Methodenartikel

Inductie en karakterisering van pulmonale hypertensie bij muizen met behulp van het Hypoxia/SU5416-model

DOI:

10.3791/59252

⸱

3 juni 2020

 ,  ,  , 
1Cardiovascular Research Center, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Phospholamban Foundation

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de inductie van pulmonale hypertensie (PH) bij muizen op basis van de blootstelling aan hypoxie en de injectie van een VEGF receptor antagonist. De dieren ontwikkelen PH en rechts ventriculaire (RV) hypertrofie 3 weken na de inleiding van het protocol. De functionele en morfometrische karakterisering van het model wordt ook gepresenteerd.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pulmonary Hypertension (PH) is een pathofysiologische aandoening, gedefinieerd door een gemiddelde longslagaderdruk van meer dan 25 mm Hg in rust, zoals beoordeeld door rechter hartkatheterisatie. Een breed spectrum van ziekten kan leiden tot PH, verschillend in hun etiologie, histopathologie, klinische presentatie, prognose, en reactie op de behandeling. Ondanks aanzienlijke vooruitgang in de afgelopen jaren, PH blijft een ongezcureerde ziekte. Inzicht in de onderliggende mechanismen kan de weg vrijmaken voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën. Diermodellen zijn belangrijke onderzoeksinstrumenten om dit doel te bereiken. Momenteel zijn er verschillende modellen beschikbaar voor het samenvatten van PH. Dit protocol beschrijft een twee-hit muis PH-model. De stimuli voor PH-ontwikkeling zijn hypoxie en de injectie van SU5416, een vasculaire endotheelgroeifactor (VEGF) receptor antagonist. Drie weken na de initiatie van Hypoxia/SU5416 ontwikkelen dieren longvasculaire remodellering die de histopathologische veranderingen imiteert die bij menselijke PH (voornamelijk groep 1) worden waargenomen. Vasculaire remodellering in de longcirculatie resulteert in de herinrichting van de rechter ventrikel (RV). De procedures voor het meten van rv-druk (met behulp van de open borstmethode), de morfometrische analyses van de RV (door zowel hartventriënten te ontleden en wegen) als de histologische beoordelingen van de remodellering (zowel long door het beoordelen van vasculaire remodeling en cardiale door de beoordeling van RV cardiomyocyte hypertrofie en fibrose) worden in detail beschreven. De voordelen van dit protocol zijn de mogelijkheid van de toepassing zowel in het wilde type als in genetisch gemodificeerde muizen, de relatief eenvoudige en goedkope implementatie, en de snelle ontwikkeling van de ziekte van belang (3 weken). Beperkingen van deze methode zijn dat muizen geen ernstig fenotype ontwikkelen en PH is omkeerbaar bij terugkeer naar normoxie. Preventie, evenals therapie studies, kan gemakkelijk worden uitgevoerd in dit model, zonder de noodzaak van geavanceerde vaardigheden (in tegenstelling tot chirurgische knaagdier modellen).

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pulmonary Hypertension (PH) is een pathofysiologische aandoening, gedefinieerd door een gemiddelde longslagader (PA) druk van meer dan 25 mm Hg in rust, zoals beoordeeld door rechter hartkatheterisatie1,2. Er is een verscheidenheid aan ziekten die kunnen leiden tot PH. In een poging om de ph-geassocieerde voorwaarden te organiseren, zijn verschillende classificatiesystemen ontwikkeld. De huidige klinische classificatie categoriseert de meervoudige PH-geassocieerde ziekten in 5 verschillende groepen1. Dit onderscheid is van belang omdat verschillende groepen patiënten ziekten hebben die verschillen in hun klinische presentatie, pathologie, prognose en reactie op behandeling2. Tabel 1 geeft een overzicht van de huidige classificatie, aangevuld met de basis histopathologische kenmerken van elke ziekte.

figure-introduction-1
Tabel 1: Overzicht van de klinische classificatie van PH, samen met de belangrijkste histopathologische kenmerken binnen de groepen. Geschiktheid van het Hypoxia/SU5416 protocol voor het modelleren van PH. Deze tabel is gewijzigd van19. PH: Pulmonale hypertensie, PAH: Pulmonale arteriële hypertensie

