Methodenartikel

Visualisatie van de Superior oogbeschadigingen en/of Sulcus (hersenanatomie) tijdens Danio rerio embryogenese

DOI:

10.3791/59259

⸱

27 maart 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Alberta, 2Women & Children's Health Research Institute, University of Alberta, 3Division of Anatomy, Department of Surgery, University of Alberta, 4Department of Cell Biology, University of Alberta, 5Department of Medical Genetics, University of Alberta, 6Neuroscience and Mental Health Research Institute, University of Alberta

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een gestandaardiseerde reeks protocollen bij het observeren van de superieure oogbeschadigingen en/of Sulcus (hersenanatomie), een onlangs geïdentificeerd, evolutionair geconserveerd structuur in de gewervelde ogen. Met behulp van zebravis larven, aantonen we technieken die nodig zijn ter specificatie van de factoren die aan de vorming en de sluiting van de superieure oogbeschadigingen en/of Sulcus (hersenanatomie bijdragen).

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aangeboren oogbeschadigingen en/of coloboma is een genetische aandoening die wordt meestal waargenomen als een gespleten in het inferieur aspect van het oog die voortvloeien uit onvolledige choroideus horizontalis sluiting. Onlangs, de identificatie van personen met coloboma in het superieure aspect van de iris, het netvlies, en de lens leidde tot de ontdekking van een nieuwe structuur, hierna aangeduid als de superieure horizontalis of superieure oogbeschadigingen en/of Sulcus (hersenanatomie) (SOS), die op de dorsale Transient aanwezig is aspect van de optiek cup tijdens de ontwikkeling van de gewervelde oog. Hoewel deze structuur is behouden over muizen, kuiken, vis en newt, is ons huidige begrip van de SOS beperkt. Om het verhelderen van factoren die aan de vorming en de sluiting bijdragen, is het absoluut noodzakelijk te kunnen observeren en identificeren van afwijkingen, zoals vertraging bij de sluiting van de SOS. Hier, uiteengezet we om een gestandaardiseerde reeks van protocollen die kan worden gebruikt voor het efficiënt visualiseren de SOS door het combineren van verkrijgbaar microscopie technieken met gemeenschappelijke moleculaire biologietechnieken zoals immunefluorescentie kleuring en mRNA te maken overexpressie. Terwijl deze set van protocollen richt zich op de mogelijkheid om te observeren SOS sluiting vertraging, is het aan te passen aan de behoeften van de experimentator en kan eenvoudig worden aangepast. Over het geheel genomen, wij hopen te maken van een toegankelijke methode waardoor ons begrip van de SOS kan worden gevorderd om uit te breiden van de huidige kennis van de ontwikkeling van de gewervelde oog.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De vorming van de gewervelde oog is een zeer geconserveerde proces waarin zorgvuldig georkestreerde intercellulaire signaalroutes stellen weefseltypes (HLA) en regionale identiteit1opgeven. Verstoringen te vroege oog morfogenese resulteren in ernstige gebreken aan de architectuur van het oog en zijn vaak verblindende2. Een dergelijke ziekte het gevolg van het niet sluiten van de choroideus oogbeschadigingen en/of horizontalis in de ventrale zijde van de optische kop3. Deze aandoening, bekend als oogbeschadigingen en/of coloboma, is naar schatting voorkomen bij 1 op de 4-5000 levendgeborenen en oorzaak 3-11% van de pediatrische blindheid, vaak manifesteert als een sleutelgat-achtige structuur die ondeugdelijkheid van de leerling in het midden van de oog-4uitsteekt, 5,6. De functie van de choroideus horizontalis is bedoeld als een ingangspunt voor vroege therapieën groeien in de optiek beker, waarna de zijkanten van de horizontalis zal smelten om omsluiten de vaartuigen7.

Terwijl oogbeschadigingen en/of coloboma heeft gekend sinds de oudheid, hebben we onlangs geïdentificeerd een roman subset van coloboma patiënten met weefsel verlies beïnvloeden de superior/dorsale aspect van het oog. Recente werkzaamheden in ons lab heeft geleid tot de ontdekking van een oogbeschadigingen en/of structuur in de zebravis dorsale ogen, die wij de superieure oogbeschadigingen en/of Sulcus (hersenanatomie) (SOS) of superieure horizontalis8 noemen. Het is belangrijk op te merken dat de structuur kenmerken van zowel een Sulcus (hersenanatomie) en een horizontalis heeft. Gelijkaardig aan een Sulcus (hersenanatomie), het is een voortdurende weefsel laag die van de nasale aan het temporele netvlies omvat. Bovendien, de sluiting van de structuur is niet gemedieerd door een fusie van de twee tegengestelde kelder membraan, en lijkt het een morfogenetische proces waarmee de structuur wordt bevolkt door cellen vereisen. Echter, vergelijkbaar met een horizontalis, vormt het een structuur die scheidt van de nasale en temporele zijkanten van het dorsale oog met het membraan van de kelder. Voor consistentie, zullen we in deze tekst verwijzen ernaar als de SOS.

