Methodenartikel

Een Model Interface menselijke Blood-Brain barrière kruisingen door ziekteverwekkers of geneesmiddelen en hun interacties met de hersenen bestuderen

DOI:

10.3791/59220

⸱

9 april 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut Pasteur, CNRS UMR 3569, Unité de Neuroimmunologie Virale, 2Institut Pasteur, Unité d’Epidémiologie et de Pathophysiologie des Virus Oncogènes, Université Sorbonne Paris Cité/Paris Diderot, 3Institut Pasteur, PFIA, DTPS

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol met een beschrijving van de instelling van een in gnudles BBB (bloed-hersenbarrière)-Minibrain polyester poreuze membraan cultuur invoegen systeem teneinde het vervoer van biomoleculen of infectieuze agentia via een menselijke BBB en hun fysiologische effect op de naburige hersencellen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De vroege screening van zenuwstelsel geneesmiddelen op een relevante en betrouwbare in gnudles BBB model voor hun penetratie en hun interactie met de barrière en de hersenen parenchym is nog steeds een unmet behoefte. Om te vullen deze kloof, ontwierpen we een 2D in gnudles model, de BBB-Minibrain, door het combineren van een polyester poreuze membraan cultuur invoegen menselijke BBB model met een Minibrain gevormd door een tri-cultuur van menselijke hersencellen (neuronen, astrocyten en microglial cellen). De BBB-Minibrain ons in staat gesteld om te testen het vervoer van een neuroprotectieve drug kandidaat (bijvoorbeeld Neurovita), via de BBB, om te bepalen van de specifieke doelgerichtheid van deze molecule tot neuronen en om te laten zien dat het neuroprotectieve eigendom van de drug werd bewaard na de drug had stak de BBB. We hebben ook aangetoond dat BBB-Minibrain een interessant model vormt voor de passage van virusdeeltjes detecteren in de endotheliale cellen barrière en het controleren van de infectie van de Minibrain door neuroinvasive virusdeeltjes. De BBB-Minibrain is een betrouwbaar systeem, makkelijk te hanteren voor onderzoeker opgeleid in cel-cultuur technologie en voorspellende van de hersenen cellen fenotypen na behandeling of belediging. De belangstelling voor dergelijke gnudles testen zou tweeledig: introductie van derisking stappen in het begin van de Geneesmiddelenontwikkeling enerzijds en vermindering van het gebruik van dierproeven aan de andere kant.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hersenen wordt gescheiden van de systemische circulatie door een niet-poreuze structuur die uitwisselingen tussen de hersenen parenchym en het bloed beperkt, de bloed - hersenbarrière (BBB) genoemd. Voornamelijk samengesteld uit cerebrale endotheliale cellen, interageert de BBB dynamisch met astrocyten, gerelateerde microglia en neuronen van de naburige hersenen parenchym. De drie belangrijkste functies van de BBB zijn het aanleggen en bijhouden van Ionische homeostase voor neuronale functies, levering van de hersenen met voedingsstoffen, en bescherming tegen toxische verwondingen of vermelding van ziekteverwekkers1,2, die bijdragen tot het onderhoud van de hersenen homeostase en haar functies3. Deze barrière is zo efficiënt dat slechts enkele geneesmiddelen de BBB4,5 kruisen kunnen. Op dit moment bestaan de beschikbare methoden om te voorspellen of een molecuul zal de BBB passeren en diffuus in de hersenen uit ex vivo studies over autopsie materiaal, afbeelding bijhouden in de hersenen van menselijke vrijwilligers door MRI (magnetic resonance imaging) of huisdier (positie emissie tomografie) of farmacodynamica en farmacokinetische Preklinische studies in dieren6,7,8. Deze technieken en modellen hebben enkele beperkingen, zoals de beperkte resolutie van PET en de lage gevoeligheid van MRI6,8, de moeilijkheid om het kwantificeren van moleculen (dat wil zeggen, gebaseerd antilichamenmolecules bijvoorbeeld) dat slecht de hersenen7doordringen, en voor de preklinische studies hun hoge kosten en resort van dierproeven.

Het laatste punt is belangrijk omdat, volgens de 3R's regels, (vervanging, vermindering en verfijning van dierproeven) de regelgevende instanties hebben gevraagd dat de onderzoekers dringend wetenschappelijk accuraat alternatief voor dier ontwikkelen experimenten9,10,11,12,13,14,15.

In de afgelopen decennia verschillende in-vitro modellen van BBB heeft voorgesteld16,17,18 cultiveren op filter membraan voegt endotheliale cellen van verschillende soorten zoals muis, rat, runderen en varkens. Wat betreft de menselijke soort is, de beschikbaarheid van het schaars en moeilijk van primaire cellen gevraagd de onderzoekers te ontwikkelen van menselijke modellen op basis van vereeuwigd hersenen endotheliale cellen of cellen van de stam van de mens-afgeleide19,20, 21. Deze belemmeringen zijn goede in-vitro surrogaten van BBB mits ze express endothelial cel markeringen, strakke junction markeringen, efflux vervoerders, opgeloste vervoerders, receptoren, en te reageren op het endotheel stimuli 20. Een paar BBB modellen met behulp van de filter membraan inzetstukken bekleed met endotheliale cellen en andere celtypen (dat wil zeggen, astrocyten, neuronen of pericytes22,23,24) werden bepaald. Het doel van deze mede culturen was te verhogen van de fysieke kenmerken van BBB door te profiteren van de secretie van oplosbare factoren door astrocyten/neuronen of pericytes.