Ondanks aanzienlijke vooruitgang in de behandeling van PH-geassocieerde ziekten, PH blijft nog steeds zonder genezing, met een 3-jarig sterftecijfer variërend tussen 20% en 80%3. Dit geeft de noodzaak aan om de onderliggende mechanismen van PH te begrijpen en, daarna, de ontwikkeling van nieuwe therapieën om de progressie te voorkomen, te vertragen en de ziekte te genezen. Diermodellen zijn van cruciaal belang voor deze omvang. Momenteel bestaan er verschillende modellen om PH te bestuderen. De geïnteresseerde lezer wordt verwezen naar de uitstekende recensies over dit onderwerp2,3,4. Rekening houdend met de verscheidenheid aan ziekten die leiden tot PH, is het duidelijk dat de verschillende omstandigheden van menselijke PH niet perfect kunnen worden samengevat in een diermodel. De dierlijke modellen beschikbaar kan worden gecategoriseerd in i) single-hit, ii) twee-hit, iii) knock-out, en iv) overexpression modellen3. In de single-hit modellen wordt PH veroorzaakt door een enkele pathologische stimulus, terwijl twee-hit modellen combineren twee pathologische stimuli met het doel van het induceren van meer ernstige PH en dus meer nauw imiteren de complexe menselijke ziekte. Naast de etiologische verschillen resulteren de verschillende stimuli in PH-modelleringsverschillen die ook afhangen van de soort en de genetische achtergrond van de dieren4.

Een van de meest gebruikte klassieke PH knaagdier modellen is de chronische hypoxie model2. Hypoxie is bekend dat PH induceren bij zowel mensen als bij verschillende diersoorten. Hypoxie heeft het voordeel dat het een fysiologische stimulans is voor PH(tabel 1). Echter, terwijl de mate van hypoxie gebruikt voor het induceren van PH bij knaagdieren is veel ernstiger dan bij de mens, de enige belediging (hypoxie) leidt alleen maar tot een milde vorm van vasculaire remodellering. Dit imiteert niet de ernst van de menselijke ziekte. De toevoeging van een tweede treffer, een extra stimulans voor het opwekken van PH, toonde veelbelovende resultaten: injectie van de verbinding SU5416 aan knaagdieren in combinatie met de hypoxische stimulus veroorzaakt een ernstiger PH-fenotype2,5,6. SU5416 is een remmer van vasculaire endotheelgroeifactor (VEGF) receptor-2. Het blokkeert de VEGF receptoren en leidt tot endotheelcel apoptose. Onder hypoxische omstandigheden stimuleert dit de proliferatie van een subset van apoptose-resistente endotheelcellen. Bovendien leidt SU5416 tot een soepele spiercelproliferatie. De combinatie van deze effecten resulteert in pathologische vasculaire herinrichting van de longcirculatie en leidt tot verhoogde PA-druk en rechter ventriculaire remodellering2,5,7. Het model werd voor het eerst beschreven bij ratten6 en later toegepast op muizen4,5,7. Het muismodel vertoont minder ernstige vasculaire remodellering in vergelijking met ratten. Bovendien, wanneer terug naar normoxia, PH blijft vooruitgang bij ratten, terwijl in muizen is het gedeeltelijk omkeerbaar.

Het volgende protocol beschrijft alle stappen voor het modelleren van PH bij muizen met behulp van de Hypoxia/SU5416-methode (planning, tijdlijn, uitvoering). Daarnaast wordt de karakterisering van het model beschreven in dit protocol: functioneel (door invasief de juiste ventriculaire (RV) druk te meten met behulp van de open borsttechniek), morfometrisch (door zowel de rechter- als de linkerventrikels te ontleden en te wegen), evenals histologisch (door longfyvale vaatremodellering te evalueren, rechter ventriculaire cardiomyocyte hypertrofie en fibrose).

Alle stappen en methoden beschreven in dit protocol kunnen eenvoudig worden geïmplementeerd door onderzoekers op elk ervaringsniveau. Terwijl de functionele metingen van de RV met behulp van de open borst techniek (hier beschreven) is niet de gouden standaard methode in het veld, het heeft het voordeel dat het snel kan worden geleerd en nauwkeurig gereproduceerd, zelfs door een minder ervaren experimentator.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voorafgaand aan een dier experimenten verkrijgen van de lokale institutionele dierverzorging commissie vergunning. De huidige experimenten werden uitgevoerd na goedkeuring door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) op de Icahn School of Medicine op mount Sinai.