De SOS is evolutionair bewaard over gewervelde dieren, wordt zichtbaar tijdens oog morfogenese in vis, kuiken, newt en muis8. In tegenstelling tot de choroideus horizontalis, die van 20-60 uur na bevruchting (hpf) in zebrafish aanwezig is, de SOS is zeer voorbijgaande aard, wezen van 20-23 hpf gemakkelijk zichtbaar en afwezig door 26 hpf8. Recent onderzoek in ons lab heeft gevonden dat, vergelijkbaar met de choroideus horizontalis, de SOS een rol in vasculaire begeleiding tijdens oog morfogenese8 speelt. Hoewel de factoren waarmee de vorming en de sluiting van de SOS nog niet volledig begrepen zijn, onze gegevens wijzen op rollen voor dorsal-ventrale oog genen8patronen.

Zebravis is een uitstekende modelorganisme te bestuderen van de SOS. Als een modelsysteem, het biedt een aantal voordelen bij het bestuderen van de ontwikkeling van het oog: het is een gewervelde model; elke generatie vertoont hoge vruchtbaarheid (~ 200 embryo's); de genoom heeft zijn gesequenced, die vergemakkelijkt genetische manipulatie; en ongeveer 70% van de menselijke genen hebben ten minste één zebrafish orthologue, waardoor het een ideale genetica gebaseerde model van ziekten bij de mens9,10. Bovenal zijn ontwikkeling plaatsvindt extern aan de moeder en haar larven zijn transparant, waardoor voor de visualisatie van het derde oog met relatief gemak11.

In deze set van protocollen beschrijven we de technieken waarmee de SOS kan worden gevisualiseerd in zebrafish larven. De verscheidenheid van visualisatietechnieken gebruikt in dit verslag kan duidelijk observatie van de SOS tijdens normaal oog ontwikkeling, alsmede de mogelijkheid om te detecteren SOS sluiting gebreken. Onze voorbeeld-protocollen zal onderzoeken van Gdf6 functie, een BMP gelokaliseerd op de dorsale oog en bekende regulator van SOS sluiting. Verder kunnen deze technieken worden gecombineerd met experimentele manipulaties om genetische factoren of farmacologische agenten die goede SOS vorming en sluiting beïnvloeden te identificeren. Daarnaast hebben wij een protocol waardoor de fluorescerende beeldvorming van alle celmembranen is mogelijk opgenomen waardoor de experimentator te observeren morfologische veranderingen aan de cellen rondom de SOS. Ons doel is om een verzameling gestandaardiseerde protocollen die kunnen worden gebruikt in de gehele wetenschappelijke gemeenschap te bieden van nieuwe inzichten in deze nieuwe structuur van het derde oog.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle methoden die hier worden beschreven zijn door de Universiteit van Alberta Animal Care en gebruik Comité goedgekeurd.

1. protocol 1: Visualisatie van SOS met behulp van stereomicroscopy en differentiële interferentie contrast (DIC) beeldvorming