Echter omvat geen van deze modellen hersenen parenchym om te studeren en voorspellen van het lot van een drug-kandidaat, zodra het de barrière is verstreken. Daarom, ons doel was om het bouwen van een in gnudles bloed/hersenen interface, de BBB-Minibrain, door het combineren van een BBB-model en een cultuur van gemengde hersencellen in een enkele kit. De BBB-Minibrain maakt gebruik van een cultuur-systeem dat bestaat uit een poreuze filter ingevoegd in een put van een multiwell cel cultuur plaat. Het filter is bekleed met cellen van de hCMEC/D3, een menselijk brein endothelial cellijn, die heeft bewezen zeer betrouwbaar voor BBB drugstests25,26,27, om te vormen van de BBB. De Minibrain, die een co gedifferentieerde cultuur van menselijke neuronen en astrocyten afgeleid van de NTera/Cl2.D1 cel lijn28,29 gemengd samen met de menselijke microglial cellijn CHME/Cl530 in verhouding overeenkomt met de Microglia vs. neuron-astrocyten ratio's van de hersenen31, wordt gekweekt in de bodem van de plaat goed.

Naast het bestuderen van passage van drugs over de BBB en hun lot in de parenchym, zou de blood-brain-interface in gnudles model een krachtig hulpmiddel om de vermelding van ziekteverwekkers in de hersenen (neuroinvasiveness), de spreiding in de hersenen (neurotropisme) en de toxiciteit (neurovirulence) zij op parenchym hersencellen uitoefenen kunnen. Neurovirulence en neuroinvasiveness studies zou profiteren van de ontwikkeling van een efficiënt in gnudles model en nuttig zijn, ter vervanging van diermodellen. Met behulp van de BBB-Minibrain kit32, wij laten zien dat het fenotype van de neuroinvasive van zeldzame virale mutanten die verzameld in de Franse neurotrope virusstam van gele koorts-Virus (dat wil zeggen, FNV-YFV33,34) gebruikt om te bereiden een levend YFV vaccin en de passage van een neuroregenerative en neuroprotectieve Biomolecuul genaamd Neurovita (aangeduid als NV voortaan in het manuscript)35stopgezet. Omdat NV noch natuurlijk kruist de celmembraan noch de BBB, NV werd gefuseerd met het variabele gedeelte (VHH) van een één keten antilichamen van Lama die kruist de biologische membranen met inbegrip van de BBB en fungeert als een cel penetrerende molecuul (CPM)36. De eigenschap CPM van VHH lijkt te zijn afhankelijk van het elektrisch punt en de lengte van de VHH37.

Dit in gnudles test moet het mogelijk maken te sorteren van de moleculen die potentieel van de BBB vóór het uitvoeren van de farmacokinetische en farmacodynamica analyse in dieren, en idealiter in de zelfde tijd oversteken kon te kunnen voorspellen hun gedrag in het zenuwstelsel Parenchym. Dit systeem is biologisch relevant en vlot voor troep opwaarts en verwerken door professionals die goed getraind in cel cultuur26,29,30,38. De belangstelling voor dergelijke gnudles testen zou tweeledig: vermindering van de kosten van preklinische proeven aan de ene kant en het verminderen van het gebruik van dierproeven aan de andere kant.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. cel cultuur werk van Ntera/CL2. D1 te bereiden een co cultuur van post mitotische hNeurons en hAstrocytes (NT2-n/b)

Opmerking: Dit is het onderdeel van het Minibrain (Figuur 1).