1. PH-inductie

  1. Voorbereiding
    1. Plan voor aanvang van de studie zorgvuldig het experimentele ontwerp. Zorg ervoor dat muizen worden onderworpen aan hypoxie op hetzelfde moment als de eerste SU5416 injectie. Een voorbeeld van het experimentele ontwerp voor het induceren van PH met behulp van de Hypoxia/SU5416-methode is te zien in figuur 1A. Controlemuizen ontvingen alleen het voertuig. Voor dit model wordt SU5416 gedurende 3 opeenvolgende weken eenmaal per week in de muizen geïnjecteerd.
    2. Gebruik acht tot twaalf weken oude C57BL/6 muizen voor deze studie. Huis de dieren op 18-20 °C in een 12-h licht-donkere cyclus. Zorg ervoor dat voedsel en water toegankelijk zijn ad libitum.
    3. Weeg de dieren. Wijs ze willekeurig toe aan elke groep: Normoxia en Hypoxia/SU5416.
    4. Bereid de hypoxische kamer zoals afgebeeld in figuur 1B. Veilige stikstof (N2) tanks in de buurt van de kamer. Stel de zuurstofregelaar (O2)in op een punt van 10% O2. Laat het systeem een stabiele toestand bereiken.
    5. Bereid SU5416 voor op injectie (gebruik een dosis van 20 mg/kg lichaamsgewicht). SU5416 lost niet op in waterige oplossingen; los daarom het berekende bedrag op in 100 μL DMSO8. Voor een muis van 25 g bijvoorbeeld is de hoeveelheid te injecteren SU5416 0,5 mg opgelost in 100 μL solvent (DMSO). De uiteindelijke concentratie van SU5416 voor deze muis is dus 5 mg/mL.
      LET OP: SU5416 is een gevaarlijk materiaal. Lees het veiligheidsinformatieblad dat vergezeld gaat van het product zorgvuldig door en zorg ervoor dat u de aanbevolen voorzorgsmaatregelen neemt bij het hanteren van deze stof. Draag beschermende handschoenen en (zoals voor elke injectie) gebruik oogbescherming. De chemische structuur van SU5416 is weergegeven in figuur 1C.
      OPMERKING: Bereken een passend overschot van de oplossing om het volume te compenseren dat verloren gaat tijdens de injectie (bijvoorbeeld in de spuit, flacon enz.). Afhankelijk van de gebruikte spuit is het dode volume ongeveer 200 μL. Bereken voor een groep van 10 muizen een overschot van 2 muisdoses.
    6. Bereid de spuiten voor op injectie. Gebruik 1 mL spuiten met een 25 G x 5/8" naalden.
  2. SU5416 onderhuidse injectie
    1. Hou het dier in bedwang. Plaats de muis op het deksel van de kooi om de terughoudendheid te ondersteunen. Pak de huid en vorm een tent parallel aan de wervelkolom. Zorg ervoor dat je de achterkant van het hoofd stevig vastgreep, om de mogelijke bijtwond door de muis te voorkomen.
      OPMERKING: De aanwezigheid van twee onderzoekers maakt de procedure sneller en nauwkeuriger als men het dier kan vasthouden terwijl de andere de injectie uitvoert.
    2. Steek de naald onderhuids over de flank bij de losse plooi van de huid. Zorg ervoor dat u de naald parallel aan de huid. Vermijd het penetreren van de buikwand.
    3. Injecteer de inhoud van de spuit (100 μL opgeloste SU5416 of voertuig).
      OPMERKING: Om lekkage na volledige levering te voorkomen, houdt u de spuit ongeveer 10 s vast en draait u de naald licht onder de huid.
    4. Trek de naald en breng het dier terug naar zijn kooi. Na de injectie van SU5416 plaatst u de kooien in de geventileerde hypoxiekamer.
  3. Blootstelling aan hypoxie
    1. Controleer de ventilatie na verloop van tijd. Zorg ervoor dat u 10% van de zuurstoftoevoer in stand houdt. Handhaven normoxia dieren in een semi-afsluitbare kamer in op 21% O2.
    2. Zorg ervoor dat de kamers zijn uitgerust met een zuurstofsensor om het zuurstofgehalte te meten. Vermijd uitgebreide opening van de kamers. Voor het reinigen en toevoegen van voedsel en water open de kamers voor niet meer dan 20 min per 3 dagen.
    3. Inspecteer dieren dagelijks. Overweeg stress signalen zoals piloerection of aanzienlijk gewichtsverlies.
      OPMERKING: Dieren onder Hypoxia/SU5416 zullen naar verwachting gewicht verliezen5. Dit is een indicatie van de ontwikkeling van de ziekte.
    4. Herhaal de SU5416-injectie wekelijks gedurende 3 opeenvolgende weken (zie figuur 1A voor het overzicht van het experimentele ontwerp).
      OPMERKING: Het variëren van de plaats van injectie kan helpen verminderen huidirritaties.

