Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Bestuderen van RNA Interactors van proteïne Kinase RNA-geactiveerd tijdens de zoogdieren celcyclus

6.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59215

⸱

5 maart 2019

 ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering and KI for Health Science and Technology (KIHST), Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST)

In dit artikel

Samenvatting

Wij presenteren experimentele benaderingen voor studeren RNA-interactors van double-stranded RNA bindend proteïne kinase RNA-geactiveerd (PKR) tijdens de zoogdieren celcyclus met behulp van HeLa cellen. Deze methode maakt gebruik van formaldehyde dwarslijn RNA-PKR complexen en immunoprecipitation te verrijken van PKR-gebonden RNAs. Deze RNAs kunnen verder worden geanalyseerd door middel van high-throughput sequencing of qRT-PCR.

Samenvatting

Proteïne kinase RNA-geactiveerd (PKR) is een lid van de ingeboren immune reactie-eiwitten en de secundaire structuur van de double-stranded van virale RNAs herkent. Wanneer verbonden met de virale double-stranded RNAs (dsRNAs), ondergaat PKR dimerisatie en latere autophosphorylation. Gefosforyleerd PKR (pPKR) wordt geactiveerd en induceert fosforylering van de alpha subeenheid van eukaryotische initiatie factor 2 (eIF2α) om te onderdrukken van globale vertaling. Een groeiende hoeveelheid bewijs suggereert dat PKR onder fysiologische omstandigheden, zoals tijdens de celcyclus of onder verschillende stress omstandigheden zonder infectie kan worden geactiveerd. Ons begrip van de RNA-activators van PKR is echter beperkt door het gebrek aan een gestandaardiseerde experimentele methode vastleggen en analyseren van PKR-interactie dsRNAs. Hier presenteren we een experimenteel protocol bij specifiek verrijken en analyseren van PKR gebonden RNAs tijdens de cyclus van de cel met behulp van HeLa cellen. Wij gebruiken de efficiënte crosslinking activiteit van formaldehyde te lossen PKR-RNA complexen en isoleren ze via immunoprecipitation. PKR co-immunoprecipitated RNAs kunnen vervolgens verder worden verwerkt voor het genereren van een hoge-doorvoer sequencing-bibliotheek. Een belangrijke klasse van PKR-interactie cellulaire dsRNAs is mitochondriale RNAs (mtRNAs), die kunnen bestaan als intermoleculaire dsRNAs door complementaire interactie tussen de zware-strand en de RNAs licht-strand. De strandedness van deze duplex mtRNAs studeren, presenteren wij ook een protocol voor strand-specifieke qRT-PCR. Ons protocol is geoptimaliseerd voor de analyse van PKR-gebonden RNAs, maar het kan eenvoudig worden aangepast om te bestuderen van cellulaire dsRNAs of RNA-interactors van andere dsRNA bindende proteïnen.

Inleiding

Proteïne kinase RNA-geactiveerd (PKR), ook bekend als eukaryotische initiatie factor 2-alpha kinase 2 (EIF2AK2), is een goed gekarakteriseerd proteïne kinase dat door RNAs verstrekte informatie doorgeeft. Het behoort tot de eukaryote vertaling Inleiding 2 subeenheid alpha (eIF2α) kinase familie en kinaseenzym eIF2α op serine 51 in reactie op de infectie te onderdrukken global translation1. In dit verband wordt PKR geactiveerd door virale double-stranded RNAs (dsRNAs), die een platform te voor PKR dimerisatie en autophosphorylation2 bieden. Naast eIF2α, kan PKR ook phosphorylate p53, insuline receptor substraat 1 remmer recombination en kinase c-Jun N-terminal (JNK) voor het regelen van de activiteit van talrijke signaaltransductie trajecten3,4,5, 6.

PKR was oorspronkelijk geïdentificeerd als een kinase dat phosphorylated eIF2α tijdens poliovirus infectie door het poliovirus' dsRNAs7,8te herkennen. PKR is steeds gevonden veelzijdige rollen voorbij immuunrespons te spelen, en wordt haar afwijkende activering of storing geïmpliceerd in talrijke ziekten bij de mens. Geactiveerd/Phosphorylated PKR (pPKR) is vaak waargenomen tijdens apoptosis en is een gemeenschappelijk kenmerk van patiënten met degeneratieve ziekten, met name neurodegeneratieve ziekten zoals Huntingtons, Parkinson van, en de ziekte van Alzheimer9 ,10,11,12,13. Bovendien, is PKR geactiveerd onder verschillende stress toestanden in de metabole stress en warmte schok14,15,16,17. Aan de andere kant, resulteert remming van PKR in verhoogde celproliferatie en zelfs maligne transformatie18,19. PKR functie is ook belangrijk in de normale hersenfunctie en tijdens de celcyclus als het niveau van de pPKR verhoogde tijdens de M fase20,21,22. In dit verband pPKR onderdrukt globale vertaling en geeft aanwijzingen aan de mitotische signalering sleutelsystemen die vereist voor goede celdeling20 zijn. Bovendien, langdurige activering van PKR geresulteerd in G2/M fase celcyclus arrestatie in Chinese hamster ovary23 cellen. Bijgevolg, PKR fosforylatie wordt geregeld door de negatieve feedback-lus om ervoor te zorgen snelle deactiveren tijdens M/G1 overgang21.