  1. Kweken van de Ntera/Cl2.D1
    1. Een flesje van bevroren cellen Verwijder uit vloeibare stikstof tank. Houd op ijs.
    2. Ontdooi de cellen snel in een waterbad 37 ° C.
    3. Overdracht van de cellen in een tube van 15 mL met 10 mL van volledige DMEM F12 medium (Dulbecco van bewerkt Eagle Medium: nutriënt mengsel F-12 medium) aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 2 mM glutamine, 100 IU penicilline en streptomycine van 100 µg (dat wil zeggen, compleet DMEM F12 medium).
    4. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). De pellet in 2 mL van volledige DMEM F12 medium distantiëren.
    5. Breng in een maatkolf van T75 weefselkweek in polystyreen met een specifieke behandeling van gevoelig aanhangend cellen (T75Cell+) met 13 mL van volledige DMEM F12 medium.
    6. Cellen in een incubator gehandhaafd bij 37 ° C, 5% CO2 en luchtvochtigheid van 95% tot 90% samenvloeiing cultuur (dat wil zeggen, ongeveer 5 dagen). Gemiddeld elke 2-3 dagen wijzigen.
  2. Subcultivering de Ntera/Cl2.D1 en de versterking
    1. Verwijder het medium van de kolf.
    2. Spoel de cel enkelgelaagde met 10 mL fosfaat buffer zoutoplossing (PBS) aangevuld met Ca2 + en Mg2 +.
    3. Spoel de cel enkelgelaagde met 10 mL EDTA-oplossing (gehouden op RT).
    4. Voeg 3 mL trypsine-EDTA-oplossing (0.05% trypsine, 0,02% EDTA) en incubeer 2 min op RT.
    5. Schud de kolf en zorg ervoor dat de cellen worden losgekoppeld van het plastic oppervlak.
    6. Voeg 10 mL van de volledige DMEM F12 middellange tot inactivering van de trypsine, transfer in een tube van 15 mL en Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 x g bij RT.
    7. Distantiëren van de pellet met 10 mL van volledige medium en 1 mL om te enten van elke nieuwe kolf met 14 mL van volledige DMEM F12 medium gebruiken.
      Opmerking: Dertig T75 cel+ kolven zijn vereist voor elke differentiatie.
    8. Incubeer de kolven op 37 ° C, 5% CO2 en luchtvochtigheid van 95% tot 90% samenvloeiing.
  3. Differentiatie van NTera/Cl2.D1 in menselijke neuron-Astrocyt co cultuur
    Opmerking: Dit is de belangrijkste component van de Minibrain.
    1. Op dag 0, distantiëren van de cellen met trypsine-EDTA zoals beschreven in stap 1,2 en distantiëren van de pellet van de cel van elke kolf met 2 mL van volledige DMEM F12 medium.
    2. Voeg 1 mL van de celsuspensie (overeenkomend met 5 x 106 cellen) in 60 plastic petrischaaltjes met 85 mm diameter met 11 mL van volledige DMEM F12 medium.
      Opmerking: De cellen niet zal hechten aan de plastic en zal verzamelen aan formulier pseudo neurospheres (zie foto in het onderste deelvenster van Figuur 1). Incubeer de 60 petrischalen bij 37 ° C, 5% CO2 en 95% vochtigheid gedurende één dag.
    3. Op dag 1, voeg 1 mL van volledige DMEM F12 medium aangevuld met 130 µM van all-Trans-retinoïnezuur (ATRA) per petrischaal (eindconcentratie ATRA 10 µM) en de gerechten bij 37 ° C, 5% CO2 en 95% vochtigheid gedurende 24 uur terug te keren.
    4. Op dag 2, overdracht zeer zorgvuldig het medium met cel gebied van elke Petri Dish in een tube 50 mL en Centrifugeer gedurende 10 min bij 50 x g en RT. Dissociate zorgvuldig de losse pellet met 13 mL van volledige DMEM F12 medium aangevuld met 10 µM ATRA en voegt toe de th e 13 mL in een nieuwe 85 mm diameter petrischaal.
      Opmerking: Over de verschillende passages is het uiterst belangrijk om de bollen dichtheid zo hoog als de dichtheid verkregen op dag 2 (dat wil zeggen, rond een dichtheid van 70%). Daarom, als de dichtheid van de bol is verlagen, verminderen de totale aantal petrischalen volgens het aantal cellen.
    5. Herhaal de bovenstaande procedure (stap 1.3.4) op dag 4, 6 en 8.
    6. Op dag 10, herhaal de bovenstaande procedure, maar de bollen aan de kolven T75 cel+ in plaats van petrischalen toevoegen. De cellen van een petrischaal toevoegen over in een maatkolf van T75 cel+ .
    7. Wijzigen op dagen 11, 13, 15 en 17, het gebruikte medium met 14 mL van volledige DMEM F12 aangevuld met 10 µM ATRA.
    8. Op dag 19, veranderen medium met 14 mL van volledige DMEM F12 medium zonder ATRA per kolf.
    9. Dag 20, distantiëren zachtjes de cellen met trypsine/EDTA als volgt.
      1. Voor iedere kolf T75 cel+ , spoel de cellen met 10 mL PBS aangevuld met Ca2 + en Mg2 +; Incubeer de cellen met 4 mL EDTA voor 5 min op RT.
      2. Verwijder zorgvuldig de EDTA en voeg toe 2 mL trypsine-EDTA en incubeer 7 min op RT. Shake heel voorzichtig de kolf en voeg voorzichtig 8 mL van volledige DMEM F12 medium.
      3. Centrifuge 10 min op 160 x g en RT. distantiëren de cel pellet in 13 mL van volledige DMEM F12 medium en overbrengen in een maatkolf van T75 cel+ .
        Opmerking: De zeer zachte dissociatie met trypsine-EDTA kunnen herstellen van de ATRA gedifferentieerde cellen uit de oorspronkelijke cellen van de teratocarcinoma, die sterk op de plastic consumptieaardappelen zijn aangesloten.
    10. Op dag 21, door het medium en de dode cellen te verwijderen. Voeg 14 mL van volledige DMEM F12 medium aangevuld met 5% FBS, 2 mM glutamine, 100 IU penicilline, 100 µg streptomycine en 0,5 µM van AraC (Cytosine β-D-arabinofuranoside) (5% voltooien FBS DMEM F12-AraC).
    11. Op de dagen 23, 25 en 28, vervangen gebruikt medium met 14 mL 5% FBS DMEM F12-AraC.
    12. Op dagen 29 tot 49 (om de twee dagen), vervangen gebruikt medium met 14 mL van volledige DMEM F12 medium aangevuld met 5% foetale runderserum, 2 mM glutamine, 100 IU penicilline, 100 µg streptomycine, 5 µM van FudR (5-fluoro-2' deoxyuridine) en 10 µM Urd (Uridine) (volledige 5% FBS DMEM F12-FudR-Urd).
    13. Op dag 50, vervangen gebruikt medium met 14 mL van volledige DMEM F12 medium aangevuld met 5% FBS, 2 mM glutamine, 100 IU penicilline, 100 µg streptomycine en 10 µM Urd (5% voltooien FBS DMEM F12-Urd).
    14. Op dagen 51 tot 95 (tweemaal per week), vervangen gebruikt medium met 14 mL compleet 5% FBS DMEM F12-Urd.
      Opmerking: Cellen kunnen worden gebruikt voor experimenten vanaf dag 51, maar niet later dan dag 95. Het gebruik van seriële behandelingen met mitose remmers kunt herstellen van pure bevolking van co cultuur van post mitotische hNeuron en hAstrocytes (NT2-n/b).
    15. Om het zaad van de cellen, gaat u verder met zachte trypsinebehandeling zoals beschreven voor dag 20.