2. Functionele karakterisering door invasieve RV drukmetingen

  1. Voorbereiding
    OPMERKING: Selecteer een verdovingsregime. Injecteerbare of inhaleerbare verdoving kan worden gebruikt. Aangezien een lichte overdosis injecteerbare verdovingsmiddelen (vooral van ketamine/xylazine of pentobarbital) de hartfunctie aanzienlijk kan beïnvloeden, wordt het gebruik van vluchtige verdovingsvingers aanbevolen. Het is van groot belang om dezelfde verdoving te gebruiken voor alle muizen binnen een studie.
    1. Gebruik een vaporizer om een nauwkeurige verdovingsdosis per dier te garanderen. De dosis voor isofluraan is als volgt: inductie 3-4%, onderhoud 1% gemengd met 100% zuurstof.
      LET OP: Draag persoonlijke beschermingsmiddelen en voorkom dat de damp wordt inademen.
    2. Bereid een verwarmingskussen en/of verwarmingslampen voor het handhaven van de lichaamstemperatuur. Bereid een rectale temperatuursonde voor voor het bewaken van de lichaamstemperatuur.
    3. Zorg voor een goede ventilatie. Bereid de ventilator vooraf voor. Bereid de Y-buis connector en controleer de functie van de ventilator met behulp van de handmatige modus. Zorg ervoor dat de inspiratoire druk <1 cm H2O is om barotrauma te voorkomen. Stel de ademhalingssnelheid in op 110 ademhalingen/min.
    4. Bereid een endotracheale buis door het snijden van een 20 G intravasculaire katheter.
    5. Bereid de benodigde instrumenten voor: kleine tangen, scharen, elastische haakoprolmechanismen, vaatcauterizer en wattenstaafjes. Op een wattenstaafje stel een kleine 25 G x 5/8" naald die zal worden gebruikt om een kleine punctie in de rechter ventrikel te maken.
    6. Bereid de Drukkatheter, de Pressure-volume Control Unit en start de data acquisition software. Plaats de PV Katheter in een buis van 15 mL gevuld met PBS op 37 °C gedurende 15 minuten en kalibreer volgens het protocol van de fabrikant.
    7. Voor de perfusie en fixatie van de organen, bereiden PBS en een oplossing van 50% PBS / 50% OCT. Bereid 2 x 10 mL spuiten (met een 25 G naald): een zal worden gebruikt voor het neerduren van het hart en de long met PBS in situ en de tweede voor het injecteren van de OCT / PBS (50/50) oplossing voor de long specimen dat zal worden gebruikt voor histologisch onderzoek.
  2. Intubatie
    1. Weeg de muis af en noteer de gezondheidsstatus voor anesthesie.
    2. Induceer anesthesie met 3-4% isofluraan. Controleer de anesthesiediepte door de teenknijpreflex te testen: knijp de teen van een van de ledematen stevig in. Als het dier de ledemaat terugtrekt, is het een teken van onvoldoende anesthesie.
    3. Na anesthesie inductie scheer je de nek en de borstgebieden.
    4. Plaats de muis op het verwarmingskussen. Plaats een rectale temperatuur sonde voor het bewaken van de lichaamstemperatuur.
      LET OP: Het behoud van de lichaamstemperatuur is van belang voor de functionele metingen. De lichaamstemperatuur moet ongeveer 36,5-37 °C zijn.
    5. Met behulp van gebogen tangen hechten een hechting draad aan de bovenste snijtanden van de muis, rekken en vast te stellen aan de verwarming pad met chirurgische tape. Beveilig de ledematen van de muis met behulp van chirurgische tapes.
    6. Voor het intuberen van het dier maak een kleine incisie van ongeveer 1 cm in de mediale cervicale huid met behulp van kleine schaar.
      OPMERKING: Orale intubatie is een alternatieve methode die meer ervaring vereist.
    7. Met een katoen-getipte applicator scheiden botweg de parotid en submandibulaire speekselklieren op het middenniveau. Dit zal bloot de spieren boven de luchtpijp.
    8. Snijd deze spieren zorgvuldig door en ontmasker de luchtpijp.
    9. Maak met een kleine schaar een kleine incisie tussen het tracheale kraakbeen en steek de voorbereide endotracheale buis in. Neem de metalen geleider van de intravasculaire katheter.
