Beheer van de clusters van de eerste 3D-cel in een hybride Gel kubus apparaat voor herhaalbare patroon formaties

Summary

Presenteren we een procedure voor de controle op de eerste cel cluster-vorm in een 3D extracellulaire matrix te verkrijgen van een herhaalbare patroonformatie. Een kubieke apparaat met twee verschillende hydrogels wordt gebruikt om verschillende richtingen imaging voor weefsel patroonformatie.

Abstract

Het belang van in vitro culturen van 3D is aanzienlijk benadrukt in cel/weefselkweek. Echter behoort het gebrek aan experimentele herhaalbaarheid tot haar beperkingen. De analyse van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de zelf-organisatie verslechtert produceren weinig herhaalbare resultaten van patroonformatie. Vermindering van de variatie in de voorwaarden van de oorspronkelijke cultuur, zoals de celdichtheid en distributie in de extracellulaire matrix (ECM), is cruciaal voor het verbeteren van de herhaalbaarheid van een 3D-cultuur. In dit artikel tonen we een eenvoudige, maar robuuste procedure voor de controle op de eerste cel cluster-vorm in een 3D extracellulaire matrix te verkrijgen zeer herhaalbare patroon formaties. Een micromold met een gewenste vorm werd vervaardigd met behulp van fotolithografie of een machinale bewerking proces, en het een 3D zak gevormd in de ECM vervat in een hybride gel kubus (HGC). Sterk geconcentreerde cellen werden vervolgens geïnjecteerd in de zak zodat de cel cluster vorm gekoppeld aan de shape verzonnen schimmel. De werknemer HGC toegestaan verschillende richtingen scannen door de rotatie, waardoor hoge resolutie beeldvorming en de verovering van de hele weefsel structuur ook al een laag-vergroting lens werd gebruikt. Normale menselijke bronchiale epitheliale cellen werden gebruikt om aan te tonen van de methodologie.

Introduction

Het belang van een 3D-cultuur, die beter biologische omgevingen bootst dan een 2D cultuur doet, is aanzienlijk benadrukt in cel/weefsel cultuur^1,2,3. De interactie tussen de cellen en de extracellulaire matrix (ECM) biedt belangrijke signalen met betrekking tot voedselproductie^4,5. Veel weefsel formaties kunnen komen alleen onder 3D omgevingen, zoals vouwen proces^6,7, invagination⁸en tubulaire vorming^9,

Protocol

1. fabricage van hybride gel kubus apparaat

1. Een polycarbonaat (PC) kubieke frame te bereiden met een machinale bewerking proces of een 3D-printer. De grootte van het frame van de PC is afhankelijk van de grootte van de steekproef. In deze studie gebruikten we een frame van 5 mm aan elke kant, zodat de takken had voldoende ruimte om te rekken tijdens het kweken.
2. Plaats het frame van de PC op een dia vooraf gekoeld glas of een ander glad oppervlak in een koelbox (< 0 ° C) (figuur 1A).
3. Voeg 12 µL voorverwarmde 1,5% agarose (w/v) van de bovenz─│de van de kubieke frame aan de onderkant met een pipet. Omlijnen de p....

Results

Normale cellen voor menselijke epitheliale bronchiale (NHBE) werden gebruikt om te tonen de geïllustreerde methodologie en controle van de geometrie van de eerste collectieve cel om een cilinder vorm en de vorm van een prisma, respectievelijk in een ECM-omgeving te bereiken. De verschillende richtingen imaging resultaten verkregen door fase contrast, alsmede het phalloidin kleuring van een cilinder vorm (figuur 4AB) en de vorm van de prisma (.......

Discussion

De methode die in dit document gepresenteerd is eenvoudig en kan worden uitgevoerd zonder hoogtechnologische apparatuur. Gelijktijdig, kan een precieze cel cluster vorm controleresultaat in de 3D-ruimte hydrogel worden verkregen. Na de eerste controle, kunnen de cellen groeien in de HGC zo veel als ze gekweekt op een schotel zijn. De verschillende richtingen beeldvorming wordt uitgevoerd door het draaien van het monster met de HGC met behulp van een systeem van microscopie, en het verbetert aanzienlijk de kwaliteit van d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well-plate	Corning  Inc.	3513
2-Methoxy-1-methylethyl Acetate	FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.	130-10505	PGMEA, CAS: 108-65-6
4% paraformaldehyde	FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.	161-20141	CAS: 30525-89-4
Agarose, low gelling temperature  BioReagent	Sigma-Aldrich	A9414
Alexa fluor 488 phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379
AZ1512	Merck
BEGM bullet kit	Lonza	CC-3170	Specialized medium for NHBE cells
Bovine Serum Albumin solution (10 %)	Sigma-Aldrich	A1595
EGM-2 bullet kit	Lonza	CC-3162	Specialized medium for endothelial cells
Lipidure	NOF co.		MPC polymer
Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix	Corning  Inc.	354230
Normal Goat Serum (10%)	Thermo Fisher Scientific	50197Z
Normal human bronchial epithelial cells	Lonza	CC-2541
SILPOT 184 W/C	Dow Corning Co.	3255981	Base resin and catalyst for PDMS
SUEX D300		DJ MicroLaminates, Inc	Thick negative photoresist (thichness: 300 mm)
Triton X-100 (1%)	Thermo Fisher Scientific	HFH10
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Fisher Scientific	25200056
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P9416