Beheer van de clusters van de eerste 3D-cel in een hybride Gel kubus apparaat voor herhaalbare patroon formaties

Summary

Presenteren we een procedure voor de controle op de eerste cel cluster-vorm in een 3D extracellulaire matrix te verkrijgen van een herhaalbare patroonformatie. Een kubieke apparaat met twee verschillende hydrogels wordt gebruikt om verschillende richtingen imaging voor weefsel patroonformatie.

Abstract

Het belang van in vitro culturen van 3D is aanzienlijk benadrukt in cel/weefselkweek. Echter behoort het gebrek aan experimentele herhaalbaarheid tot haar beperkingen. De analyse van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de zelf-organisatie verslechtert produceren weinig herhaalbare resultaten van patroonformatie. Vermindering van de variatie in de voorwaarden van de oorspronkelijke cultuur, zoals de celdichtheid en distributie in de extracellulaire matrix (ECM), is cruciaal voor het verbeteren van de herhaalbaarheid van een 3D-cultuur. In dit artikel tonen we een eenvoudige, maar robuuste procedure voor de controle op de eerste cel cluster-vorm in een 3D extracellulaire matrix te verkrijgen zeer herhaalbare patroon formaties. Een micromold met een gewenste vorm werd vervaardigd met behulp van fotolithografie of een machinale bewerking proces, en het een 3D zak gevormd in de ECM vervat in een hybride gel kubus (HGC). Sterk geconcentreerde cellen werden vervolgens geïnjecteerd in de zak zodat de cel cluster vorm gekoppeld aan de shape verzonnen schimmel. De werknemer HGC toegestaan verschillende richtingen scannen door de rotatie, waardoor hoge resolutie beeldvorming en de verovering van de hele weefsel structuur ook al een laag-vergroting lens werd gebruikt. Normale menselijke bronchiale epitheliale cellen werden gebruikt om aan te tonen van de methodologie.

Introduction

Het belang van een 3D-cultuur, die beter biologische omgevingen bootst dan een 2D cultuur doet, is aanzienlijk benadrukt in cel/weefsel cultuur^1,2,3. De interactie tussen de cellen en de extracellulaire matrix (ECM) biedt belangrijke signalen met betrekking tot voedselproductie^4,5. Veel weefsel formaties kunnen komen alleen onder 3D omgevingen, zoals vouwen proces^6,7, invagination⁸en tubulaire vorming^9,10. Echter talrijke moeilijkheden te voorkomen dat onderzoekers verschuiven naar 3D experimenten uit 2D experimenten op een schotel. Een van de grootste problemen in 3D experimenten is de kwestie van imaging 3D monsters. Vergeleken met vlakke experimenten, is verwerving van passende 3D-beelden nog uitdagend in veel gevallen. In het bijzonder, is het verkrijgen van een passende 3D beeld een moeilijke taak, wanneer de grootte van de steekproef het bereik van de millimeter als gevolg van de grote focale diepte van lage-vergroting lenzen bereikt. Bijvoorbeeld, bereikt de focal diepte meer dan 50 µm wanneer een 10 x vergroting lens wordt gebruikt terwijl de grootte van een enkele cel gewoonlijk minder dan 10 µm is. Ter verhoging van de kwaliteit van de beeldvorming, hoogtechnologische microscopie systemen worden ontwikkeld (bijvoorbeeld twee-foton microscopie¹¹ en licht vel microscopie systeem¹²), maar de beschikbaarheid ervan is beperkt vanwege hun dure prijs. Als alternatief hebben we eerder een hybride gel kubus (HGC) apparaat¹³ontwikkeld. Het apparaat bestaat uit twee soorten hydrogels: agarose als een ondersteuning-gel en een ECM zoals collageen of Matrigel als een cultuur-gel. Het HGC laat ons toe om het monster te verzamelen tijdens het kweken en draai de kubus om verschillende richtingen imaging, dat zich richt op de focal diepte probleem¹⁴.

Een ander probleem in 3D experimenten is hun lage herhaalbaarheid vanwege de slechte controleerbaarheid van de 3D omgevingen. In tegenstelling tot een vlakke cultuur op een kunststof schotel optreden variaties in de voorwaarden van de oorspronkelijke cultuur gemakkelijk in een 3D-ruimte omgeven door een zacht materiaal. Een aanzienlijke variatie in de experimentele resultaten verslechtert de volgende analyse en maskeert de onderliggende mechanismen. Vele engineering technologieën zijn ontwikkeld om het ruimtelijk uitlijnen afzonderlijke cellen, zoals de bioprinting^15,16, vezel weven¹⁷, en steigers¹⁸, maar zij vereisen complexe voorbewerken of in het bijzonder ontworpen apparatuur. Wij hebben daarentegen een methodologie voor het bereiken van 3D Celuitlijning in een HGC¹⁹ontwikkeld.