    10. Sluit de katheter aan op de beademing. Controleer de luchtpijppositie door de longen handmatig voorzichtig op te blazen. Beveilig de positie met tape.
    11. Handhaven van een 1% isoflurane anesthesie gedurende de hele procedure.
    12. Controleer regelmatig de diepte van anesthesie door de teenknijpreflex te testen. Pas de verdoving dienovereenkomstig aan.
      OPMERKING: De aanbevolen hartslag tijdens de experimenten, onder 1% isoflurane anesthesie, is ongeveer 400 slagen /min. Onderhoud van lichaamstemperatuur en anesthesie zijn essentieel voor het regelen van de hartslag. Een teveel aan isofluran kan de hartslag verlagen. Herstel kan echter worden bereikt door het isoflurige tarief te verlagen.
  3. RV drukmetingen (open borstbenadering)
    1. Met een kleine schaar voert u een huidincisie uit van ongeveer 1 cm over het xiphoïde proces en het bovenste buikdeel. Scheid de huid die de borst en de buikwand van de bovenste buikkwadranten: begin bij de middelste lijn, distaal aan de xiphoid en beweeg voorzichtig zijwaarts aan beide zijden. Gebruik thermocautery om bloeden onder controle te houden.
      OPMERKING: Het doel is om toegang te hebben tot de borstholte via de buikwand.
    2. Open de buikholte en snijd het middenrif zorgvuldig, waarbij u ervoor zorgt dat het kloppende hart of de longen niet worden verwond.
      OPMERKING: Het doel is om de top en de rechter hartkamer van het hart bloot te leggen. Goede belichting en zicht op het hart zijn van cruciaal belang voor de juiste plaatsing van de katheter. Het is van groot belang om bloedingen tijdens de procedure te voorkomen. Zelfs kleine veranderingen in het intravasale volume kunnen de belasting van het rechterhart veranderen en de geregistreerde parameters beïnvloeden.
    3. Verwijder het pericardium voorzichtig met behulp van een applicator met katoenpunt.
    4. Vlak voor het plaatsen van de drukkatheter in het hart, breng de katheter naast de muis.
    5. Met behulp van de voorbereide katoen-tip applicator met de naald maakt een steekwond in het apicale distale deel van de rechter ventrikel. Verwijder de naald voorzichtig en steek de drukkatheter in dit gat.
      LET OP: Dit zou moeten werken zonder kracht toe te passen. In het geval dat dit niet mogelijk is, probeer dan het maken van een nieuw gat in de buurt van de eerste om langdurige schade van het hart te voorkomen. De naald mag niet dieper worden ingebracht dan ongeveer 3 mm.
    6. Plaats de drukkatheter parallel aan de richting van de rechterventrikel, met de punt naar de longslagader gericht.
    7. Let op de drukgolftracering om de juiste positionering van de katheter te garanderen. Representatieve traceringen worden aangetoond in figuur 2.
    8. Laat het druksignaal stabiliseren. Pauzeer ademhalingen en verkrijg ten minste 3 metingen. Tussen de afzonderlijke metingen door kan het dier geventileerd worden.
    9. Zodra alle metingen zijn geregistreerd verwijder de katheter en plaats deze terug in de met PBS gevulde buis in het waterbad.
      OPMERKING: Na voltooiing van het experiment moet u de katheter reinigen volgens de instructies van de fabrikant.
  4. Euthanasie en longperfusie
    1. Na voltooiing van het experiment euthanaseren de muis door exsanguination.
    2. Open de borst op grote schaal. Met behulp van een schaar, snijd het hele borstbeen en let niet op het hart of de longen te verwonden.
    3. Met behulp van iris schaar maakt een kleine incisie in de linker ventrikel om bloed toe te staan om de kamer te verlaten.
    4. Plaats de 25 G naald van een spuit met 10 mL PBS in de rechter ventrikel en injecteer de PBS-oplossing totdat de longen zijn vrijgesproken van bloed.
    5. Zodra deze stap is voltooid, bevestigen euthanasie door vitale weefsel oogst (hart en longen): snijd de cava en aorta bijlagen en verwijder het hart en de longen en blok.

