Hier presenteren we een protocol met een beschrijving van de instelling van een in gnudles BBB (bloed-hersenbarrière)-Minibrain polyester poreuze membraan cultuur invoegen systeem teneinde het vervoer van biomoleculen of infectieuze agentia via een menselijke BBB en hun fysiologische effect op de naburige hersencellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een Model Interface menselijke Blood-Brain barrière kruisingen door ziekteverwekkers of geneesmiddelen en hun interacties met de hersenen bestuderen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De vroege screening van zenuwstelsel geneesmiddelen op een relevante en betrouwbare in gnudles BBB model voor hun penetratie en hun interactie met de barrière en de hersenen parenchym is nog steeds een unmet behoefte. Om te vullen deze kloof, ontwierpen we een 2D in gnudles model, de BBB-Minibrain, door het combineren van een polyester poreuze membraan cultuur invoegen menselijke BBB model met een Minibrain gevormd door een tri-cultuur van menselijke hersencellen (neuronen, astrocyten en microglial cellen). De BBB-Minibrain ons in staat gesteld om te testen het vervoer van een neuroprotectieve drug kandidaat (bijvoorbeeld Neurovita), via de BBB, om te bepalen van de specifieke doelgerichtheid van deze molecule tot neuronen en om te laten zien dat het neuroprotectieve eigendom van de drug werd bewaard na de drug had stak de BBB. We hebben ook aangetoond dat BBB-Minibrain een interessant model vormt voor de passage van virusdeeltjes detecteren in de endotheliale cellen barrière en het controleren van de infectie van de Minibrain door neuroinvasive virusdeeltjes. De BBB-Minibrain is een betrouwbaar systeem, makkelijk te hanteren voor onderzoeker opgeleid in cel-cultuur technologie en voorspellende van de hersenen cellen fenotypen na behandeling of belediging. De belangstelling voor dergelijke gnudles testen zou tweeledig: introductie van derisking stappen in het begin van de Geneesmiddelenontwikkeling enerzijds en vermindering van het gebruik van dierproeven aan de andere kant.
Inleiding
De hersenen wordt gescheiden van de systemische circulatie door een niet-poreuze structuur die uitwisselingen tussen de hersenen parenchym en het bloed beperkt, de bloed - hersenbarrière (BBB) genoemd. Voornamelijk samengesteld uit cerebrale endotheliale cellen, interageert de BBB dynamisch met astrocyten, gerelateerde microglia en neuronen van de naburige hersenen parenchym. De drie belangrijkste functies van de BBB zijn het aanleggen en bijhouden van Ionische homeostase voor neuronale functies, levering van de hersenen met voedingsstoffen, en bescherming tegen toxische verwondingen of vermelding van ziekteverwekkers1,
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. cel cultuur werk van Ntera/CL2. D1 te bereiden een co cultuur van post mitotische hNeurons en hAstrocytes (NT2-n/b)
Opmerking: Dit is het onderdeel van het Minibrain (Figuur 1).
- Kweken van de Ntera/Cl2.D1
- Een flesje van bevroren cellen Verwijder uit vloeibare stikstof tank. Houd op ijs.
- Ontdooi de cellen snel in een waterbad 37 ° C.
- Overdracht van de cellen in een tube van 15 mL met 10 mL van volledige DMEM F12 medium (Dulbecco van bewerkt Eagle Medium: nutriënt mengsel F-12 medium) aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 2 mM glutamine, 100 IU penicilline en stre....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De BBB-Minibrain is een in gnudles experimentele model van blood-brain-interface.
De BBB-Minibrain is ingesteld op het systeem van polyester membraan cultuur invoegen na te bootsen een compartiment bloed op de bovenverdieping en een compartiment van de hersenen op het lagere niveau van de blood-brain-interface (figuur 2AB). Het bestaat uit een luminal compartiment m.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In dit artikel we laten zien hoe het bouwen van een in gnudles bloed/hersenen interface, de BBB-Minibrain, door het combineren van een BBB-model en een cultuur van gemengd hersenen cerebrale cellen (Minibrain) in een enkele kit. Dit systeem is biologisch relevant, eenvoudig te installeren en te verwerken voor onderzoekers goed getraind in celkweek.