Ondanks de brede waaier van PKR-functie is ons begrip van PKR activering beperkt als gevolg van het gebrek aan een gestandaardiseerde high-throughput experimentele aanpak om te vangen en het identificeren van dsRNAs die PKR kunt activeren. Eerdere studies hebben aangetoond dat PKR kan interageren met dsRNAs gevormd door twee omgekeerde Alu herhalingen (IRAlus)20,24, maar de mogelijkheid van het bestaan van extra cellulaire dsRNAs die PKR kunt activeren tijdens de celcyclus of onder stress voorwaarden in menselijke cellen was gebracht. De conventionele aanpak bij het identificeren van RNA-interactors van een RNA-bindende eiwit (RBP) maakt gebruik van UV-licht tot en met dwarslijn RNA-RBP complexen25,26,27. Een recente studie deze UV crosslinking benadering toegepast in een muis-systeem en geïdentificeerd dat kleine nucleolar RNAs PKR activering tijdens metabole stress16kunnen regelen. Door gebruik te maken van hoge crosslinking efficiëntie van formaldehyde, voorgesteld hebben we een alternatieve methode om te identificeren van PKR-interactie RNAs tijdens de celcyclus in HeLa cellen28. Een soortgelijke aanpak is toegepast om te bestuderen van andere dsRBPs zoals Staufen en Drosha29,30,31. We vonden dat PKR met verschillende soorten noncoding RNAs interageren kan zoals korte afgewisseld nucleaire element (sinus), lange afgewisseld nucleaire element (lijn), endogene retrovirus element (ERV), en zelfs alpha-satelliet RNAs. Daarnaast, toonden we dat PKR met mitochondriale RNAs (mtRNAs) interageren kan, welke vorm intermoleculaire dsRNAs door complementaire interactie tussen de zware-strand en het licht strand RNAs28. Een recente publicatie verder ondersteund onze gegevens dat sommige mtRNAs bestaan in de vorm van een dubbelzijdig en dsRNA sensoren zoals melanoom differentiatie-geassocieerde eiwit 5 voor het opwekken van interferon32kunt activeren. Nog belangrijker, worden de expressie en subcellular localisatie van mtRNAs gemoduleerd tijdens de celcyclus en door verschillende stressoren, die belangrijk zijn in hun vermogen om te regelen van PKR activering28kan zijn.

In dit artikel presenteren we een gedetailleerd protocol voor een onlangs ontwikkelde formaldehyde crosslinking en immunoprecipitation (fCLIP) methode voor het vastleggen en analyseren van PKR-interactie RNAs tijdens de celcyclus. Wij demonstreren de methode ter voorbereiding van de celcyclus arrestatie monsters met behulp van thymidine en nocodazole. Vervolgens presenteren we het fCLIP-proces om te isoleren van de PKR-gebonden RNAs en een methode ter voorbereiding van high-throughput sequencing bibliotheek om te identificeren deze RNAs. Bovendien, bakenen we gedetailleerde procedures voor het analyseren van PKR-gebonden RNAs qRT-PCR gebruikt. Specifiek, presenteren we een omgekeerde transcriptie van strand-specifieke procedure voor het analyseren van de strandedness van mtRNAs. Het beschreven protocol is geoptimaliseerd voor HeLa cellen en PKR, maar belangrijke stappen zoals de voorbereiding van de celcyclus monster, fCLIP en strand-specifieke qRT-PCR analyse kunnen eenvoudig worden aangepast, bestuderen van cellulaire dsRNAs of identificeren van RNA interactors van andere dsRBPs.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. oplossing en cel voorbereiding