2. cel cultuur werk van menselijke microglial cellen CHME/Cl5

Nota: Dit is het onderdeel van de microglial van de Minibrain (figuur 1).

  1. Kweken van de menselijke microglial cellen CHME/Cl5
    1. Een flesje van bevroren cellen verwijderen uit de vloeibare stikstof tank. Houd op ijs.
    2. Ontdooien snel in een waterbad 37 ° C.
    3. Overdracht van de cellen in een tube van 15 mL met 10 mL van volledige DMEM F12 medium aangevuld met 5% foetale runderserum, 2 mM glutamine, 100 IU penicilline en 100 µg streptomycine (dat wil zeggen, volledige 5% FBS DMEM F12 medium).
    4. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min op RT. Dissociate de pellet met 2 mL van volledige 5% FBS DMEM F12 medium.
    5. Breng in een maatkolf van de T75 cel+ met 13 mL van volledige 5% FBS DMEM F12 medium.
    6. De cellen van de cultuur bij 37 ° C, 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid tot 90% samenvloeiing. Gemiddeld elke 2-3 dagen wijzigen.
  2. Subcultivering van de menselijke microglial cellen CHME/Cl5
    1. Medium verwijderen uit de kolf.
    2. Spoel de cel enkelgelaagde met 10 mL PBS aangevuld met Ca2 + en Mg2 +.
    3. Spoel de cel enkelgelaagde met 10 mL EDTA-oplossing (gehouden op RT).
    4. Voeg 3 mL trypsine-EDTA-oplossing en incubeer 2 min op RT.
    5. Schud de kolf en zorg ervoor dat de cellen worden losgekoppeld van het plastic oppervlak.
    6. Voeg 10 mL van de volledige 5% FBS DMEM F12 middellange tot inactivering van de trypsine, transfer in een tube van 15 mL en Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 x g en RT.
    7. Distantiëren van de pellet met 10 mL van volledige medium en 1 mL om te enten van elke nieuwe kolf met 14 mL van volledige 5% FBS DMEM F12 medium gebruiken.
    8. Incubeer de kolven op 37 ° C, 5% CO2 en luchtvochtigheid van 95% tot 90% samenvloeiing.

3. cultuur werk met de hCMEC/D3 jas poreuze inzetstukken en voorbereiden van BBB

  1. Kweken van de menselijke endotheliale cellen hCMEC/D3 (Figuur 2)
    1. Verdun het type I collageen rat tot en met 1:30 met zuivere steriel water (rang van de cultuur van de cel).
    2. Pipetteer 10 mL in een maatkolf van T75 cel+ en 2 h in een 37 ° C en 5% CO2 , 95% vochtigheid incubator uit te broeden.
    3. De collageen-oplossing verwijderen en vervangen door 15 mL endothelial cel voedingsbodem aangevuld met 10 mM van HEPES (bedoeld als volledige endothelial cel medium).
    4. Verwijder een cryo Injectieflacon van cellen uit de vloeibare stikstof tank. Houd op ijs.
      Opmerking: De cellen werden geteeld en veel zaad werd gemaakt als beschreven door de fabrikant. De cellenvariëteit wordt gedekt door een biologische materiële overdracht akkoord. De cellen worden verkregen op passage nummer 25 en dient niet verder dan 35 passage.
    5. Ontdooien snel in een waterbad 37 ° C.
    6. Overdracht van de cellen in de kolf T75 cel+ en terug te keren van de kolf bij 37 ° C, 5% CO2 en 95% vochtigheid gedurende 2 tot 4 uur.
    7. Verwijder het medium zorgvuldig zonder het verwijderen van cellen of verloren gaan. Spoel de cellen eenmaal met 10 mL van volledige endothelial cel medium.
    8. Voeg toe 15 mL van volledige endothelial cel medium.
    9. De cellen van de cultuur bij 37 ° C, 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid tot 100% samenvloeiing (niet minder dan 4 dagen) zonder de medium.
  2. Subcultivering de hCMEC/D3 om voor te bereiden van het tussenvoegsel van de BBB
    1. Een nieuwe T75 cel+ kolf jas of wordt ingevoegd met het type ik Rat collageen zoals hierboven (stap 3.1) beschreven.
    2. Verwijder het medium van de kolf. Spoel de cel enkelgelaagde met 10 mL PBS aangevuld met Ca2 + en Mg2 +.
    3. Voeg 2 mL trypsine-EDTA-oplossing toe en incubeer 5 minuten bij 37 ° C.
    4. Schud de kolf en ervoor te zorgen dat de cellen volledig los van het plastic oppervlak zijn.
    5. Voeg 4 mL volledige endothelial cel middellange tot de inactivering van de trypsine.
    6. Met een 5 mL plastic pipet, mechanisch distantiëren de cellen door zuigen en spoelen van de celsuspensie terwijl het handhaven van de 5 mL-pipet naar de onderkant van de kolf minstens 5 keer.
    7. Cellen tellen en gebruik 5 x 10,4 cellen/invoegen voor een cultuur van 12 goed polyester membraan voegt invoegen en 2 x 106 cellen voor een kolf T75 cel+ . Ook drie filters zonder cellen voor de PELy (dat wil zeggen, endotheliale cellen doorlatend zijn voor Lucifer geel zie hieronder paragraaf 4.2) experimenten met de Polyester membraan cultuur inzetstukken voor te bereiden.
    8. Incubeer de kolven of inzetstukken bij 37 ° C, 5% CO2 en luchtvochtigheid van 95% tot 100% samenvloeiing.
    9. Wijzig het medium voor T75 cel+ kolf niet tot een nieuwe passage. Integendeel voor BBB op polyester membraan cultuur wordt ingevoegd: medium op dagen 2 en 4 wijzigen, gebruik de BBB voor experimenten op dag 6.