Zoals voor elke andere in vitro model van BBB, kunnen betrouwbare resultaten worden verkregen als drastische controle van de luchtdichtheid van de .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Het intellectuele eigendom van het systeem was de octrooien waarnaar wordt verwezen in 32, 35 en 38.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door interne subsidies uit Institut Pasteur met inbegrip van een Incitative subsidie (PTR-435) en een subsidie "Contrat de Soutien à la Recherche" geboden door Sanofi Pasteur aan het Institut Pasteur. A. da Costa werd gesteund door de Sanofi Pasteur grant en Florian Bakoa is de ontvanger van een subsidie van de PhD geboden door de ANRT (Association Nationale de la Recherche et de la Technologie). We zijn dank verschuldigd aan Pr Pierre-Olivier Couraud en Dr Florence Miller voor nuttige discussies.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 12 well plates | Corning | 3336 | |
| 5-fluoro-2’deoxyuridine | Merck-Sigma Aldrich | F0503 | |
| 85mm Petri Dish | Sarstedt | 83-3902-500 | |
| Anti-Nf200 | Merck-Sigma Aldrich | N4142 | |
| ß-mercapto-ethanol | Merck-Sigma Aldrich | M3148 | |
| CHME/Cl5 | Unité de Neuroimmunologie Virale | Op aanvraag bij Dr Lafon | |
| CMC | Calbiochem | 217274 | |
| Cytosine ß-D-arabinofuranoside | Merck-Sigma Aldrich | C1768 | |
| Dark 96 well plates | Corning | 3915 | |
| DMEM F12 | Thermofisher Scientific | 31330-038 | |
| DMSO | Merck-Sigma Aldrich | D2650 | |
| Endogro IV | Millipore | SCME004 | endotheelcelmedium |
| Ethanol | Carlo Erba | 529121 | |
| FBS | Hyclone | SV30015-04 | |
| Formaldehyde | Merck-Sigma Aldrich | 252549 | |
| GIEMSA | RAL Diagnostic | 320310 | |
| Goat-Anti Mouse | Jackson Immuno Research | 115-545-003 | |
| Goat-Anti Rabbit | Thermofisher Scientific | R37117 | |
| HBSS with Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14025-100 | |
| hCMEC/D3 | Cedarlane | CLU512 | |
| Hepes 1M | Thermofisher Scientific | 15630-070 | |
| Hoescht 33342 | Merck-Sigma Aldrich | 33263 | |
| Laminine | Merck-Sigma Aldrich | L6274 | |
| L-glutamine | Thermofisher Scientific | 25030-024 | |
| Lucifer Yellow | Merck-Sigma Aldrich | L0259 | |
| MEM 10X | Thermofisher Scientific | 21430 | |
| MEM 1X | Thermofisher Scientific | 42360 | |
| Ntera/Cl2D.1 | ATCC | CRL-1973 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| PBS without Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14190 | |
| PBS-Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14040-091 | |
| Pen/Strep | Eurobio | CXXPES00-07 | |
| Poly-d-Lysine | Merck-Sigma Aldrich | P1149 | |
| Prolong Gold | Thermofisher Scientific | P36930 | |
| Qia shredder | QIAGEN | 79656 | |
| Rat Collagen I | Cultrex | 3443-100-01 | |
| Retinoic Acid All-Trans | Merck-Sigma Aldrich | R2625 | |
| RNA purification kit | QIAGEN | 74104 | |
| SDS | Merck-Sigma Aldrich | L4509 | |
| Sodium bicarbonate 5.6% | Eurobio | CXXBIC00-07 | |
| Sodium Pyruvate | Thermofisher Scientific | 11360 | |
| T75 Cell+ Flask | Sarstedt | 83-1813-302 | Weefselkweekpolystyreenfles met specifieke oppervlaktebehandeling (Cell+) voor gevoelige adherente cellen |
| Transwell | Corning | 3460 | polyester poreuze membraancultuurinserts |
| Trypsin-EDTA | Merck-Sigma Aldrich | T3924 | |
| Ultra Pure Water | Thermofisher Scientific | 10977-035 | |
| Uridine | Merck-Sigma Aldrich | U3750 | |
| Versene | Thermofisher Scientific | 15040-033 | EDTA |
| YFV-FNV | IP Dakar | Vaccinflesje |
Referenties
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