3. Morphometrische karakterisering

  1. Onmiddellijk na het verwijderen van het hart en de longen (stap 2.4.5), isoleren van het hart en verwijder beide atria. Met gebogen tenotomie schaar ontleden zorgvuldig de rechter ventrikel (RV) van de linker ventrikel (LV), waardoor het septum (S) met de linker ventrikel. Weeg RV en LV+S af en bereken de Fulton index= RV/LV+ S (figuur 3)5,9.
  2. Neem een deel van de rechter ventrikel en plaats het in een OCT voorgevulde inbeddingsvorm. Gebruik het andere deel van de rechter ventrikel voor RNA en/of eiwitanalyse. Vries in droogijs en bewaar bij -80 °C.
  3. Gebruik iris schaar om de longen te isoleren van het hart en andere resterende weefsel.
    OPMERKING: Voor de bereiding van de longen is de hierboven beschreven perfusie (stap 2.4.3-2.4.5) van groot belang.
  4. Snap bevriezen deel van de longen en bewaar het voor RNA, eiwit extractie of andere tests.
  5. Gebruik het andere deel van de longen voor histologische analyse. Voeg hiervoor de spuit met 50% PBS en 50% LGO in een bronchus van de gebruikte kwab10,11. De onderzoeker kan gemakkelijk zien dat de long wordt opgeblazen wanneer de inhoud van de spuit is geperfundeerd in het weefsel.
  6. Plaats deze stukjes long in het inbedden van mallen voorgevuld met OCT en snap bevriezen ze in droogijs. Bewaar de monsters op -80 °C nadat ze zijn ingevroren.
  7. Bereid 8 μm secties van RV en long met behulp van een cryostat machine. De lucht droogt de secties op kamertemperatuur gedurende 30 min.
  8. Bevestig de glijbanen op kamertemperatuur met behulp van 10% paraformaldehyde (PFA) gedurende 10 minuten.
    OPMERKING: PFA is een bekende menselijke kankerverwekkende stof. Verminder het blootstellingsrisico door gebruik te maken van een chemische rookkap, de juiste procedures en persoonlijke beschermingsmiddelen. Raadpleeg het Material Safety Data Sheet (MSDS) voor meer informatie.
  9. Vasculaire remodelleringsbeoordeling door Hematoxylin/Eosin-kleuring
    Opmerking: Voer Hematoxylin/Eosin-kleuring uit om de structurele veranderingen van het hart en de vasculaire remodellering in de long te beoordelen(figuur 3).
    1. Vlek met Hematoxylin oplossing gedurende 8 min.
    2. Spoel 5 minuten af met stromend kraanwater, gevolgd door een snelle spoeling in gedestilleerd water.
    3. Spoel 95% EtOH in gedurende 1 min en contravlek in de Eosin-oplossing gedurende 1 min.
    4. Dehydraat (80% ethanol 10-30 s, 100 ethanol voor 1 min en 100% Toluol voor 3 min).
    5. Monteer en dek af met een coverslip. Droog de glijbanen 's nachts op kamertemperatuur.
      LET OP: De oplossingen die worden gebruikt voor vlekken kunnen gevaarlijk zijn. Verminder het blootstellingsrisico door gebruik te maken van een chemische rookkap, de juiste procedures en persoonlijke beschermingsmiddelen. Raadpleeg de MSDS voor meer informatie.
  10. Rechter ventriculaire fibrose beoordeling door Picrosirius Red Staining
    OPMERKING: In de Picrosirius Red Kleuring bindt Picrosirius Red, zuur, aan collageen12. Daarom kan deze kleuring worden gebruikt voor een histologisch onderzoek van het collageengehalte.
    1. Broed de glijbanen in een voorverwarmde Bouin's Solution bij 58 °C gedurende 1 uur.
    2. Was de glijbanen in stromend leidingwater om gele kleur te verwijderen uit secties gedurende 10-15 min.
    3. Vlek in 0,1% Fast Green gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Spoel 1% azijnzuur gedurende 1 min.
    5. Spoel 5 minuten in leidingwater.
    6. Vlek in 0,1% Sirius rood gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur gevolgd door uitdroging in Toluol.
      LET OP: De oplossingen die worden gebruikt voor vlekken kunnen gevaarlijk zijn. Verminder het blootstellingsrisico door gebruik te maken van een chemische rookkap, de juiste procedures en persoonlijke beschermingsmiddelen. Raadpleeg de MSDS voor meer informatie.
  11. RV cardiomyocyte hypertrofie beoordeling door WGA Kleuring
    OPMERKING: Hypertrofie van de rechter ventrikel (RV) op cellulair niveau kan worden beoordeeld door het uitvoeren van een Wheat Germ Agglutinin (WGA) kleuring(figuur 4).
    1. Bevestig de glijbanen in koude Aceton-oplossing gedurende 15 minuten, gevolgd door 3 stappen wassen in PBS (5 min per stuk).
    2. Blok met 10% geitenserum in een Dako-oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    3. De dia's met WGA uitbroeden: Voeg WGA 1:200 toe en incubbate voor 1 1/2 uur bij 37 °C in het donker.
    4. Was de glijbanen drie keer met PBS.
    5. Broed de dia's uit met een nucleïnezuurverfstof.
    6. Was de glijbanen drie keer met PBS.
    7. Voor montage, verwijder de overtollige vloeistof en breng montage media en een coverslip. Droog de glijbanen 1 uur bij kamertemperatuur in het donker en bewaar op 4 °C.
      LET OP: De oplossingen die worden gebruikt voor vlekken kunnen gevaarlijk zijn. Verminder het blootstellingsrisico door gebruik te maken van een chemische rookkap, de juiste procedures en persoonlijke beschermingsmiddelen. Raadpleeg de MSDS voor meer informatie.
  12. Voer immunochemie van de long uit om vasculaire remodellering verder en specifiek te beoordelen. Bijvoorbeeld, gladde spiercel vlekken kan worden gebruikt om de gespierdheid van de vaten te beoordelen, terwijl von Willebrand Factor kleuring kan worden gebruikt om endotheelveranderingen visualiseren. Deze methoden worden elders beschreven5.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol beschrijven we in detail de creatie van het Hypoxia/SU5416-model voor het induceren van PH bij muizen. Verder beschrijven we alle noodzakelijke stappen voor het uitvoeren van longvasculaire en cardiale evaluatie aan het einde van de observatieperiode.