4. bouw en kwaliteitscontrole van de BBB-Minibrain (figuur 2)

  1. Opzetten van een BBB-Minibrain Polyester membraan cultuur sluit apparaat (figuur 2B)
    1. De cellen van de hCMEC/D3 op 12 goed Polyester groeien membraan cultuur invoegen filters voor 6 dagen op de drager van de endothelial cel alvorens ze te gebruiken voor het experiment.
    2. Jas een 12 goed bord met poly-D-lysine (1 mL/putje, 10 µg/mL, 4 h bij RT) en vervolgens laminin (1 mL/putje, 1 µg/mL, 's nachts op RT).
    3. Verwijderen van laminin en voeg vervolgens 1 mL van endothelial cel medium aangevuld met 5% FBS (gemiddeld 5% endothelial cel).
    4. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C, 5% CO2 en 95% vochtigheid.
    5. Zachtjes trypsinize de NT2-n/b (zoals beschreven in stap 1.3.9) en CHME/Cl5 (zoals beschreven in stap 2.2) en distantiëren van de cel pellets met volledige endothelial cel medium.
    6. Tellen de cellen, Meng 3.6 x 105 NT2-N/A en 0,4 x 105 CHME/Cl5 cellen per putje en zaad de 12 goed plaat.
    7. Bij T = 24 h (24u na het zaaien): het gebruikte medium met verse volledige endothelial cel medium (Minibrain cellen en endotheliale cellen) wijzigen en breng de hCMEC/D3 Polyester cultuur invoegen membraanfilter op de bovenkant van de Minibrain cellen. Incubeer de BBB-Minibrain bij 37 ° C, 5% CO2 en 95% vochtigheid.
      Opmerking: De BBB-Minibrain zal dan bestaan uit een laag van menselijke endotheliale cellen hCMEC/D3 op filter isoleren de luminal compartiment (of "blood" compartiment) en van een gemengde cultuur van menselijke cellen hNT2: n: /-b en hCHME/Cl5 (Minibrain) aan de onderkant van de goed definiëren de abluminal compartiment (of "brein" compartiment) (figuur 2B).
  2. Validatie van het endotheel permeabiliteit van de BBB-Minibrain (kwaliteitscontrole) (figuur 2C)
    1. Bereiden de vervoer-buffer (TB), oftewel HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) buffer met de Ca2 + en Mg2 + aangevuld met 10 mM HEPES en 1 mM natrium pyruvaat.
    2. Bereiden 12 goed platen met 1,5 mL vervoer buffer per putje.
    3. Op T = 0, maken vers vervoer buffer aangevuld met 50 µM Lucifer geel (LY-TB).
    4. Omkeren van elk filter om ondersteboven te verwijderen zorgvuldig het medium zonder de endothelial cel barrière.
    5. Plaats van het filter op de gevulde 12 goed plaat en Voeg 0,5 mL van LY-TB.
    6. Incubeer de platen in een incubator bij 37° C, 5% CO2 en 95% vochtigheid.
    7. Op T = 10 min overdracht de filters op nieuwe TB gevuld 12 goed platen en houdt het compartiment van de abluminal van de eerste plaat voor OD lezing.
    8. Herhaal de stap 4.2.7 op T = 25 min.
    9. T = 45 min, stoppen met het vervoer door het verwijderen van de filters aan de platen. Abluminal en luminal vakken voor OD maatregelen houden.
    10. Overdracht in een donkere 96 platen goed de monsters: 10 µL met 190 µL TB voor de LY-TB en de luminal afdelingen, 200 µL van het monster voor de abluminal compartimenten.
    11. Meten van de fluorescentie van de LY-TB aanwezig in de verschillende monsters op λ428 nm λ535 nm (excitatie en emissie lengte golven respectievelijk).
    12. Bereken de endothelial permeabiliteit (Pe) richting LY-TB (PeLY) volgens Siflinger-Birnboim, A et al. (1987)39 en Da Costa, A et al. (2018)34 met behulp van de formule:
      1/PSe = (1/PSt)-(1/PSV) en PeLY= PSe/S.
      Opmerking: PSV is de permeabiliteit van het filter zonder cellen, PSt is de permeabiliteit van het filter met cellen, PSe is de permeabiliteit van het endotheel enkelgelaagde tijd het oppervlak van de enkelgelaagde, S het oppervlak van de enkelgelaagde is (voor een 12 goed filter = 1.12 cm2 ), PeLY wordt uitgedrukt in cm/min. Voor hCMEC/D3 de PeLY tussen 0,7 en 1.2 x 10 moet-3 cm/min afhankelijk van voornamelijk uit de FBS gebruikt in de experimenten. Belangrijk: een PeLY hoger dan 1.2 betekent dat de BBB niet strak genoeg is en sommige lekkage kan worden waargenomen. Gooi deze belemmeringen.