  1. Embryo's worden verzameld
    1. Bereiden in een tank van dechlorinated water, kruisen van gdf6a+/- zebrafish in de avond door het koppelen van een mannelijke zebrafish met een vrouwelijke zebravissen. Zorg ervoor dat het mannetje van het vrouwtje te scheiden met behulp van een verdeler om ervoor te zorgen dat de embryo's worden geboren binnen een kleine tijdreeks.
    2. De volgende ochtend de scheidingslijn te trekken en toestaan van de zebravis te kweken voor niet langer dan 30 min. verzamelen van de embryo's in petrischalen met E3 media, beschreven in The Zebrafish boek12, en plaats ze in een 28,5 ° C incubator.
    3. Verwijder onbevruchte eieren of dode embryo's, die witte en ondoorzichtig verschijnen zal.
  2. Voorbereiding en live-imaging van zebravis embryo 's
    1. Op 20 hpf, vervangen de E3 media met E3 media met 0.004% 1-fenyl-2-thioureum (FTU) om te voorkomen dat pigment productie.
      Opmerking: Toevoeging van FTU op een iets latere timepoint, zoals 22-24 hpf, is het onwaarschijnlijk te bemoeien met het experiment vanwege de jonge leeftijd van de embryo's op het moment van beeldvorming. Het wordt echter aanbevolen voor de behandeling van de embryo's vroeg om volledig te voorkomen dat pigmentatie omdat er een band van pigmentatie die wordt weergegeven in het dorsale oog, die met de beeldvorming van de SOS interfereren kan.
    2. Ervoor zorgen dat alle embryo's bij de juiste ontwikkelingsstadia op verschillende punten in aanloop naar de tijd van waarneming. Het wordt aanbevolen dat dit in de stadia op welke Somiet nummer duidelijk zichtbaar gebeurt is zoals uiteengezet door Kimmel et al.13. Verwijderen die ontwikkelingsachterstand onvolwassen zijn.
    3. Plaats van de embryo's onder een Microscoop ontleden en dechorionate de embryo's door zachtjes trekken uit elkaar met behulp van de chorion fijne pincet. Visualiseer de SOS in het dorsale oog. De SOS kan worden weergegeven als een kuiltje op de dorsale marge van het oog en een lijn over het dorsale oog zichtbaar moet zijn. Voor normale SOS sluiting, het observeren van de embryo's op rond hpf 20-23. Voor behandeling van vertraagde SOS sluiting fenotypen, observeren de embryo's op 28 hpf of hoger.
    4. Sorteren van de embryo's die aantonen dat SOS sluiting vertraging van degenen die dat niet doen.
    5. Om de foto van deze embryo's met behulp van een Microscoop ontleden, bereiden een petrischaal met 1% agarose in E3. Licht prik het midden van het agarose om een ondiepe gat waarin de dooier van het embryo zitten kan wanneer het embryo wordt geplaatst op de agarose te maken. Dit zal ervoor zorgen dat het embryo niet onder een schuine hoek is wanneer wordt gefotografeerd.
    6. Anesthetize embryo's met 0.003% tricaïne in E3 en lateraal op de agarose.
    7. Om het beeld van de embryo's met behulp van een samengestelde of confocal microscoop, breng het embryo in 35 mm petrischaal met een kleine bolus van niet-gegeleerde 1% laag-melting point agarose in E3 (w/v). Snel plaats het embryo lateraal met behulp van een prima vislijn of een wimper en wachten op de agarose om te koelen. Zodra de agarose stevig is, giet genoeg E3 in de schotel ter dekking van het agarose. Zie voor meer details, Distel en Köster14.
      Opmerking: Als een omgekeerde microscope, het embryo kan worden geplaatst tegen het glas van een glas-dekglaasje aan onderkant schotel en beeld met een standaard 20 X objectieve lens.
    8. Gebruik een water onderdompeling 20 x objectief te visualiseren de SOS met een samengestelde microscoop. Na visualization, zachtjes trekken de agarose van de embryo's en in 4% paraformaldehyde (PFA) worden opgelost of kunnen doorgaan met hun ontwikkeling.

