Microinjection-gebaseerd systeem voor In Vivo implantatie van embryonale Cardiomyocytes in het aviaire Embryo

Samenvatting

Bij deze methode zijn embryonale cardiale weefsels chirurgisch microdissected, losgekoppeld, fluorescently label en host embryonale weefsels ingeplant. Dit biedt een platform voor het bestuderen van de individu of weefsel niveau developmental organisatie onder ectopische hemodynamische voorwaarden en/of veranderde omgevingen van de paracrine/juxtacrine.

Samenvatting

Interpretatie van de relatieve impact van de autonome patronen van de cel versus extrinsieke microenvironmental invloed op cel lineage bepaling is een algemene uitdaging in Ontwikkelingsbiologie onderzoek. In het embryonale hart, kan dit met name moeilijk als regionale verschillen in de expressie van transcriptionele regelgevers, paracrine/juxtacrine signalering signalen, en hemodynamische kracht zijn alle bekende te beïnvloeden cardiomyocyte rijping. Een vereenvoudigde methode om te veranderen van een ontwikkelende cardiomyocyte moleculaire en biomechanische communicatie zou daarom dienen als een krachtige techniek om te onderzoeken hoe de lokale voorwaarden invloed cel lot en functie. Om aan te pakken dit, hebben we een methode om fysiek transplantatie jonge cardiomyocytes in ectopische locaties in het hart of de omliggende embryonaal weefsel geoptimaliseerd. Hierdoor is ons te onderzoeken hoe microenvironmental voorwaarden invloed cardiomyocyte lot overgangen bij eencellige resolutie binnen het intact embryo. Hier beschrijven we een protocol waarin embryonale myocytes kunnen worden geïsoleerd uit een verscheidenheid van cardiale sub-domeinen, losgekoppeld fluorescently label en microinjected in host embryo's met hoge precisie. Cellen kunnen vervolgens worden rechtstreeks geanalyseerd in situ met behulp van een verscheidenheid van beeldvorming en histologische technieken. Dit protocol is een krachtig alternatief voor traditionele praktijk experimenten die remmend moeilijk in een bewegende weefsel zoals het hart kan zijn. De algemene schets van deze methode kan ook worden aangepast aan een verscheidenheid van donor weefsels en host-omgevingen, en haar gebruiksgemak, lage kosten, en snelheid maken het een potentieel nuttige toepassing voor allerlei developmental studies.

Inleiding

Cardiale developmental onderzoek heeft enorm geprofiteerd van de komst van germline transgene modelsystemen waarin veel van de gene regulerende netwerken hebben vastgesteld dat patroon andere cel lineages en functionele domeinen in het hart. Identificeren kan hoe deze gene-netwerken met communiceren en op microenvironmental voorwaarden reageren, met inbegrip van paracrine/juxtacrine-signalen en biofysische ingangen (stretch, stam, hemodynamische flow), echter uitdagend. Als zodanig, is het niet altijd gemakkelijk om te bepalen of een cellulaire fenotype als een rechtstreeks gevolg van een genetische perturbation of als een secundaire gevolg van een aanpassing aan veranderingen in de cardiale biomechanica of hogere orde weefsel samenstelling^{1,2 ontstaat} .

Enten van experimenten, die klassiek om adres concepten van lot specificatie gebruikt zijn, zou inzet, inductie en competentie^3,4, een ideale aanpak omzeilen enkele van de uitdagingen die inherent zijn aan cel autonome versus milieu invloed in het hart te definiëren. Helaas, hart contracties bemoeilijken standaard praktijk benaderingen. Snelle beweging van het weefsel vaak voorkomt geënte cellen vast te houden aan het hart en grote weefsel puncties (normaal vereist voor enten) vaak leiden tot hartfalen en embryonale letaliteit^5,6,7. Daarom hebben we een druk-gebaseerd, microinjection systeem voor precisie cellulaire implantatie in het derde kuiken hart, omzeilen van de technische hindernissen weefsel enten eerder^8,9beschreven. Met behulp van deze techniek, kunnen individuele of kleine groepen van hartcellen geïsoleerd uit een embryo van de donor worden microinjected in een verscheidenheid van de regio's van een host embryonale hart eliminerend de behoefte aan uitgebreide host voorbereiding en de grote weefsel beledigingen die zich voordoen met behulp van standaard praktijk technieken. De microinjection naalden gebruikt voor deze implantatie studies hebben een buitendiameter van ~ 30−40 µm, wat betekent dat de naald direct in het doelweefsel kan worden geplaatst (dat wil zeggen, kan doordringen de embryonale myocardiale muur) en cellen kunnen focally worden geleverd met minimale schade aan het omliggende weefsel. Het protocol kan worden gebruikt voor het uitvoeren van een verscheidenheid van isotopische, heterotopic, isochoor en manipulaties van de heterochronic, die bieden een snelle, flexibele en goedkope aanpak te onderzoeken direct klassieke experimentele embryologische paradigma's in de ontwikkelingslanden vier-chambered hart.