  1. Bereiding van de oplossing
    1. Voor de cel kweekmedium, voorbereiden op middellange HeLa celkweek door toevoeging van 50 mL van foetale runderserum (FBS) tot 500 mL van de Dulbecco bewerkt Eagle's Medium (DMEM).
      Opmerking: Antibiotica kunnen worden toegevoegd aan het kweekmedium cel, maar wij gebruiken geen antibiotica.
    2. Los voor de paraformaldehyde van 0,1%, 4% (m/v) paraformaldehyde in 1 x Phosphate-Buffered zoutoplossing (PBS) met verwarming op een hete plaat en verdund tot 30 mL 0,1% (v/v) paraformaldehyde maken door toevoeging van 1 x PBS.
      Let op: Alle stappen in een zuurkast en wees voorzichtig niet aan de kook de paraformaldehyde-oplossing. De oplossing van 0,1% te beschermen tegen licht en bewaren bij 4 ° C. Gebruik de oplossing binnen een maand.
      Opmerking: De pH van de eindoplossing van de 0,1% (v/v)-paraformaldehyde moet ongeveer 7.
    3. FCLIP lysis-buffermengsel bereiden: 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 15 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,5% (v/v) nonidet-p40 (NP-40), 0,1% (v/v) Triton X-100, 0,1% (v/v) natrium dodecyl sulfaat (SDS) en 0,1% (g/v) natrium deoxycholate. Voeg triple gedestilleerd water (TDW) tot 40 mL. Bewaren bij 4 ° C.
    4. FCLIP was buffer bereiden: 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,1% (v/v) NP-40, 0,1% (v/v) Triton X-100, 0,1% (v/v) SDS en 0,1% (g/v) natrium deoxycholate. TDW aan 40 mL toevoegen. Bewaren bij 4 ° C.
    5. 4 x PK buffer bereiden: 400 mM Tris-HCl (pH 7.5), 200 mM NaCl, 40 mM EDTA, en 4% (v/v) SDS. TDW aan 40 mL toevoegen. Bewaren bij kamertemperatuur.
    6. FCLIP elutie buffer bereiden: 20 mL 4 x PK buffer, 21 g ureum en 8,5 mL TDW. Vers bereiden.
    7. Bereiden van RNA elutie buffer: 0.3 M NaOAc en 2% (g/v) SDS. Bewaren bij kamertemperatuur.
    8. Bereiden van 2 x RNA laden kleurstof: 0,025% (m/v) bromophenol blauw, 0,025% (m/v) xyleen cyanol 5 mM EDTA, 0.05% (m/v) SDS en 95% (v/v) formamide. Winkel bij-20 ° C.
    9. 1 x TBE buffer bereiden: 0.089 M Tris-boraat en 0,002 M EDTA. 500 mL TBE buffer voor te bereiden.
  2. Voorbereiding van S of M fase-gearresteerd cellen
    1. Zaad 750.000 ~ ~ 1.000.000 HeLa cellen of voor S of M fase-gearresteerd monsters, respectievelijk. Het groeien van cellen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur.
    2. De cellen met 2 mM thymidine behandelen en incubeer gedurende 18 uur bij 37 ° C.
    3. Wassen van de cellen twee keer met PBS. Voeg nieuwe media toe en incubeer gedurende 9 uur bij 37 ° C.
    4. Voor S behandelen fase-gearresteerd cellen, cellen met 2 mM thymidine. Voor M fase-gearresteerd cellen, cellen met 100 ng/mL nocodazole te behandelen. Incubeer gedurende 15 h bij 37 ° C en oogst cellen.
      Opmerking: De homogeniteit van de celcyclus monsters kan worden gecontroleerd met behulp van FACS.

