van de overtollige 1 x TBST; dan, Voeg 20 µL media te monteren (80% glycerol en 20% 1 x TBST met 2% n-propyl-gallate) en plaats een schone cover dia op de top van de eieren.
  2. Voor langdurige opslag, afdichting van de deksel dia met duidelijke nagellak en vervolgens opslaan van de dia in het donker bij de 2 ° C of onmiddellijk onder een fluorescente microscoop bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om te testen of Rickettsia is van invloed op het tarief van de bevruchting van B. tabaci MEAM1 vrouwtjes, die wij gefokt Rickettsia-besmet (R+) of niet-geïnfecteerde (R-) B. tabaci op cowpea planten (Vigna unguiculata) in aparte kooien op een 16 h licht/8 h donkere fotoperiode, 27 ° C en 70% relatieve vochtigheid. R+ werden R- vierde instar wittevlieg zorgvuldig verwijderd uit bladeren en geïsoleerd i...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol is de eerste om de bevruchting tarief of primaire sex ratio van B. tabacite leggen. De uitdaging van dit protocol is dat er onderzoekers om te leren hoe te te behandelen de wittevlieg eieren snel, ervoor te zorgen dat niet meer dan 1 uur verstreken is sinds de eieren waren oviposited totdat ze zijn vastgesteld. Tijdens voorbereidende experimenten waren de eieren die waren vastgesteld op 3 uur of meer postoviposition te oud om te observeren van bevruchting, als syngamy had plaatsgevonden en mitotisch...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd gefinancierd door een subsidie van NSF (DEB-1020460) te M.S.H. en een USDA AFRI-grant (2010-03752) te M.S.H. De auteurs bedanken Brennan Zehr kleuring wittevlieg eieren met veel vaardigheid en Zen. De auteurs bedanken Mike Riehle voor het toestaan van het gebruik van zijn fluorescente microscoop voor imaging. De auteurs bedanken Suzanne Kelly en Marco Gebiola voor de beelden van het ei. De auteurs bedanken Suzanne Kelly en Jimmy Conway voor het helpen op beslissende momenten tijdens de experimenten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1x PBSAny
1x TBSTAny5x oplossing gemaakt van 30 g Tris, 43,8 g NaCl, 5 ml Tween-20 en 1,0 g NaN3 pH 7,5, en gebracht naar 1 L met PCR-kwaliteit water
BleachCloroxElke huishoudelijke bleekmiddel werkt zolang het verdund kan worden tot 0,83% natriumhypochloriet
Klare nagellakAny
DAPI dilactaatSanta Cruz Biotechnologysc300415
EthanolAnyVerdun tot 70% EtOH
Fluorescente microscoopNikonNikon Eclipse 50i werd gebruikt in dit experiment, maar elke fluorescente microscoop met 340/380 nm excitatiefilter en minimaal 4-10x vergroting kan worden gebruikt
Glacial azijnzuurMallinckrodtUN2789
GlycerolAny
MicroscoopWildEen Wild M5A-microscoop werd gebruikt voor dit experiment, maar elke microscoop waarbij de operator de witte vlieg-eieren duidelijk kan zien, kan worden gebruikt
MicroscoopglazenAnyDe methoden zijn voor glazen van 18 mm x 18 mm. Er moet meer montagemiddel worden toegevoegd voor grotere glazen.
MicroscoopglazenAny
Minuten naald pinsBioQuip1208SAMinuten naald pins zijn optioneel voor het vervaardigen van sondes met pipettentips
NaClAny
NaN3Any
n-propylgallaatSigma/Santa Cruz BiotechnologyP3130/sc-250794
ParafilmBemis
Pasteur pipettenFisher Scientific13-678-20AFisherbrand wegwerpbare borosilicaatglas Pasteur pipetten 5,75 inch. Een Bunsen-brander kan ook nodig zijn als de operator de pipetten wil verlengen en versmallen
PCR-kwaliteit waterAny
PipettipsAnyPipettips zijn optioneel voor het vervaardigen van sondes met minuten naald pins
Kleine druppelflesAnyMoet passen op Pasteur pipet
TrisAny
Tween-20Any

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Charnov, E. L. Sex ratio in spatially structured populations. The Theory of Sex Allocation. May, R. M. , Princeton University Press. Princeton, NJ. 67-92 (1982).
  2. Godfray, H. C. J. Parasitoids: behavioral and evolutionary ecology. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1994).
  3. Bourke, A. F. G., Franks, N. R. Social Evolution in Ants. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1995).
  4. Pascal, S., Callejas, C. Intra- and interspecific competition between biotypes B and Q of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) from Spain. Bulletin of Entomological Research. 94 (4), 369-375 (2004).