Een overzicht van het experimentele ontwerp voor dit model is te zien in figuur 1A13,14. Muizen worden onderworpen aan normo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft hoe ph bij muizen te modelleren door twee pathologische stimuli te combineren: chronische hypoxie en SU5416-injectie (Hypoxie/SU5416)18. In een poging om dit muismodel te correleren met de menselijke PH-conditie, moet men onvermijdelijk kijken naar de huidige PH-classificatie, weergegeven in tabel 1. PH in bijna alle vormen wordt gekenmerkt door longvakoonstrictie en afwijkende proliferatie van endotheel en gladde spiercellen. Dit leidt tot verhoogde druk i...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te verklaren.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de American Heart Association (AHA- 17SDG33370112 en 18IPA34170258) en van de National Institutes of Health NIH K01 HL135474 tot Y.S. O.B werd ondersteund door de Deutsche Herzstiftung.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Azijnzuur glacialRoth3738.1
Aceton, Histologie GradeThe Lab DepotVT110D
ADVantage Pressure-Volume SystemTransonicADV500
Bouin's oplossingSigmaHt10132
Cautery SystemFine Science Tools18000-00
Aansluitingsslangen en kleppen
WattenstaafjesCovidien8884541300
Dekglasjes, 24 x50 mmRoth1871
Gegevensverzameling en -analyseEmkaiox2
Direct Red 80Sigma365548-5G
DMSO (Dimethyl Sulfoxide)Sigma Aldrich276855
Droge ijs
Dumont # 5 pincetFine Science Tools11251-10
Dumont # 7 Fine PincetFine Science Tools11274-20
InbeddingsvormenSigma AldrichE-6032
Eosine Oplossing AqueousSigmaHT110216
Ethanol, laboratoriumkwaliteitCarolina Biological Supply Company861285
Fast Green FCFSigmaF7252-5G
Fijne schaarFine Science Tools14090-09
Geitenseruminvitrogen16210-064
Verwarmingskussen Gaymar T/Pump
Hematoxyline 2Thermo Scientific7231
Hypoxische kamerBiospherixA30274P
InductiekamerDRE Veterinary12570
Intubatiekatheter (i.v. katheter SurFlash (20 G x 1") )Terumo SR*FF2025
Iris schaarFine Science Tools14084-08
IsofluraanBaxterNDC-10019-360-40
IsofluraanverdamperDRE Veterinary12432
Muizen (C57BL/6)Charles River
Naalden 25 G x 5/8"BD305122
OCTTissue Tek4583
PBS (fosfaatbufferoplossing)Corning21-031-CV
Pirinezuur- verzadigde oplossing 1,3 %SigmaP6744-1GA
DrukvolumekatheterTransonicFTH-1212B-4018
RetractorKent ScientificSURGI-5001
Statische zuurstofcontroller ProOx 360BiospherixP360
SU 5416Sigma AldrichS8442
Chirurgische hechting, zwarte gevlochten zijde, 5,0Surgical Specialties Corp. SP116
Chirurgische tape3M1527-1
Spuit 10 mlBD303134
Spuiten met naald 1 mlBD309626
Sytox Green Nuclein Acid StainThermo ScientificS7020
Tenotomie schaarPricon60-521
ToluolRoth9558.3
Ventilator CWESAR-830/P
WGA Alexa Fluor Thermo ScientificW11261
XYleenRoth