2. protocol 2: Geheel-mount immunefluorescentie kleuring van laminin

  1. Geheel-mount immunefluorescentie kleuring van laminin: dag 1
    1. Dechorionate embryo's zoals beschreven in stap 1.2.3, indien nog niet verricht. Embryo's vast in een microcentrifuge-buis op de gewenste timepoint in versgemaakte 4% PFA gedurende 2 uur op een shaker kamertemperatuur (22-25 ° C). Wassen in 1 x PBST voor 5 min, vier keer.
      Opmerking: Na gastrulatie, embryo's kunnen vaststellen beter na dechorionation.
    2. Permeabilize van embryo's in 10 mg/mL proteïnase K bij kamertemperatuur voor 5 min. incubatietijd hangt af van het ontwikkelingsstadium waartegen de embryo's worden opgelost (Zie Thisse en Thisse15).
    3. Wassen in 1 x PBST voor 5 min, vier keer.
    4. Blokkeren van embryo's in een oplossing van 5% geit serum en 2 mg/mL bovien serumalbumine (BSA) in 1xPBST voor 1-2 h op een kamertemperatuur shaker.
    5. Bereid primair antilichaam-oplossing door het konijn anti-laminin antistof in blok oplossing bij een verdunning 1:200 te verdunnen.
    6. De embryo's anti-laminin primair antilichaam 's nachts op een shaker 4 ° C te incuberen.
  2. Geheel-mount immunefluorescentie kleuring van laminin: dag 2
    1. Wassen in 1 x PBST voor 15 min, vijf keer.
    2. Bereid secundair antilichaam-oplossing door het verdunnen van geit anti-konijn Alexa Fluor 488 antilichaam in 1 x PBST met een verdunning van 1:1000.
      Opmerking: Het is mogelijk om te passen deze stap te passen aan de beschikbare middelen aan de experimentator met behulp van een verschillende secundair antilichaam.
    3. De embryo's secundair antilichaam 's nachts op een shaker 4 ° C te incuberen. Beschermen tegen licht zoveel mogelijk van deze stap verder.
    4. Wassen in 1 x PBST voor 15 min, vier keer. De embryo's kunnen worden achtergelaten bij 4 ° C voor maximaal een week, indien nodig.
  3. Dissectie en de montage van embryonale ogen
    1. Indien gewenst, plaatst u de embryo's in een kleine petrischaal en deyolk van de embryo's in 1 x PBST. Dit doen door voorzichtig verstoren de dooier met een fijne Tang en het verwijderen van de cellen van de dooier door het milde schrapen van de dooierzak.
    2. Voorbereiding van de volgende concentraties van PBS-glycerol reeks oplossingen in microcentrifuge buizen: 30%, 50% en 70% glycerol in PBS. Pipetteer embryo's in 30% glycerol/PBS, ervoor zorgend om de plaats van de embryo's op de top van de oplossing en de overdracht van zo weinig van de vorige oplossing mogelijk. Wacht totdat de embryo's te zinken naar de bodem van de buis.
    3. Embryo's hebben naar de bodem gezonken, kunt u deze overbrengen naar 50% glycerol/PBS. Herhaal en transfer naar 70% glycerol/PBS.
    4. Zodra de embryo's in 70% glycerol/PBS gezonken, verplaatst naar een kleine kunststof schotel voor ontledingen.
    5. Verbreken van het embryo posterieure aan de hindbrain, en gebruik het posterieure weefsel voor genotypering, indien nodig.
    6. Verplaats het hoofd naar een glasplaatje, overbrengen als weinig glycerol mogelijk. Gebruik pincet of andere fijne dissectie tools aan het achterste uiteinde op houd het hoofd stationaire vasthouden. Gebruik fijn minutien pin-code of andere fijne dissectie tools zachtjes invoegen in de ventrikel reukkolf van de anterieure en duw naar beneden naar de rechter en linker helften van het hoofd van elkaar scheiden. Herhaal dit tijdens het verplaatsen posteriorly door de veroorzaakt en in de hindbrain ventrikel, in wezen fileting het hoofd naar beneden de middellijn. Dit minimaliseert de manuele manipulatie van het oog en het omringende weefsel, waardoor de SOS onbeschadigd.
    7. Elke zijde van het hoofd middellijn naar beneden, oog opstapelen. Positie vier palen vacuüm vet op de hoeken (een juiste afstand van elkaar voor het dekglaasje aan wordt gebruikt) en dek af met een dekglaasje glas aan, omlaag drukken opeenvolgend op elke post tot het dekglaasje aan contact maakt met de monsters. Pipetteer 70% glycerol aan de rand van het dekglaasje aan zodat de glycerol wordt getrokken onder, de ruimte tussen het dekglaasje aan en de dia te vullen.
    8. De monsters van de afbeelding binnen een dag, of afdichting rond het dekglaasje aan met nagellak en beeld monsters pas na de nagellak is opgedroogd. Opslaan in het donker bij 4 ° C.