5. gebruik van BBB-Minibrain om te wijzen op de aanwezigheid van neuro-invasieve virale deeltjes in een gele koorts Virus vaccin steekproef, het Frans neurotrope virus, YFV-FNV 34 (figuur 3)

  1. BBB overtocht en de vermenigvuldiging van gele koorts virussen in de Minibrain
    1. Gebruik de BBB-Minibrain voorbereid zoals beschreven in stap 4.1.7 24 h vóór de toevoeging van het virus; Vervang het medium door 2% FBS endothelial cel medium.
      Opmerking: Het is uiterst belangrijk te voorkomen dat het veranderen van het medium net voor het toevoegen van het virus. Wijzigen van het medium kan de menselijke endotheliale cellen worden geactiveerd en Transient openen de barrière waarmee de passage van het virus. Hier wordt het medium 24u gewijzigd voordat het experiment.
    2. Op T = 0, voeg 3500 Plaque vormen eenheden (PFU) van YFV-FNV verdund in 50 µL van 2% FBS endothelial cel middellange zeer zorgvuldig op de bovenkant van het luminal compartiment. Het besturingselement BBB-Minibrain is geënt met 50 µL van 2% FBS endothelial cel medium zonder virus. Bepaalt ook PeLY op metgezel.
    3. Incubeer de BBB-Minibrain in een incubator bij 37 ° C, 5% CO2 en 95% vochtigheid.
    4. Na 24 h, het polyester membraan cultuur inzetstukken filter apparaat verwijderen en bepalen PeLY, monster 1 mL van de abluminal-compartiment en titreer de virus zoals beschreven door A. da Costa et al. (2018)34. Vervang het medium met vers 2% FBS endothelial cel medium.
    5. Incubeer de BBB-Minibrain bij 37 ° C, 5% CO2 en 95% vochtigheid.
    6. Na 72 uur genieten van het medium van de abluminal-compartiment en titreer van het virus, en/of RNA uittreksel uit de Minibrain cellen p.a. gen expressie zoals beschreven door A. da Costa et al. (2018)34.
  2. Versterking van neurotrope varianten van YFV-FNV op Minibrain cellen door achtereenvolgende passages
    1. Gebruik Minibrain cellen bedekt 12 goed platen (dat wil zeggen, de stappen 4.1.6 en 4.1.7).
    2. Op moment toevoegen 0 h, wijs 3.500 Plaque vormen eenheden van YFV-FNV verdund in 50 µL van 2% FBS endothelial cel medium zeer zorgvuldig op de bovenkant van de cellen (luminal compartiment).
    3. Na 1 h, verwijder het medium met het virus entmateriaal en vervang met vers 2% FBS endothelial cel medium.
    4. Na 48u, proef 500 µL van het kweekmedium en verse Minibrain cellen infecteren
    5. Na 120 h, proef 500 µL van het kweekmedium en verse Minibrain cellen infecteren.
    6. Na 192 h, sla kweekmedium (= virus voorraad verrijkt) en de RNA uittreksel uit de Minibrain cellen p.a. gen expressie zoals beschreven door A. da Costa et al. (2018)34.

6. gebruik van BBB-Minibrain te bestuderen BBB kruising en hersenen cel targeting van een Biomolecuul

  1. Via de BBB van een neuron targeting Biomolecuul
    1. Gebruik de Minibrain-BBB bereid als beschreven stap 4.1.7.
    2. Op het tijdstip 0 h, voeg de Biomolecuul (In het voorbeeld voorwaarde in de sectie resultaat 58.75 ng/BBB van de cel permeant NeuroTag-NV moleculen werden toegevoegd per BBB-Minibrain invoegen.
    3. Incubeer de BBB-Minibrain bij 37 ° C, 5% CO2 en 95% vochtigheid.
    4. Na 24 h, het polyester membraan cultuur inzetstukken filter apparaat verwijderen en bepalen PeLY, dan vlekken van de cellen van de Minibrain voor hNeurons neurofilament Nf200 en detecteren van de aanwezigheid van de Biomolecuul in de Minibrain (In het voorbeeld in het resultaat sectie NeuroTag-NV werd ontdekt met behulp van een antilichaam gericht tegen de Strep-Tag bevat35,40).
  2. Vervoer over de BBB van een neuroregenerative Biomolecuul en latere neuroprotectieve assay in de Minibrain nadat de Biomolecuul de BBB heeft gekruist
    1. Gebruik de Minibrain-BBB voorbereid zoals beschreven in stap 4.1.7.
      Opmerking: Voor moleculen neuronen alleen targeting, Minibrain cellen kunnen worden vervangen door de neuronen cellen (NT2-N) enige38.
    2. Op tijdstip 0 h, voeg ng/BBB-Minibrain van de 58.75 goed van de cel permeant NV moleculen (actieve formulier CPM-NeuroTag-NV, niet-actieve vorm CPM-NeuroTag-NVΔ) beschreven door C. Prehaud et al. (2014)35.
    3. Incubeer de BBB-Minibrain in een incubator bij 37 ° C, 5% CO2 en 95% vochtigheid.
    4. Na 4 uur, afzonderlijke wonden te maken met een naald injectie (26GX1/2 ", 12-4.5, Terumo, België) op de Minibrain cellen. Maak ten minste 10 krassen op elk individu goed. Bepaalt ook PeLY op de metgezel.
    5. Incubeer de BBB-Minibrain in een incubator bij 37 ° C, 5% CO2 en 95% vochtigheid.
    6. Na 8u, vervangt het medium in het compartiment van de abluminal door verse volledige endothelial cel medium.
      Opmerking: Het is belangrijk ter vervanging van het medium bij deze stap, aangezien de verwonding van de Minibrain cellen tot de dood van de cel en vervolgens de release van cytotoxische stoffen leiden kan.
    7. Incubeer de BBB-Minibrain in een incubator bij 37 ° C, 5% CO2 en 95% vochtigheid.
    8. Na 48u, gekleurd de cellen voor axon regeneratie van hNeurons zoals beschreven door C. Prehaud et al. (2013)40.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De BBB-Minibrain is een in gnudles experimentele model van blood-brain-interface.