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Galie, N., et al. 2015 ESC/ERS Guidelines for the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension: The Joint Task Force for the Diagnosis and Treatment of Pulmonary Hypertension of the European Society of Cardiology (ESC) and the European Respiratory Society (ERS): Endorsed by: Association for European Paediatric and Congenital Cardiology (AEPC), International Society for Heart and Lung Transplantation (ISHLT). European Heart Journal. 37 (1), 67-119 (2016).
  2. Stenmark, K. R., Meyrick, B., Galie, N., Mooi, W. J., McMurtry, I. F. Animal models of pulmonary arterial hypertension: the hope for etiological discovery and pharmacological cure. American Journal of Physiology-Lung Cell Molecular Physiology. 297 (6), 1013-1032 (2009).
  3. Maarman, G., Lecour, S., Butrous, G., Thienemann, F., Sliwa, K. A comprehensive review: the evolution of animal models in pulmonary hypertension research; are we there yet. Pulmonary Circulation. 3 (4), 739-756 (2013).
  4. Gomez-Arroyo, J., et al. A brief overview of mouse models of pulmonary arterial hypertension: problems and prospects. American Journal of Physiology-Lung Cell Molecular Physiology. 302 (10), 977-991 (2012).
  5. Ciuclan, L., et al. A novel murine model of severe pulmonary arterial hypertension. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 184 (10), 1171-1182 (2011).
  6. Taraseviciene-Stewart, L., et al. Inhibition of the VEGF receptor 2 combined with chronic hypoxia causes cell death-dependent pulmonary endothelial cell proliferation and severe pulmonary hypertension. FASEB Journal. 15 (2), 427-438 (2001).
  7. Vitali, S. H., et al. The Sugen 5416/hypoxia mouse model of pulmonary hypertension revisited: long-term follow-up. Pulmonary Circulation. 4 (4), 619-629 (2014).
  8. Breen, E. C., Scadeng, M., Lai, N. C., Murray, F., Bigby, T. D. Functional magnetic resonance imaging for in vivo quantification of pulmonary hypertension in the Sugen 5416/hypoxia mouse. Experimental Physiology. 102 (3), 347-353 (2017).
  9. Wang, Z., Schreier, D. A., Hacker, T. A., Chesler, N. C. Progressive right ventricular functional and structural changes in a mouse model of pulmonary arterial hypertension. Physiological Reports. 1 (7), 00184(2013).
  10. Momcilovic, M., et al. Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer. Journal of Visualized Experiment. (137), 57167(2018).
  11. Guma, S. R., et al. Natural killer cell therapy and aerosol interleukin-2 for the treatment of osteosarcoma lung metastasis. Pediatric Blood Cancer. 61 (4), 618-626 (2014).
  12. Lattouf, R., et al. Picrosirius red staining: a useful tool to appraise collagen networks in normal and pathological tissues. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 751-758 (2014).
  13. Penumatsa, K. C., et al. Transglutaminase 2 in pulmonary and cardiac tissue remodeling in experimental pulmonary hypertension. American Journal of Physiology-Lung Cell Molecular Physiology. 313 (5), 752-762 (2017).
  14. Wang, Z., et al. Organ-level right ventricular dysfunction with preserved Frank-Starling mechanism in a mouse model of pulmonary arterial hypertension. Journal of Applied Physiology. 124 (5), 1244-1253 (2018).
  15. van de Veerdonk, M. C., Bogaard, H. J., Voelkel, N. F. The right ventricle and pulmonary hypertension. Heart Failure Reviews. 21 (3), 259-271 (2016).
  16. Emde, B., Heinen, A., Godecke, A., Bottermann, K. Wheat germ agglutinin staining as a suitable method for detection and quantification of fibrosis in cardiac tissue after myocardial infarction. European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2448(2014).
  17. Pena, S. D., Gordon, B. B., Karpati, G., Carpenter, S. Lectin histochemistry of human skeletal muscle. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 542-546 (1981).
  18. Bueno-Beti, C., Hadri, L., Hajjar, R. J., Sassi, Y. The Sugen 5416/Hypoxia Mouse Model of Pulmonary Arterial Hypertension. Methods in Molecular Biology. 1816, 243-252 (2018).
  19. Colvin, K. L., Yeager, M. E. Animal Models of Pulmonary Hypertension: Matching Disease Mechanisms to Etiology of the Human Disease. Journal of Pulmonary and Respiratory Medicine. 4 (4), (2014).
  20. Benza, R. L., et al. Predicting survival in pulmonary arterial hypertension: insights from the Registry to Evaluate Early and Long-Term Pulmonary Arterial Hypertension Disease Management (REVEAL). Circulation. 122 (2), 164-172 (2010).
  21. Jacob, S. W., Rosenbaum, E. E. The toxicology of dimethyl sulfoxide (DMSO). Headache. 6 (3), 127-136 (1966).
  22. Jacob, S. W., Wood, D. C. Dimethyl sulfoxide (DMSO). Toxicology, pharmacology, and clinical experience. American Journal of Surgery. 114 (3), 414-426 (1967).
  23. Abraham, D., Mao, L. Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice. Journal of Visualized Experiment. (103), 52942(2015).
  24. Ma, Z., Mao, L., Rajagopal, S. Hemodynamic Characterization of Rodent Models of Pulmonary Arterial Hypertension. Journal of Visualized Experiment. (110), 53335(2016).
  25. Townsend, D. Measuring Pressure Volume Loops in the Mouse. Journal of Visualized Experiment. (111), 53810(2016).
  26. Penumatsa, K. C., Warburton, R. R., Hill, N. S., Fanburg, B. L. CrossTalk proposal: The mouse SuHx model is a good model of pulmonary arterial hypertension. Journal of Physiology. 597 (4), 975-977 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Right Ventricle PressureVascular RemodelingCardiomyocyte HypertrophyFulton IndexWheat Germ AgglutininOpen Chest MethodHypoxic ChamberSU5416 Injection

Gerelateerde artikelen