2. formaldehyde dwarsbinding en immunoprecipitation

  1. Oogst van de cel
    1. Voor een S-fase monster, cellen met een cel schraper en overdracht in een conische tube van 15 mL te verzamelen. Tik op de kant van de cel cultuur Schotel los M fase-gearresteerd cellen en ze vervolgens overbrengen naar een conische tube van 15 mL voor een monster M fase.
      Opmerking: Het vergroten van de homogeniteit van de M-fase-gearresteerd cellen, gebruik niet een cel schraper.
    2. Centrifugeer de cellen bij 380 x g bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten Verwijder het supernatant en resuspendeer met 1 mL koude PBS en overdracht in een tube van 1,5 mL microcentrifuge.
    3. Centrifugeer de cellen bij 10.000 x g bij 4 ° C gedurende 30 s. verwijderen het supernatant volledig.
  2. Formaldehyde crosslinking
    1. Voeg 750 μL van 0,1% paraformaldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur te lossen van de cellen.
    2. 250 μL van 1 M glycine toevoegen en een extra 10 minuten bij kamertemperatuur te quench de reactie uit te broeden. Centrifugeer de cellen bij 10.000 x g bij 4 ° C gedurende 30 s. verwijderen het supernatant volledig.
    3. Resuspendeer met 1 mL PBS. Centrifugeer de cellen bij 10.000 x g bij 4 ° C gedurende 30 s en verwijder de bovendrijvende substantie.
    4. Resuspendeer met 400 μL van fCLIP lysis-buffermengsel aangevuld met 0,2% (v/v) proteaseinhibitor en 2% (v/v) RNase remmer. Incubeer op ijs gedurende 10 minuten en bewerk ultrasone trillingen ten met behulp van een ultrasonicator.
    5. Voeg 11 l 5 M NaCl aanpassen NaCl concentratie tot ~ 150 mM. Vortex kort en centrifugeer bij 21,130 x g bij 4 ° C gedurende 15 min. overbrengen in het supernatant een vooraf gekoeld 1,5 mL microcentrifuge buis.
      Opmerking: Behouden 40 μL van de bovendrijvende substantie in een nieuwe centrifugebuis als de input monster. Opslaan van het input monster bij 4 ° C.
  3. Immunoprecipitation
    1. Voeg 20 μL van EiwitA kralen in een tube van 1,5 mL microcentrifuge.
    2. Wassen van de kralen met 400 μL van fCLIP lysis-buffermengsel. Centrifugeer de kralen bij 1.000 x g bij 4 ° C voor 1 min. Verwijder het supernatant en 400 μL van fCLIP lysis-buffermengsel zorgvuldig toe te voegen. Zachtjes resuspendeer de kralen door het omkeren van de 3 ~ 4 keer.
    3. Herhaal de stap van wassen drie keer. Na de definitieve wash, het supernatant volledig te verwijderen.
    4. Resuspendeer de kralen in 300 μL van fCLIP lysis-buffermengsel. Voeg 8.3 l 5 M NaCl aanpassen NaCl concentratie tot ~ 150 mM. Voeg 10 μL van PKR antilichaam en incubeer gedurende 3 uur op een rotator bij 4 ° C.
    5. Centrifugeer de kralen bij 1.000 x g bij 4 ° C voor 1 min. Verwijder het supernatant en Voeg 400 l fCLIP was buffer. Zachtjes resuspendeer de kralen door het omkeren van de 3 ~ 4 keer.
    6. Herhaal de wassen stap twee keer. Na de definitieve wash, het supernatant volledig te verwijderen.
      Opmerking: Gebruik nooit een vortex-mixer. Omkeren van de tube zachtjes met de handen.
    7. Voeg 300 μL van lysate en incubeer gedurende 3 uur bij 4 ° C op een rotator.
      Opmerking: Langere incubatietijd kan leiden tot verhoogde achtergrond bindend.
    8. Centrifugeer de kralen bij 1.000 x g bij 4 ° C voor 1 min. Verwijder het supernatant en Voeg 400 l fCLIP was buffer. Zachtjes resuspendeer de kralen door het omkeren van de 3 ~ 4 keer.
    9. Herhaal de stap van wassen drie keer. Na de definitieve wash, het supernatant volledig te verwijderen.
    10. Voeg 300 l fCLIP elutie buffer. Incubeer in een thermomixer gedurende 3 uur bij 25 ° C tot Elueer PKR van de kralen.
      Opmerking: Bereiden de fCLIP elutie buffer fresh.
    11. Centrifugeer bij 1.000 x g bij kamertemperatuur en het supernatant overbrengen in een schone gesiliconiseerd buis.
      Opmerking: Een microcentrifuge buis is ook ok, maar gesiliconiseerd buis heeft de voorkeur om te voorkomen dat verdamping tijdens de de-crosslinking stap (2.3.12).
    12. Voeg 300 l proteïnase K (20 mg/mL) en na een nacht bebroeden bij 65 ° C.
      Opmerking: Gebruik een thermomixer met verwarmde dekking te voorkomen van verdamping.
  4. RNA extractie
    1. 580 μL van zuur-fenol chloroform en vortex toevoegen voor 30 s. Incubate bij 37 ° C gedurende 1 uur.
    2. Vortex voor 30 s en centrifugeer bij 12.000 x g bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
    3. Breng de bovenste laag in een schone 1,5 mL microcentrifuge buis. Het toevoegen van 1/10 volume van 3 M NaOAc, 0,5 μL van coprecipitant (bijvoorbeeld Glycoblue), en een gelijke hoeveelheid isopropanol. Na een nacht bebroeden bij-20 ° C.
    4. Neerslag pellets door centrifugeren bij maximale snelheid bij 4 ° C gedurende 1 uur.
      Opmerking: Als het RNA/DNA pellets niet zijn nageleefd, voeg een aanvullende 0,5 μL van coprecipitant en centrifuge voor een extra 1 h. doorgaan deze stap totdat RNA/DNA pellets worden waargenomen.
    5. Verwijder het supernatant en voeg vervolgens 1 mL van 75% ethylalcohol. Centrifugeer bij 12.000 x g bij 4 ° C gedurende 5 min. Herhaal de wassen stap één meer tijd. Verwijder het supernatant volledig en de pellet bij kamertemperatuur drogen.
    6. Voeg 42 l TDW, 5 μL van DNase ik buffer, 1 μL van RNase remmer en 2 μL van DNase I. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
    7. Voeg 150 μl van TDW en 200 μL van zuur-fenol chloroform. Vortex voor 30 s. Centrifuge bij 12.000 x g bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
    8. Breng de bovenste laag in een schone 1,5 mL microcentrifuge buis. 20 μL van 3 M NaOAc, 0,5 μL van coprecipitant en 1 mL 100% ethylalcohol toevoegen. Na een nacht bebroeden bij-80 ° C.
    9. Pellets neerslaan en wassen met 75% ethylalcohol zoals beschreven in stappen 2.4.4 aan 2.4.5.
    10. Resuspendeer in de juiste hoeveelheid TDW.