De BBB-Minibrain is ingesteld op het systeem van polyester membraan cultuur invoegen na te bootsen een compartiment bloed op de bovenverdieping en een compartiment van de hersenen op het lagere niveau van de blood-brain-interface (figuur 2AB). Het bestaat uit een luminal compartiment m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit artikel we laten zien hoe het bouwen van een in gnudles bloed/hersenen interface, de BBB-Minibrain, door het combineren van een BBB-model en een cultuur van gemengd hersenen cerebrale cellen (Minibrain) in een enkele kit. Dit systeem is biologisch relevant, eenvoudig te installeren en te verwerken voor onderzoekers goed getraind in celkweek.

Zoals voor elke andere in vitro model van BBB, kunnen betrouwbare resultaten worden verkregen als drastische controle van de luchtdichtheid van de ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het intellectuele eigendom van het systeem was de octrooien waarnaar wordt verwezen in 32, 35 en 38.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door interne subsidies uit Institut Pasteur met inbegrip van een Incitative subsidie (PTR-435) en een subsidie "Contrat de Soutien à la Recherche" geboden door Sanofi Pasteur aan het Institut Pasteur. A. da Costa werd gesteund door de Sanofi Pasteur grant en Florian Bakoa is de ontvanger van een subsidie van de PhD geboden door de ANRT (Association Nationale de la Recherche et de la Technologie). We zijn dank verschuldigd aan Pr Pierre-Olivier Couraud en Dr Florence Miller voor nuttige discussies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
12 well platesCorning3336
5-fluoro-2’deoxyuridineMerck-Sigma AldrichF0503
85mm Petri DishSarstedt83-3902-500
Anti-Nf200Merck-Sigma AldrichN4142
ß-mercapto-ethanolMerck-Sigma AldrichM3148
CHME/Cl5Unité de Neuroimmunologie ViraleOp aanvraag bij Dr Lafon
CMCCalbiochem217274
Cytosine ß-D-arabinofuranosideMerck-Sigma AldrichC1768
Dark 96 well platesCorning3915
DMEM F12Thermofisher Scientific31330-038
DMSOMerck-Sigma AldrichD2650
Endogro IVMilliporeSCME004endotheelcelmedium
EthanolCarlo Erba529121
FBSHycloneSV30015-04
FormaldehydeMerck-Sigma Aldrich252549
GIEMSARAL Diagnostic320310
Goat-Anti MouseJackson Immuno Research115-545-003
Goat-Anti RabbitThermofisher ScientificR37117
HBSS with Ca2+-Mg2+Thermofisher Scientific14025-100
hCMEC/D3CedarlaneCLU512
Hepes 1MThermofisher Scientific15630-070
Hoescht 33342Merck-Sigma Aldrich33263
LaminineMerck-Sigma AldrichL6274
L-glutamineThermofisher Scientific25030-024
Lucifer YellowMerck-Sigma AldrichL0259
MEM 10XThermofisher Scientific21430
MEM 1XThermofisher Scientific42360
Ntera/Cl2D.1ATCCCRL-1973
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15714
PBS without Ca2+-Mg2+Thermofisher Scientific14190
PBS-Ca2+-Mg2+Thermofisher Scientific14040-091
Pen/StrepEurobioCXXPES00-07
Poly-d-LysineMerck-Sigma AldrichP1149
Prolong GoldThermofisher ScientificP36930
Qia shredderQIAGEN79656
Rat Collagen ICultrex3443-100-01
Retinoic Acid All-TransMerck-Sigma AldrichR2625
RNA purification kitQIAGEN74104
SDSMerck-Sigma AldrichL4509
Sodium bicarbonate 5.6%EurobioCXXBIC00-07
Sodium PyruvateThermofisher Scientific11360
T75 Cell+ FlaskSarstedt83-1813-302Weefselkweekpolystyreenfles met specifieke oppervlaktebehandeling (Cell+) voor gevoelige adherente cellen
TranswellCorning3460polyester poreuze membraancultuurinserts
Trypsin-EDTAMerck-Sigma AldrichT3924
Ultra Pure WaterThermofisher Scientific10977-035
UridineMerck-Sigma AldrichU3750
VerseneThermofisher Scientific15040-033EDTA
YFV-FNVIP DakarVaccinflesje