In dit protocol geïllustreerd we een eenvoudige procedure met veel gebruikte apparatuur voor het beheersen van de 3D eerste cel cluster-vorm in een HGC. Ten eerste werd het fabricageproces van het HGC aangetoond. Vervolgens werden in de HGC voor de productie van een zakje met een willekeurige vorm in een ECM micromolds vervaardigd door fotolithografie of een machinale bewerking proces geplaatst. Zeer dichte cellen na het centrifugeren werden vervolgens geïnjecteerd in de zak om de eerste cel cluster vorm in de HGC te bepalen. Het cluster precies gecontroleerde cel kon worden beeld uit de vele richtingen vanwege de HGC. Normale cellen voor menselijke epitheliale bronchiale (NHBE) werden gebruikt om aan te tonen van de controle op de eerste cel cluster vorm en beeldvorming van de takken vanuit meerdere richtingen voor het verbeteren van de kwaliteit van de beeldvorming.

Protocol

1. fabricage van hybride gel kubus apparaat

1. Een polycarbonaat (PC) kubieke frame te bereiden met een machinale bewerking proces of een 3D-printer. De grootte van het frame van de PC is afhankelijk van de grootte van de steekproef. In deze studie gebruikten we een frame van 5 mm aan elke kant, zodat de takken had voldoende ruimte om te rekken tijdens het kweken.
2. Plaats het frame van de PC op een dia vooraf gekoeld glas of een ander glad oppervlak in een koelbox (< 0 ° C) (figuur 1A).
3. Voeg 12 µL voorverwarmde 1,5% agarose (w/v) van de bovenz─│de van de kubieke frame aan de onderkant met een pipet. Omlijnen de pipet zodat de agarose verspreidt om te maken van een plat oppervlak (figuur 1B).
4. Binnen enkele minuten zal de agarose worden genezen. Het frame van de PC halen door deze te schuiven aan de rand van het glasplaatje met pincet. Opmerking dat verticaal oppakken van het frame van het glasplaatje resulteren kan in het loskoppelen van het agarose van de kubieke frame als gevolg van de adhesieve kracht tussen de agarose en het glasplaatje (Figuur 1 c).
5. Draai het kubieke frame om het open gezicht naar beneden, en plaats dan op het glasplaatje weer (Figuur 1 d).
6. Herhaal stap 1.3-1.5 tot drie oppervlakken zijn gevuld met agarose (figuur 1E).
7. Om een agarose muur op de vierde en vijfde gezichten, drop de agarose in van een open gezicht (figuur 1F). Zodra een agarose muur wordt gevormd op het vijfde gezicht, is de voorbereiding van het HGC voltooid.

2. de fabricage van micromolds door fotolithografie of een machinale bewerking proces