3. sequencing bibliotheek voorbereiding

  1. rRNA verwijdering
    1. Resuspendeer de RNA-pellets uit stap 2.4.10 met 28 μL van de TDW.
      Opmerking: De maximale hoeveelheid totaal RNA moet minder dan 5 μg.
    2. Volg de procedures door de rRNA verwijdering kit Naslaggids voor het verwijderen van rRNA.
    3. Opruimen rRNA RNAs van verarmd door toevoeging van 160 μL van magnetische kralen.
      1. Meng door pipetteren ~ 15 keer en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
      2. Koppelen van de buis op een magnetische bar en verwijder de bovendrijvende substantie.
      3. 300 μL van 80% ethylalcohol toevoegen terwijl de kralen nog steeds op de magnetische balk aangesloten zijn en incubeer 30 s.
      4. Ethylalcohol wordt vervangen door een verse 300 μL oplossing. Lucht drogen de kralen op de magnetische bar gedurende 12 minuten bij kamertemperatuur.
      5. Resuspendeer de kralen in 12 μL van de TDW en meng door pipetteren 15 keer.
      6. Koppelen van de kralen op de magnetische balk en verplaatsen de bovendrijvende substantie aan een schone PCR-buis.
    4. Het afbreken van de gefragmenteerde ribosomaal RNAs (rRNAs) na de procedures geboden door rRNA uitputting Kit.
    5. Schoonmaken van de RNAs door 110 μL van magnetische kralen en herhalende stappen 3.1.3.1 aan 3.1.3.6 toe te voegen.
  2. RNA labeling en adapter afbinding
    1. Op rRNA-verarmd RNAs, 2 μL van 10 x CIAP buffer, 1 μL van RNase remmer en 2 μL van Antarctische alkalische fosfatase toevoegen. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur, waarna bij 65 ° C gedurende 5 min naar de inactivering van de fosfatase.
    2. Voeg 3 μL van 10 x PNK buffer, 1.5 μL van RNase remmer, 1.5 μL van T4 PNK enzym 0.8 μL van r-ATP en 1.7 μL van de TDW. Incubeer bij 37 ° C gedurende 50 min.
    3. Voeg 1,5 l 10 mM ATP en Incubeer bij 37 ° C voor extra 40 min.
    4. Zet de reactie stop door 170 μL van de RNA elutie buffer toe te voegen.
    5. Voeg 200 l zuur-fenol chloroform en vortex voor 30 s. Centrifuge bij 12.000 x g bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
    6. Breng de bovenste laag in een schone 1,5 mL microcentrifuge buis. 20 μL van 3 M NaOAc, 0,5 μL van coprecipitant en 1 mL 100% ethylalcohol toevoegen. Na een nacht bebroeden bij-80 ° C.
    7. RNA pellets neerslaan en wassen met 75% ethylalcohol zoals beschreven in stappen 2.4.4 aan 2.4.5. Resuspendeer in 4.5 μL van de TDW en 9 μL van 2 x RNA laden kleurstof toe te voegen.
    8. Verwarm het monster bij 95 ° C gedurende 5 min en belasting op een 10% ureum-pagina gel.
    9. De gel op 370 V voor 40 min uitvoeren.
      Opmerking: Vooraf draaien de gel op 370 V gedurende 90 minuten vóór het laden van het monster.
    10. Snijd de gel op de regio van de nucleotide ~ 100-500 en breken van de gel.
    11. Voeg 700 μL van 0.3 M NaCl en na een nacht bebroeden bij 4 ° C op een rotator.
    12. Breng de oplossing over in een kolom en centrifugeer bij maximumsnelheid bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
    13. Breng het eluaat in een schone 1,5 mL microcentrifuge buis. Het toevoegen van 1/10 volume van 3 M NaOAc, 0,5 μL van coprecipitant, en een gelijke hoeveelheid isopropanol. Na een nacht bebroeden bij-20 ° C.
  3. adapter afbinding 3'