In het protocol zoals hieronder beschreven, we label donor cellen met een cel permeant fluorescerende kleurstof, die het mogelijk voor het welslagen van een microinjection experiment maakt in real time worden gevolgd en de ligging van de werk cellen worden gedocumenteerd zonder de noodzaak voor een extra kleuring. Echter, opgemerkt moet worden dat deze aanpak is het meest geschikt voor korte termijn experimenten (ongeveer 48 h) zoals de fluorescente kleurstof verloren door celdeling worden kan. Alternatieve benaderingen kunnen worden gebruikt voor langere termijn experimenten.

Terwijl in het kader van cardiale ontwikkeling we deze techniek presenteren, zijn wij gewend het groot effect voor cel implantatie experimenten in het mesoderm, hoofd, ledematen en somieten. Als zodanig de basisbenadering hieronder beschreven is zeer hanteerbare en kan worden gebruikt in een verscheidenheid van orgaansystemen.

Protocol

Alle methodes beschreven merkvoorschriften dierenverzorgers van The University of North Carolina te Chapel Hill.

1. bereiding van micro-injectie pipetten

1. Glazen capillairen met behulp van een micropipet trekker trek. Voor sommige injecties, wordt naald Afschuining aanbevolen omdat zij een uiterst scherp oppervlak verstoken van structurele onzuiverheden vormt. Pools om dit te doen, het einde van een getrokken naald op een beveling wiel in een hoek van 45° voor 15−20 min.
   Opmerking: De exacte instellingen voor het trekken van zal variëren op basis van de trekker wordt gebruikt. De definitieve binnendiameter van de schuine kant moet tussen 20−40 µm.
2. Coat de binnenste en de externe oppervlakken van de glazen capillaire met silicone. Eerste duik de naalden in de siliconizing agent jas van het buitenoppervlak van de naald en vervolgens de backload de siliconizing agent-oplossing in elk micropipet jas van de binnenzijde.
   Opmerking: Coating van de haarvaten glas moet gebeuren 24 h vóór de implantatie-experiment. De haarvaten glas met siliconen coating biedt een chemisch inert oppervlak aan het glas. Als de haarvaten worden verlaten zal onbehandeld, de celsuspensie gegenereerd in latere stappen houden aan het glas en steek de naald. Coating is daarom noodzakelijk en essentieel voor het succes van de methode.
   Let op: De siliconizing agent is een kant en klare commercieel verkrijgbare mengsel van heptaan en 1,7-dichloorethaan-1,1,3,3,5,5,7,7-octamethyltetrasiloxane (Tabel van materialen). Het is zeer licht ontvlambaar en acuut toxisch. Altijd omgaan met goede PPE in een zuurkast.
   1. Om backload de naald, laden ~ 5−10 µL van de siliconizing agent in een micro-injectie pipette uiteinde (Tabel van materialen). Plaats het uiteinde van de micro-injectie in het brede einde van de getrokken glazen capillaire en plaats de tip zo ver naar beneden als mogelijk (dichtbij het glas naald tip). Verwijder de siliconizing agent tijdens het langzaam het verwijderen van de pipet laden om te minimaliseren van luchtbellen in de naald.
   2. Laat de siliconizing agent in de glas-naald voor 10 min, verwijderen door met een nieuwe lading pipet zuigen en laat naalden droog 's nachts in een zuurkast.
3. De ochtend van het experiment, de haarvaten glas met gedeïoniseerd water na de procedure in stap 1.2 afspoelen en laten drogen voor 3−4 h.