1. Fabricage door fotolithografie
   1. Schoon een silicium (Si) wafer via ultrasoon reinigen met aceton, en isopropylalcohol (IPA), dan gedistilleerd (DI) water gedurende 5 minuten elk. Na stikstof waait het zegel van de Si met stikstof, drogen in een oven op 140 ° C gedurende 20 minuten (figuur 2A(i)).
   2. Spin-vacht een offer laag zoals LOR en Az op de Si wafer weerstaat (2.000 rpm, 30 s) met behulp van een draai-coater onder geel licht. Onmiddellijk na spin-coating, verwarm het zegel op een hete plaat bij 90 ° C gedurende 3 minuten (figuur 2A(ii)). De gewenste dikte van de opofferende laag is meer dan 1 µm, zodat de lift off proces kan gemakkelijk worden uitgevoerd, maar een nauwkeurige dikte niet nodig is.
   3. Plaats het zegel op een hete plaat bij 70 ° C, en vervolgens een dikke negatieve fotoresist blad laminaat met de gewenste dikte op de opofferende laag met een hand roller (figuur 2A(iii))
   4. Vijf minuten na lamineren, plaats het zegel op een masker aligner voor UV-blootstelling. Instellen van een photomask met het gewenste patroon op het blad weerstaan en bloot met UV-licht voor een passende tijdsduur. De belichtingstijd wordt bepaald door de dikte van fotoresist en de intensiteit van de UV-licht. Plaats vervolgens de wafer op een hete plaat voor een bak post-exposure bij 60 ° C gedurende 5 minuten, gevolgd door het baksel bij 90 ° C gedurende 10 min. (figuur 2A(iv))
   5. Ontwikkelen van een negatieve fotoresist door de wafer in propyleenglycol monomethylether ether acetaat (PGMEA) onder te dompelen totdat het blootgestelde gebied volledig is opgelost (ongeveer 20 min) (figuur 2A(v)).
   6. Los de opofferende laag met behulp van IPA voor ultrasone reiniging te heffen uit de microstructuur. Zodra de microstructuur is uit de wafer geschild af, spoel met DI water door ultrasone reiniging voor 10 min (figuur 2A(vi)).
   7. Dompel de schimmel in 30 µL van het MPC polymeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (ongeveer 20 ° C) tot het volledig uitdrogen. Figuur 2B toont de verzonnen prism schimmel.
2. Fabricage van de schimmel van een cilinder
   1. Een stalen cilinder schimmel met de gewenste grootte door een machinale bewerking proces fabriceren. Anderzijds gebruiken verkrijgbare roestvrij staal. (In deze studie een φ 600 µm cilinder wordt gebruikt.)
   2. Dompel het staal van de cilinder in 30 µL van het MPC polymeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (ongeveer 20 ° C) tot het volledig uitdrogen.
   3. Bereid van vloeibare Polydimethylsiloxaan (PDMS) door het mengen van base hars en de katalysator (Zie Tabel van materialen) in een 10:1-verhouding, gevolgd door de ontgassing met een vacuüm ontgassing systeem voor 20 min. Giet de PDMS in een 12-well-plate.
   4. De stalen cilinder loodrecht op het oppervlak van de datum en vaste naar een lineaire z-fase zo instellen dat deze loodrecht in de niet-uitgeharde PDMS oppervlak in een 12-well-plate geplaatst op de dezelfde datum oppervlak door het bewegen van de z-fase kan worden ingevoegd. Incubeer de PDMS met het staal van de cilinder in de oven gedurende 20 minuten op 90 ° C voor het genezen. Snijd de PDMS vormen een flank oppervlak zodat de Pipetteer kan worden ingevoegd in de volgende procedure (figuur 2C).

3. beheersing van de eerste cel cluster vorm in een hydrogel

1. Een passende ECM voor de gewenste celcultuur, zoals collageen en kunstmatige kelder membraan, injecteren de HGC te vullen de ruimte van de cultuur (figuur 3A).
2. Stel de gefabriceerde micromold op de HGC direct of indirect met een passende houder, zoals aangegeven in figuur 3B. Plaats vervolgens de HGC in een CO₂ incubator gedurende 25 minuten bij 37 ° C voor het genezen van het.
3. Trek voorzichtig uit de micromold zodat de ECM niet (Figuur 3 c verslechteren doet). De zak, zullen als de gewenste schimmel vorm, worden vervaardigd in de ECM.
4. Oogsten van cellen uit de gekweekte schotel door trypsine-EDTA of het equivalent daarvan afhankelijk van de celtypen. Centrifugeer vervolgens de cellen om te verkrijgen van sterk geconcentreerde cellen (voor NHBE cultuur, toepassen van 0,25% trypsine-EDTA en Incubeer de cellen gedurende 3 minuten, daarna neutraliseren met de FBS-bevattende medium en centrifugeren op 300 x g voor 4 min).
5. Na centrifugeren wordt het supernatant medium als u wilt condenseren de cellen verwijderen en injecteren sterk geconcentreerde cellen (3.0 × 10⁴ cellen/µL voor NHBE cellen) in de zak in het ECM (figuur 3D).
6. Incubeer de HGC met cellen in een CO₂ incubator gedurende 20 minuten bij 37 ° C, zodat de cellen in de zak van de ECM te vullen de ruimte die is gemaakt door de micromolds vallen. Als buitensporige medium of cellen op de bovenste oppervlakte aanwezig zijn, verwijder voorzichtig met behulp van een precisiepipet.
7. Plaats van het HGC op een 24-well-plate en voeg 100 µL van geschikte voedingsbodem (figuur 3E). Voor NHBE cellen, gebruikt u een 1:1-mengsel van verkrijgbare gespecialiseerde medium voor NHBE en endotheliale cellen (Zie Tabel van materialen).
8. Injecteren extra ECM om te sluiten van de zak in de ECM, en vervolgens Incubeer bij 37 ° C gedurende 25 minuten.
9. Afkoelen voorverwarmde 1,5% agarose tot kamertemperatuur (ongeveer 20 ° C). Druppel ongeveer 10 µL van het agarose op de bovenkant van het HGC te sluiten van het oppervlak en de ECM verhinderen uit te vallen uit de HGC tijdens het kweken en beeldvorming (figuur 3F). Vervolgens, Incubeer de HGC voor een ander 20 minuten bij 37 ° C om te genezen van de agarose.
10. Middellange ter dekking van de gehele HGC, zodat de osmotische druk helpen kunnen bij het verstrekken van voeding op de cellen binnen het HGC toevoegen.