    1. RNA pellets neerslaan en wassen met 75% ethylalcohol zoals beschreven in stappen 2.4.4 aan 2.4.5.
    2. Resuspendeer de RNA-pellets in 6.5 μL van de TDW en voeg 1 μl van 10 μM 3' adapter.
    3. Breng de oplossing over in een PCR-buis en Incubeer bij 70 ° C gedurende 2 minuten.
    4. Voeg 1 μl van 10 x afbinding buffer, 0,5 μL van RNase remmer en 1 μL van T4 RNA ligase 2. Incubeer bij 28 ° C gedurende 1 uur, 25 ° C gedurende 6 uur en 22 ° C gedurende 6 uur.
    5. Voeg 12 μl van 2 x RNA laden kleurstof en warmte bij 95 ° C gedurende 5 min.
    6. Gel zuiveren de 3' adapter afgebonden RNAs zoals beschreven in 3.2.9 aan 3.2.13.
  4. adapter afbinding 5'
    1. RNA pellets neerslaan en wassen met 75% ethylalcohol zoals beschreven in stappen 2.4.4 aan 2.4.5.
    2. Resuspendeer de RNA-pellets in 4.2 μL van de TDW en voeg 1 μl van 5 μM 5' adapter.
    3. Breng de oplossing over in een PCR-buis en Incubeer bij 70 ° C gedurende 2 minuten.
    4. Voeg 0.8 l 10 x ligase buffer, 0.4 μL van RNase remmer, 0.8 μL van 10 mM ATP, 0.8 μL van T4 RNA ligase 1. Incubeer bij 28 ° C gedurende 1 uur, 25 ° C gedurende 6 uur en 22 ° C gedurende 6 uur.
  5. Omgekeerde transcriptie en PCR versterking
    1. Op 5' adapter toevoegen ligaturen RNAs, 1 μL van 4 μM omgekeerde transcriptie primer. Incubeer bij 70 ° C gedurende 2 min en onmiddellijk afkoelen tot 4 ° C.
    2. Voeg 4 μL van 5 x FS buffer, 4 μL van 2.5 mM dNTP, 1 μL van 0,1 M DTT 1 μL van RNase remmer en 1 μL van reverse-transcriptase. Incubeer bij 50 ° C gedurende 1 uur en 70 ° C gedurende 15 minuten.
    3. Bereiden van PCR versterking
      1. Meng 1 μL van RT product, 1 μL van 25 μM RPI primer 1 μL van 25 μM RP1 primer, 10 μL van 5 x HF buffer, 4 μL van 2.5 mM dNTP, 32.5 μL van de TDW en 0,5 μL van HiFi-polymerase.
      2. PCR programma uitvoeren voor 11 ~ 13 cycli.
        Opmerking: Het programma voor de PCR is: 98 ° C gedurende 30 s voor een warme start, 98 ° C gedurende 10 s, 60 ° C gedurende 30 s en 72 ° C gedurende 45 s voor versterking, en 72 ° C gedurende 5 minuten. De versterking-stap wordt herhaald voor 11-13 cycli.
    4. Schoonmaken van de PCR-producten met behulp van 40 μL van de magnetische kralen en volgende stappen 3.1.3.1 te 3.1.3.6 maar met behulp van 10 μL van de TDW te elueren van het DNA.
    5. Voeg 2 l 10 x DNA laden kleurstof. Laden van het monster op een 6% acrylamide gel en bij 200 V voor 30 min lopen.
    6. Vlek met Sybr goud (0,01% (v/v) in 1 x TBE buffer) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    7. De vlek in 1 x TBE buffer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    8. Snij de gel op de regio van de nucleotide ~ 200-700 en breken van de gel.
    9. Voeg 700 μL van 0.3 M NaCl en na een nacht bebroeden bij kamertemperatuur te elueren van het DNA.
    10. Alles op een kolom en centrifugeer bij maximumsnelheid bij kamertemperatuur gedurende 5 min te laden.
    11. Breng het eluaat in een schone 1,5 mL microcentrifuge buis. Het toevoegen van 1/10 volume van 3 M NaOAc, 0,5 μL van coprecipitant, en een gelijke hoeveelheid isopropanol. Na een nacht bebroeden bij-20 ° C.
    12. DNA pellets neerslaan en wassen met 75% ethylalcohol zoals beschreven in stappen 2.4.4 aan 2.4.5. Resuspendeer in 20 μL van de TDW.
    13. Analyseren van het monster met behulp van een sequencer.