3. protocol 3: Visualisatie van gebruik van SOS eGFP-CAAX mRNA

  1. Synthese van eGFP-CAAX mRNA
    1. Linearize pCS2-eGFP-CAAX plasmide16 met kennisgevingen in een volume van de reactie van 40 mL 1 mg gedurende 4 uur bij 37 ° C.
    2. Om te stoppen met de beperking digest reactie, voeg 10 mL RNase-gratis water, 2,5 mL 10% SDS en 2,0 mL 10 mg/mL proteïnase K.
    3. Incubeer 1 uur bij 50 ° C.
    4. Voeg het volgende toe de reactie (total volume 200 mL) en gaat u verder met de volgende stap: 50 mL RNase-gratis water, 20 mL 3 M natrium acetaat pH 5.2 en 75,5 mL RNase-gratis water
      NOTE: RNase-gratis water is toegevoegd in twee afzonderlijke gelegenheden om te voorkomen dat buitensporige verdunning van de Natriumacetaat.
  2. Zuivering van DNA door middel van fenol/chloroform extractie en ethanol neerslag
    1. Voeg 200 mL fenol: chloroform: Isoamylalcohol en vortex om 20 s. aparte de waterige en biologische fasen door centrifugeren op 18.000 x g gedurende 5 minuten.
    2. De bovenste laag van waterige overbrengen in een nieuwe microcentrifuge-buis, ervoor zorgend om te voorkomen dat de overdracht van de organische onderlaag. Voeg een gelijk volume chloroform aan de nieuwe buis.
      Opmerking: Toevoeging van chloroform is optioneel, maar het is aangeraden om te zorgen voor volledige verwijdering van fenol uit het monster.
    3. Vortex om 20 s. aparte de waterige en biologische fasen door centrifugeren op 18.000 x g gedurende 5 minuten.
    4. Als voorheen, overbrengen in de bovenste laag van waterige een nieuwe microcentrifuge-buis, ervoor zorgend om te voorkomen dat de overdracht van de organische onderlaag.
    5. Het toevoegen van 1/10 volume van 3 M natrium acetaat pH 5.2.
    6. Neerslag van DNA door toevoeging van 3 volumes van 100% RNase-vrije ethanol en chill bij-20 ° C gedurende 15 min. Centrifuge bij 18.000 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. Een pellet moet worden weergegeven. Giet het supernatant.
    7. Wassen van de pellet met 100 mL koud water van 70%-ethanol/RNase-gratis. Na het mengen zachtjes te breken de pellet losse, centrifugeer bij 18.000 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C. Een pellet moet worden weergegeven. Giet het supernatant.
    8. De pellet gedurende 5 minuten drogen en resuspendeer de DNA in 7 mL water.
      Opmerking: De pellet wellicht langer dan 5 minuten afhankelijk van de luchtstroom beschikbaar worden gedroogd.
  3. Transcriptie en zuivering van eGFP-CAAX mRNA
    1. RNase-vrije wijze, door een reactie van transcriptie in vitro met een commercieel beschikbare Sp6 RNA polymerase kit, met ongeveer 1 mg van gezuiverde gelineariseerde plasmide DNA verkregen in stap 3.2 te bereiden. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C.
      Opmerking: Sp6 RNA polymerase moet worden gebruikt voor de productie van afgetopte mRNA.
    2. Voeg 1 mL DNase (2 U/mL; RNase gratis) en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
    3. Zuiveren de mRNA met alle verkrijgbare RNA zuivering kit. Aliquot de mRNA voorkomen herhaalde bevriezen-ontdooien en opslaan bij-80 ° C.
  4. Injectie en visualisatie
    1. Verkrijgen embryo's zoals beschreven in het Protocol 1.1.
    2. Met behulp van een apparaat van microinjection, injecteren 300 pg van eGFP-CAAX mRNA in het stadium 1-cel.
    3. Scherm voor embryo's met de heldere expressie van eGFP in de ogen met behulp van een stereoscoop fluorescentie.
    4. Het imago van de embryo's zoals beschreven in het Protocol 1.2.
    5. U kunt ook dechorionate en monteren van de embryo's op de gewenste timepoint in 4% PFA voor 4 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4° C. Wassen de embryo's in 1 x PBST voor 5 min, viermaal en dechorionate, indien niet eerder gedaan. Ontleden van de ogen en bevestig ze op dia's zoals beschreven in punt 2.3 van Protocol.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De zebravis SOS verschijnt op 20 hpf in de vermoedelijke dorsale netvlies8. Door 23 hpf de SOS overgang van de eerste smalle architectuur naar een breed inspringing en 26 hpf het is niet langer zichtbaar8. Daarom moeten de embryo's te onderzoeken de SOS tijdens de ontwikkeling van de ogen van de normale zebrafish, in acht te worden genomen tussen hpf 20-23. Tijdens deze periode is de SOS waarneembare via de ontleden Microscoop en DIC imaging...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een gestandaardiseerde reeks protocollen bij het observeren van de SOS in het zich ontwikkelende embryo zebrafish. Om te bepalen sluiting vertraging fenotypen, hebben onze protocollen gericht op de mogelijkheid om te onderscheiden van de scheiding van twee discrete kwabben van de dorsale-nasale en dorsale-temporele zijden van het oog, vergelijkbaar met de technieken die worden gebruikt om te visualiseren choroideus horizontalis sluiting vertraging fenotypen in het ventrale oog.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen te verklaren.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door de Canadese instituten van gezondheid onderzoek (CIHR), natuurwetenschappen en techniek onderzoek Raad (NSERC), Alberta innoveert technologie Futures, en vrouwen en Children's Health Research Institute (WCHRI).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1-fenyl 2-thioureumSigma AldrichP7629-10G
100 mm Petri schotelFisher ScientificFB0875713
35 mm Petri schotelCorningCLS430588
AgaroseBioShop Canada Inc.AGA001.1
Rundereiwit serumSigma AldrichA7906-100G
DIC/fluorescentiemicroscoopZeissAxioImager Z1
DissectiemicroscoopOlympusSZX12
Dissectiemicroscoop cameraQimagingMicroPublisher 5.0 RTV
Dow Corning Hoog-vacuümvetFisher Scientific14-635-5D
Ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaat zout (Tricaine)Sigma AldrichA5040-25G
Geit anti-konijn Alexa Fluor 488Abcamab150077
Geit serumSigma AldrichG9023
BeeldopnamesoftwareZeissZEN
IncubatorVWRModel 1545
Microscoopdekglas (22 mm x 22 mm)Fisher Scientific12-542B
MicroscoopglasFisher Scientific12-544-2
MinutiënpenFine Science Tools26002-10
mMessage mMachine Sp6 TranscriptiekitInvitrogenAM1340
NotINew England BiolabsR0189S
Paraformaldehyde (PFA)Sigma AldrichP6148-500G
Fenoel:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2Fisher ScientificBP1752-100
Proteinase KSigma AldrichP4850
Konijn anti-lamine-antilichaamMillipore SigmaL9393
TURBO Dnase (2 U/µL)InvitrogenAM2238
Ultrazuivere laagsmeltende agaroseInvitrogen16520-100
UltraPure Natriumdodecylsulfaat (SDS)Invitrogen15525017