4. multi-directionele imaging

1. Niet-invasieve 3D Vormherkenning door verschillende richtingen observatie
   1. Plaats de cultuur schotel of goed plaat met de HGC op een microscoop en oriënteren van de HGC aan het frame van de camera. Dan, krijgen een voorbeeldafbeelding door heldere veld of fase contrast.
   2. Halen en draaien de HGC om een verschillende ondergrond plaats naar beneden.
   3. Herhaal de stappen punten 4.1.1 en 4.1.2 om beelden van alle zes zijden zijn verkregen.
2. Immuno-belichting fluorescerende beeldvorming door verschillende richtingen observatie
   1. Voor fixatie, toepassing 4% paraformaldehyde op het monster via de HGC bij kamertemperatuur (ongeveer 20 ° C) gedurende 20 minuten, gevolgd door de twee spoelen van PBS voor elke 10 min.
   2. Permeabilize de HGC met PBS met 0,5% Triton X-100 gedurende 10 minuten bij 4 ° C, daarna wassen 3 x voor 10 min met PBS.
   3. Incubeer de HGC met 10% serum van de geit in IF-buffer (0.2% Triton X-100, 0,1% bovien serumalbumine en 0,05% Tween-20 in PBS) gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur voor een primaire blokkerende stap.
   4. Voor vlekken van een specifiek molecuul, de juiste antilichaam te gebruiken. Om te zien hoe de collectieve cel geometrie, kan Alexa Fluor 488 Phalloidin worden gebruikt om vlek actine.
   5. Plaats de HGC op een glazen bodem schotel onder een laser- of fluorescentie Microscoop en uitvoeren scannen vanaf zes zijden om de gehele steekproef beeld te krijgen.

Results

Normale cellen voor menselijke epitheliale bronchiale (NHBE) werden gebruikt om te tonen de geïllustreerde methodologie en controle van de geometrie van de eerste collectieve cel om een cilinder vorm en de vorm van een prisma, respectievelijk in een ECM-omgeving te bereiken. De verschillende richtingen imaging resultaten verkregen door fase contrast, alsmede het phalloidin kleuring van een cilinder vorm (figuur 4AB) en de vorm van de prisma (...

Discussion

De methode die in dit document gepresenteerd is eenvoudig en kan worden uitgevoerd zonder hoogtechnologische apparatuur. Gelijktijdig, kan een precieze cel cluster vorm controleresultaat in de 3D-ruimte hydrogel worden verkregen. Na de eerste controle, kunnen de cellen groeien in de HGC zo veel als ze gekweekt op een schotel zijn. De verschillende richtingen beeldvorming wordt uitgevoerd door het draaien van het monster met de HGC met behulp van een systeem van microscopie, en het verbetert aanzienlijk de kwaliteit van d...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well-plate	Corning  Inc.	3513
2-Methoxy-1-methylethyl Acetate	FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.	130-10505	PGMEA, CAS: 108-65-6
4% paraformaldehyde	FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.	161-20141	CAS: 30525-89-4
Agarose, low gelling temperature  BioReagent	Sigma-Aldrich	A9414
Alexa fluor 488 phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379
AZ1512	Merck
BEGM bullet kit	Lonza	CC-3170	Speciaal medium voor NHBE cellen
Bovine Serum Albumin solution (10 %)	Sigma-Aldrich	A1595
EGM-2 bullet kit	Lonza	CC-3162	Speciaal medium voor endotheelcellen
Lipidure	NOF co.		MPC polymeer
Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix	Corning  Inc.	354230
Normal Goat Serum (10%)	Thermo Fisher Scientific	50197Z
Normal human bronchial epithelial cells	Lonza	CC-2541
SILPOT 184 W/C	Dow Corning Co.	3255981	Basishars en katalysator voor PDMS
SUEX D300		DJ MicroLaminates, Inc	Dikke negatieve fotoresist (dikte: 300 mm)
Triton X-100 (1%)	Thermo Fisher Scientific	HFH10
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Fisher Scientific	25200056
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P9416