4. analyse van PKR-interactie RNAs met qRT-PCR

  1. Methode 1: Random hexamer reverse transcriptie
    1. Resuspendeer RNA pellets uit stap 2.4.10 met 8,5 μl van TDW en breng de oplossing over in een PCR-buis.
    2. Voeg 0,5 μL van 100 μM willekeurige hexamers en 4 μL van 2.5 mM dNTP mix.
    3. Warmte de oplossing bij 65 ° C gedurende 5 minuten en onmiddellijk uit te broeden op ijs voor minstens 1 min.
    4. Maken van de reactie mengen: 4 μL van 5 x SSIV buffer, 1 μL van 100 mM DTT, 1 μL van RNase remmer en 1 μL van reverse-transcriptase (200 U/μl). De mix aan het RNA-oplossing toevoegen.
    5. Incubeer het mengsel bij 23 ° C gedurende 10 min, 10 min, 50 ° C en 80 ° C gedurende 10 minuten.
    6. Analyseer de cDNA met behulp van een real-time PCR-systeem.
      Opmerking: Het programma voor de real-time PCR is: 95 ° C gedurende 3 min voor warme start, 95 ° C gedurende 5 s en 60 ° C gedurende 10 s voor versterking, en 95 ° C gedurende 30 s, 65 ° C gedurende 30 s en 95 ° C gedurende 30 s voor smelt. De versterking-stap wordt herhaald voor 40 cycli.
  2. Methode 2: Strand-specifieke omgekeerde transcriptie
    1. Voorbereiding van een master mix van omgekeerde inleidingen: Mix gelijke hoeveelheden van gene specifieke omgekeerde transcriptie primers met CMV promotor volgorde gevolgd door ~ 20 nucleotiden specifieke van sequenties van genen.
      Opmerking: De gecombineerde concentratie van alle gene specifieke RT primers is 4 μM.
    2. Resuspendeer RNA pellets uit stap 2.4.10 met 8,5 μl van TDW en breng de oplossing over in een PCR-buis.
    3. Voeg toe 0,5 μL van 4 μM master mix van omgekeerde transcriptie inleidingen en 4 μL van 2.5 mM dNTP mix.
    4. Warmte de oplossing bij 65 ° C gedurende 5 minuten en onmiddellijk uit te broeden op ijs voor minstens 1 min.
    5. Bereid de reactie-oplossing door het mengen van 4 μL van 5 x SSIV buffer, 1 μL van 100 mM DTT, 1 μL van RNase remmer en 1 μL van reverse-transcriptase (200 U/μl). Voeg de reactie-oplossing aan de RNA-primer mix.
    6. Incubeer de oplossing bij 50 ° C gedurende 10 minuten en 80 ° C gedurende 10 minuten.
    7. Analyseer de cDNA met behulp van de real-time PCR-systeem.
      Opmerking: Het programma voor de real-time PCR is hetzelfde als beschreven in methode 1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een schema voor het proces tot arrestatie van HeLa cellen in de S of M-fase van de celcyclus is afgebeeld in Figuur 1. Voor een monster M fase-gearresteerd kunnen we duidelijk visualiseren ronde gevormde cellen onder de Microscoop (figuur 2A). Onderzoek naar de doelmatigheid van de arrestatie van de celcyclus, kan de nucleaire inhoud van de cel worden geanalyseerd met behulp van FACS (figuur 2B). Figuur 3 toont representa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het proces om te bereiden S of M fase-gearresteerd monsters wordt geïllustreerd in Figuur 1. Om arrestatie cellen in de S-fase, gebruikten we een methode van thymidine dubbele blok waar we getrakteerd cellen met thymidine twee keer met een 9u-release tussen efficiëntie te waarborgen hoge arrestatie (figuur 1A). Voor M fase arrestatie, we getrakteerd cellen eenmaal met thymidine gevolgd door een 9u-release en vervolgens nocodazole blok cellen op prometaphase (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door fundamentele wetenschap Research Program via de nationale onderzoek Stichting van Korea (NRF) gefinancierd door de Koreaanse regering ministerie van Wetenschappen en ICT (NRF-2016R1C1B2009886).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.5 M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher ScientificAM9260G
1 M Tris, pH 7.0Thermo Fisher ScientificAM9855G
1 M Tris, pH 8.0Thermo Fisher ScientificAM9855G
1.7 mL microcentrifuge tubeAxygenMCT-175-C
10% Nonidet-p40 (NP-40)BiosolutionBN015
10X DNA loading bufferTaKaRa9157
15 mL conical tubeSPL50015
3' adaptor5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3'
3 M Sodium Acetate pH 5.5Thermo Fisher ScientificAM9740
5' adaptor5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3'
5 M NaClThermo Fisher ScientificAM9760G
50 mL conical tubeSPL50050
Acid-phenol chloroform, pH 4.5Thermo Fisher ScientificAM9722
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881Magnetic beads DNA/RNA clean up
Antarctic alkaline phosphataseNew England BiolabsM0289S
Anti-DGCR8Made in house
Anti-PKR (D7F7)Cell signaling technology12297S
Anti-PKR (Milli)Millipore EMD07-151
ATP (100 mM)GE HealthcareGE27-2056-01
Bromophenol blue sodium saltSigma-aldrichB5525
Calf intestinal alkaline phosphataseTaKaRa2250A
Cell scraper 25 cm 2-positionSarstedt83.183
CMV promoter sequence5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'
Dulbecco's modified eagle mediumWelgeneLM001-05
dNTP mixture (2.5 mM)TaKaRa4030
Ethanol, Absolute, ACS GradeAlfa-AesarA9951
Fetal bovine serumMerckM-TMS-013-BKR
FormamideMerck104008
GlycineBio-basicGB0235
GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL)Thermo Fisher ScientificAM9516
IsopropanolMerck8.18766.1000
NEBNext rRNA Depletion KitNew England BiolabsE6318rRNA Depletion Kit
NocodazoleSigma-AldrichM1404
Normal rabbit IgGCell signaling technology2729S
ParaformaldehydeSigma-Aldrich6148
PCR forward primer (RP1)5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3'
PCR index reverse primer (RPI)5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3'
PCR tubes with flat cap, 0.2 mLAxygenPCR-02-C
Phosphate bufered saline (PBS) TabletTaKaRaT9181
Phusion high-fidelity DNA polymeraseNew England BiolabsM0530High-fidelity polymerase
PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotorBenchmarkc2000
Polynucleotide kinase (PNK)TaKaRa2021A
Proteinase K, recombinant, PCR GradeSigma-Aldrich3115879001
qPCR primer sequence: CO1 HeavyForward/Reverse: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO1 LightForward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO2 HeavyForward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO2 LightForward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO3 HeavyForward/Reverse: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CO3 LightForward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CYTB HeavyForward/Reverse: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: CYTB LightForward/Reverse: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: GAPDHForward/Reverse: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND1 HeavyForward/Reverse: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND1 LightForward/Reverse: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence: ND4 HeavyForward/Reverse: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
qPCR primer sequence