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  2. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  3. Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
  4. Bicker, J., Alves, G., Fortuna, A., Falcao, A. Blood-brain barrier models and their relevance for a successful development of CNS drug delivery systems: a review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87 (3), 409-432 (2014).
  5. Banks, W. A. From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (4), 275-292 (2016).
  6. Montagne, A., et al. Brain imaging of neurovascular dysfunction in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 131 (5), 687-707 (2016).
  7. Stanimirovic, D., Kemmerich, K., Haqqani, A. S., Farrington, G. K. Engineering and pharmacology of blood-brain barrier-permeable bispecific antibodies. Advances in Pharmacology. 71, 301-335 (2014).
  8. Albrecht, D. S., Granziera, C., Hooker, J. M., Loggia, M. L. In Vivo Imaging of Human Neuroinflammation. ACS Chemical Neuroscience. 7 (4), 470-483 (2016).
  9. Caloni, F., et al. Alternative methods: 3Rs, research and regulatory aspects. ALTEX. 30 (3), 378-380 (2013).
  10. Whittall, H. Information on the 3Rs in animal research publications is crucial. The American Journal of Bioethics. 9 (12), 60-61 (2009).
  11. Sneddon, L. U. Pain in laboratory animals: A possible confounding factor. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (3), 161-164 (2017).
  12. Sneddon, L. U., Halsey, L. G., Bury, N. R. Considering aspects of the 3Rs principles within experimental animal biology. The Journal of Experimental Biology. 220, 3007-3016 (2017).
  13. Wells, D. J. Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research. Annals of the New York Academy of Sciences. 1245, 14-16 (2011).
  14. Daneshian, M., et al. A framework program for the teaching of alternative methods (replacement, reduction, refinement) to animal experimentation. ALTEX. 28 (4), 341-352 (2011).
  15. Niemi, S. M., Davies, G. F. Animal Research, the 3Rs, and the "Internet of Things": Opportunities and Oversight in International Pharmaceutical Development. ILAR Journal. 57 (2), 246-253 (2016).
  16. Modarres, H. P., et al. In vitro models and systems for evaluating the dynamics of drug delivery to the healthy and diseased brain. Journal of Controlled Release. 273, 108-130 (2018).
  17. Jamieson, J. J., Searson, P. C., Gerecht, S. Engineering the human blood-brain barrier in vitro. Journal of Biological Engineering. 11, 37(2017).
  18. Kaisar, M. A., et al. New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).
  19. Aday, S., Cecchelli, R., Hallier-Vanuxeem, D., Dehouck, M. P., Ferreira, L. Stem Cell-Based Human Blood-Brain Barrier Models for Drug Discovery and Delivery. Trends in Biotechnology. 34 (5), 382-393 (2016).
  20. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  21. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
  22. Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochemistry International. 54 (3-4), 253-263 (2009).
  23. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. Journal of Neuroscience Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
  24. Nakagawa, S., et al. Pericytes from brain microvessels strengthen the barrier integrity in primary cultures of rat brain endothelial cells. Cellular and Molecular Neurobiology. 27 (6), 687-694 (2007).
  25. Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).
  26. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16(2013).
  27. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  28. Andrews, P. W. Retinoic acid induces neuronal differentiation of a cloned human embryonal carcinoma cell line in vitro. Developmental Biology. 103 (2), 285-293 (1984).
  29. Lafon, M., et al. Modulation of HLA-G expression in human neural cells after neurotropic viral infections. Journal of Virology. 79 (24), 15226-15237 (2005).
  30. Janabi, N., Peudenier, S., Heron, B., Ng, K. H., Tardieu, M. Establishment of human microglial cell lines after transfection of primary cultures of embryonic microglial cells with the SV40 large T antigen. Neuroscience Letters. 195 (2), 105-108 (1995).
  31. von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
  32. Prehaud, C., Lafon, M., Ceccaldi, P. E., Afonso, P., Lafaye, P. New in vitro Blood-Brain Barrier model. PCT. EP2015, 0706671(2014).
  33. Holbrook, M. R., Li, L., Suderman, M. T., Wang, H., Barrett, A. D. The French neurotropic vaccine strain of yellow fever virus accumulates mutations slowly during passage in cell culture. Virus Research. 69 (1), 31-39 (2000).
  34. da Costa, A., et al. Innovative in cellulo method as an alternative to in vivo neurovirulence test for the characterization and quality control of human live Yellow Fever virus vaccines: A pilot study. Biologicals. 53, 19-29 (2018).
  35. Nanobodies suitable for neuron regeneration therapy. Patent. , EP3191510A1 (2014).
  36. Li, T., et al. Selection of similar single domain antibodies from two immune VHH libraries obtained from two alpacas by using different selection methods. Immunology Letters. 188, 89-95 (2017).
  37. Schumacher, D., Helma, J., Schneider, A. F. L., Leonhardt, H., Hackenberger, C. P. R. Nanobodies: Chemical Functionalization Strategies and Intracellular Applications. Angewandte Chemie International Edition. 57 (9), 2314-2333 (2018).
  38. Prehaud, C., Megret, F., Lafage, M., Lafon, M. Virus infection switches TLR-3-positive human neurons to become strong producers of beta interferon. J Journal of Virology. 79 (20), 12893-12904 (2005).
  39. Siflinger-Birnboim, A., et al. Molecular sieving characteristics of the cultured endothelial monolayer. Journal of Cellular Physiology. 132 (1), 111-117 (1987).
  40. High Mast2-affinity polypeptides and uses thereof. Patent. , EP20110306454 (2011).
  41. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).
  42. Beck, A. S., Wood, T. G., Widen, S. G., Thompson, J. K., Barrett, A. D. T. Analysis By Deep Sequencing of Discontinued Neurotropic Yellow Fever Vaccine Strains. Scientific Reports. 8 (1), 13408(2018).
  43. Staples, J. E., Monath, T. P. Yellow fever: 100 years of discovery. The Journal of the American Medical Association. 300 (8), 960-962 (2008).
  44. Wang, E., et al. Comparison of the genomes of the wild-type French viscerotropic strain of yellow fever virus with its vaccine derivative French neurotropic vaccine. Journal of General Virology. 76 (Pt 11), 2749-2755 (1995).
  45. Li, T., et al. Cell-penetrating anti-GFAP VHH and corresponding fluorescent fusion protein VHH-GFP spontaneously cross the blood-brain barrier and specifically recognize astrocytes: application to brain imaging. FASEB J. 26 (10), 3969-3979 (2012).
  46. Garcia-Mesa, Y., et al. Immortalization of primary microglia: a new platform to study HIV regulation in the central nervous system. Journal of NeuroVirology. 23 (1), 47-66 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Bloed hersenbarri remodelHumaan BBB modelMini hersencultuurEndotheelcelpermeabiliteitLucifer Yellow transportDetectie van viruspassageNeurovita geneesmiddeltransportNeuron targeterende biomolecuulCerebrale microvasculaire endotheelcellenPolyester membraancultuurinsert

Gerelateerde artikelen