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chow, R. L., Lang, R. A. Early eye development in vertebrates. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, (2001).
  2. Slavotinek, A. M. Eye development genes and known syndromes. Molecular Genetics and Metabolism. 104 (448-456), (2011).
  3. Gregory-Evans, C. Y., Williams, M. J., Halford, S., Gregory-Evans, K. Ocular coloboma: a reassessment in the age of molecular neuroscience. Journal of Medical Genetics. 41 (12), (2004).
  4. Onwochei, B. C., Simon, J. W., Bateman, J. B., Couture, K. C., Mir, E. Ocular colobomata. Survey of Ophthalmolgy. 45, 175-194 (2000).
  5. Williamson, K. A., FitzPatrick, D. R. The genetic architecture of microphthalmia, anophthalmia and coloboma. European Journal of Medical Genetics. 57, 369-380 (2014).
  6. Chang, L., Blain, D., Bertuzzi, S., Brooks, B. P. Uveal coloboma: clinical and basic science update. Current Opinion in Ophthalmology. 17, 447-470 (2006).
  7. Kaufman, R., et al. Development and origins of Zebrafish ocular vasculature. BMC Developmental Biology. 15 (18), (2015).
  8. Hocking, J. C., et al. Morphogenetic defects underlie Superior Coloboma, a newly identified closure disorder of the dorsal eye. PLOS Genetics. 14 (3), (2018).
  9. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Developmental Cell. 21 (1), (2011).
  10. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
  11. Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. International Journal of Developmental Neuroscience. 19, 621-629 (2001).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edition, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2007).
  13. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  14. Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
  15. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
  16. Kwan, K. M., Otsuna, H., Kidokoro, H., Carney, K. R., Saijoh, Y., Chien, C. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139, 359-372 (2012).
  17. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. Stages of Embryonic Development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  18. Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (79), e50525(2013).
  19. Percival, S. M., Parant, J. M. Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (113), e54218(2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Embryogenese van de zebravisimmunofluorescenti le kleuringmRNA overexpressiedifferentieel interferentiecontrastconfocale microscopiedissectiemicroscopielamininekleuringGFP CAX expressievertraging in de sluiting van de SOS

Gerelateerde artikelen