Referenties

  1. Meurs, E. F., et al. Constitutive expression of human double-stranded RNA-activated p68 kinase in murine cells mediates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 and partial resistance to encephalomyocarditis virus growth. Journal of Virology. 66 (10), 5805-5814 (1992).
  2. Patel, R. C., Stanton, P., McMillan, N. M., Williams, B. R., Sen, G. C. The interferon-inducible double-stranded RNA-activated protein kinase self-associates in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (18), 8283-8287 (1995).
  3. Bennett, R. L., Pan, Y., Christian, J., Hui, T., May, W. S. The RAX/PACT-PKR stress response pathway promotes p53 sumoylation and activation, leading to G(1) arrest. Cell Cycle. 11 (1), 407-417 (2012).
  4. Yang, X., Nath, A., Opperman, M. J., Chan, C. The double-stranded RNA-dependent protein kinase differentially regulates insulin receptor substrates 1 and 2 in HepG2 cells. Molecular and Cellular Biology. 21 (19), 3449-3458 (2010).
  5. Zamanian-Daryoush, M., Mogensen, T. H., DiDonato, J. A., Williams, B. R. G. NF-kappa B Activation by Double-Stranded-RNA-Activated Protein Kinase (PKR) Is Mediated through NF-kappa B-Inducing Kinase and Ikappa B Kinase. Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1278-1290 (2000).
  6. Takada, Y., Ichikawa, H., Pataer, A., Swisher, S., Aggarwal, B. B. Genetic deletion of PKR abrogates TNF-induced activation of IkappaBalpha kinase. JNK, Akt and cell proliferation but potentiates p44/p42 MAPK and p38 MAPK activation. Oncogene. 26 (8), 1201-1212 (2007).
  7. Dabo, S., Meurs, E. F. dsRNA-dependent protein kinase PKR and its role in stress, signaling and HCV infection. Viruses. 4 (11), 2598-2635 (2012).
  8. Black, T. L., Safer, B., Hovanessian, A., Katze, M. G. The Cellular 68,000-Mr Protein-Kinase Is Highly Autophosphorylated and Activated yet Significantly Degraded during Poliovirus Infection - Implications for Translational Regulation. Journal of Virology. 63 (5), 2244-2251 (1989).
  9. Bando, Y., et al. Double-strand RNA dependent protein kinase (PKR) is involved in the extrastriatal degeneration in Parkinson's disease and Huntington's disease. Neurochemistry International. 46 (1), 11-18 (2005).
  10. Onuki, R., et al. An RNA-dependent protein kinase is involved in tunicamycin-induced apoptosis and Alzheimer's disease. The EMBO Journal. 23 (4), 959-968 (2004).
  11. Peel, A. Activation of the cell stress kinase PKR in Alzheimer's disease and human amyloid precursor protein transgenic mice. Neurobiology of Disease. 14 (1), 52-62 (2003).
  12. Peel, A. L. Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, binds preferentially to Huntington's disease (HD) transcripts and is activated in HD tissue. Human Molecular Genetics. 10 (15), 1531-1538 (2001).
  13. Suen, K. C., Yu, M. S., So, K. F., Chang, R. C., Hugon, J. Upstream signaling pathways leading to the activation of double-stranded RNA-dependent serine/threonine protein kinase in beta-amyloid peptide neurotoxicity. Journal of biological chemistry. 278 (50), 49819-49827 (2003).
  14. Nakamura, T., et al. A critical role for PKR complexes with TRBP in Immunometabolic regulation and eIF2alpha phosphorylation in obesity. Cell Reports. 11 (2), 295-307 (2015).
  15. Saito, S. Enhancement of the interferon-induced double-stranded RNA-dependent protein kinase activity by Sindbis virus infection and heat-shock stress. Microbiology and Immunology. 34 (10), 859-870 (1990).
  16. Youssef, O. A., et al. Potential role for snoRNAs in PKR activation during metabolic stress. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (16), 5023-5028 (2015).
  17. Murtha-Riel, P., Davies, M. V., Choi, S. Y., Hershey, J. W., Kaufman, R. J. Expression of a Phosphorylation-resistant Eukaryotic Initiation Factor 2 a-Subunit Mitigates Heat Shock Inhibition of Protein Synthesis. The Journal of Biological Chemistry. 268, 12946-12951 (1993).
  18. Benkirane, M., et al. Oncogenic potential of TAR RNA binding protein TRBP and its regulatory interaction with RNA-dependent protein kinase PKR. The EMBO Journal. 16 (3), 611-624 (1997).
  19. Koromilas, A., Roy, S., Barber, G., Katze, M., Sonenberg, N. Malignant transformation by a mutant of the IFN-inducible dsRNA-dependent protein kinase. Science. 257 (5077), 1685-1689 (1992).
  20. Kim, Y., et al. PKR is activated by cellular dsRNAs during mitosis and acts as a mitotic regulator. Genes & Development. 28 (12), 1310-1322 (2014).
  21. Kim, Y., et al. Deletion of human tarbp2 reveals cellular microRNA targets and cell-cycle function of TRBP. Cell Reports. 9 (3), 1061-1074 (2014).
  22. Zhu, P. J., et al. Suppression of PKR promotes network excitability and enhanced cognition by interferon-gamma-mediated disinhibition. Cell. 147 (6), 1384-1396 (2011).
  23. Dagon, Y., et al. Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, down-regulates CDC2/cyclin B1 and induces apoptosis in non-transformed but not in v-mos transformed cells. Oncogene. 20 (56), 8045-8056 (2001).
  24. Elbarbary, R. A., Li, W., Tian, B., Maquat, L. E. STAU1 binding 3' UTR IRAlus complements nuclear retention to protect cells from PKR-mediated translational shutdown. Genes & Development. 27 (13), 1495-1510 (2013).
  25. Cho, J., et al. LIN28A is a suppressor of ER-associated translation in embryonic stem cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
  26. Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
  27. Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
  28. Kim, Y., et al. PKR Senses Nuclear and Mitochondrial Signals by Interacting with Endogenous Double-Stranded RNAs. Molecular Cell. 71 (6), 1051-1063 (2018).
  29. Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
  30. Ricci, E. P., et al. Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).
  31. Kim, B., Kim, V. N. fCLIP-seq for transcriptomic footprinting of dsRNA-binding proteins: Lessons from DROSHA. Methods. , (2018).
  32. Dhir, A., et al. Mitochondrial double-stranded RNA triggers antiviral signalling in humans. Nature. 560 (7717), 238-242 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Formaldehyde crosslinkingimmunoprecipitatieHeLa cellencelcyclusarrestmitochondriale RNA sstrand specifieke qRT PCRhigh throughput sequencingRNA bindende eiwitten
Bestuderen van RNA Interactors van proteïne Kinase RNA-geactiveerd tijdens de zoogdieren celcyclus
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.