  5. Liu, S. -S., et al. Asymmetric mating interactions drive widespread invasion and displacement in a whitefly. Science. 318 (5857), 1769-1772 (2007).
  6. Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Mate discrimination in invasive whitefly species. Journal of Insect Behavior. 23 (5), 364-380 (2010).
  7. Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Plasticity in mating behaviour drives asymmetric reproductive interference in whiteflies. Animal Behaviour. 79 (3), 579-587 (2010).
  8. Tsueda, H., Tsuchida, K. Reproductive differences between Q and B whiteflies, Bemisia tabaci, on three host plants and negative interactions in mixed cohorts. Entomologia Experimentalis et Applicata. 141, 197-207 (2011).
  9. Wang, P., Crowder, D. W., Liu, S. -S. Roles of mating behavioural interactions and life history traits in the competition between alien and indigenous whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 102 (4), 395-405 (2012).
  10. Sun, D. -B., Li, J., Liu, Y. -Q., Crowder, D. W., Liu, S. -S. Effects of reproductive interference on the competitive displacement between two invasive whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 104 (3), 334-346 (2014).
  11. Liu, S. -S., Colvin, J., De Barro, P. J. Species concepts as applied to the whitefly Bemisia tabaci systematics: how many species are there? Journal of Integrative Agriculture. 11 (2), 176-186 (2012).
  12. Invasive Species Specialist Group. Global Invasive Species Database. , Available from: http://iucngisd.org/gisd/100_worst.php (2018).
  13. Gilbertson, R. L., Batuman, O., Webster, C. G., Adkins, S. Role of the insect supervectors Bemisia tabaci and Frankliniella occidentalis in the emergence and global spread of plant viruses. Annual Review of Virology. 2 (1), 67-93 (2015).
  14. Giorgini, M., et al. Rickettsia symbionts cause parthenogenetic reproduction in the parasitoid wasp Pingala soemius (Hymenoptera: Eulophidae). Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2589-2599 (2010).
  15. Himler, A. G., et al. Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias. Science. 332 (6026), 254-256 (2011).
  16. Cass, B. N., et al. Dynamics of the endosymbiont Rickettsia in an insect pest. Microbial Ecology. 70 (1), 287-297 (2015).
  17. Vavre, F., de Jong, J. H., Stouthamer, R. Cytogenetic mechanism and genetic consequences of thelytoky in the wasp Trichogramma cacoeciae. Heredity. 93 (6), 592-596 (2004).
  18. Cass, B. N., et al. Conditional fitness benefits of the Rickettsia bacterial symbiont in an insect pest. Oecologia. 180 (1), 169-179 (2016).
  19. Hunter, M. S., Asiimwe, P., Himler, A. G., Kelly, S. E. Host nuclear genotype influences phenotype of a conditional mutualist symbiont. Journal of Evolutionary Biology. 30, 141-149 (2017).
  20. Gottlieb, Y., et al. Inherited intracellular ecosystem: symbiotic bacteria share bacteriocytes in whiteflies. FASEB Journal. 22 (7), 2591-2599 (2008).
  21. Luan, J., Sun, X., Fei, Z., Douglas, A. E. Maternal inheritance of a single somatic animal cell displayed by the bacteriocyte in the whitefly Bemisia tabaci. Current Biology. 28 (3), 459-465 (2018).
  22. Guo, J. -Y., Cong, L., Wan, F. -H. Multiple generation effects of high temperature on the development and fecundity of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae) biotype B. Insect Science. 20 (4), 541-549 (2013).
  23. Cui, X., Wan, F., Xie, M., Liu, T. Effects of heat shock on survival and reproduction of two whitefly species, Trialeurodes vaporariorum and Bemisia tabaci biotype B. Journal of Insect Science. 8 (24), (2008).
  24. Boykin, L. M. Bemisia tabaci nomenclature: Lessons learned. Pest Management Science. 70 (10), 1454-1459 (2014).
  25. Qin, L., Pan, L. -L., Liu, S. -S. Further insight into reproductive incompatibility between putative cryptic species of the Bemisia tabaci whitefly complex. Insect Science. 23 (2), 215-224 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Bevruchtingspercentage van de wittevliegDechorionering van eierenDAPI kernkleuringFluorescentiemicroscopieHaplodiplo de geslachtsverhoudingPrimaire geslachtsverhoudingRickettsia endosymbiontProtocol voor fixatie van eieren

Gerelateerde artikelen