2. bereiding van de oplossingen

1. 5 mL trypsine oplossing te neutraliseren door aan te vullen 4.2 mL Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium en Ham van nutriënten mengsel F12 (DMEM/F12) met 750 µL van foetale boviene Serum (FBS) en 50 µL van penicilline/streptomycine voor te bereiden. Bewaren bij 37 ° C tot gebruik.
2. Bereiden van 5 µM labeling oplossing kleurstof door pipetting 5 µL van 1 mM voorraad labeling kleurstof (in dimethylsulfoxide [DMSO], Tabel of Materials) in 995 µL van Henks evenwichtig zoutoplossing (HBSS). Vortex voor 1 min en winkel bij 37 ° C tot gebruik.
3. Bereiden van verse paraformaldehyde (PFA) door het combineren van 10 mL van de stockoplossing van 32% PFA met 62 mL moleculaire biologie rang water en 8 mL van 10 x de Dulbecco-fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS). De eindconcentratie is 4% PFA in 1 x DPBS.

3. voorbereiding van de host embryo 's

1. Incubeer vruchtbare kippeneieren in een horizontale richting in een bevochtigde incubator bij 38 ° C tot Hamburger en Hamilton (HH) etappe 19¹⁰.
   Opmerking: Het podium gekozen voor manipulatie is flexibel en volledig afhankelijk van de doelstellingen van elk afzonderlijk experiment.
2. Score van de 'platte' einde van de eierschaal langs de evenaar van de ei met behulp van schuine pincet te maken van een kleine lekke band > 1 mm in diameter. Invoegen van een naald 18 G met bijgevoegde 10 mL spuit via de lekke band en verwijder ~ 5 mL albumine.
   Opmerking: Deze anatomische locatie zich buiten de "lucht cel" binnen het ei en albumine weerhoudt lekken zodra de punctie is gemaakt. Deze stap wordt aanbevolen als het "drops" het embryo uit de buurt van de eierschaal, voorkomen van mogelijke schade in de opeenvolgende stappen.
3. Het toepassen van transparante tape op de bovenkant van de eierschaal. Scoren met een schuine Tang en een ~2.5 cm venster met gebogen tenotomy schaar te knippen.
4. Inspecteren en etappe van het embryo op basis van criteria die zijn vastgesteld door Hamburger en Hamilton¹⁰ en verzegel de punctie uit stap 3.2 met transparante tape.
   Opmerking: Hier, fase HH 19 embryo's worden gebruikt die hebben 37−40 somieten uitbreiden in de kiem van de staart. Het lek worden niet verzegeld tot nadat het venster is geopend langs de bovenkant van het ei (stap 3.3).
5. ~ 200 µL van Oost-Indische inkt/HBSS mengsel (1:5) onder het embryo met behulp van een 32 G naald met bijgevoegde 1 mL spuit te injecteren.
   Opmerking: Oost-Indische inkt biedt visueel contrast tussen het embryo en de dooier onder. Alternatieve kleurstoffen zoals neutrale rode of verkrijgbare cyaan fluorescente proteïne (GVB) of blauwe fluorescerende eiwit (BFP) fluorescentie filter sets kunnen worden gebruikt om het contrast te verbeteren.
6. Voeg vervolgens 1 mL van HBSS ontkleuring op de embryonale schijf en verzegel windowed schelpen met paraffine film. Plaats de eieren terug in de bevochtigde incubator tot klaar voor de injectie.

4. isolatie van donorweefsel

1. Incubeer donor vruchtbare kippeneieren in een bevochtigde incubator bij 38 ° C tot fase HH 19 (of gewenste fase).
2. Verwijder het embryo uit het ei en plaats in een 100 x 15 mm petrischaal met steriele HBSS bij kamertemperatuur (RT).
3. Operatief microdissect atriale donorweefsel van elk embryo door eerst het gehele embryonale hart van het embryo te isoleren en vervolgens door het isoleren van de atria van het hart via pincet, schaar van tenotomy en microspatula onder een stereo microscoop ontleden. Zwembad in een steriele 1,5 mL microcentrifuge buis met 1 mL HBSS op ijs.
4. Zodra alle donorweefsel is verzameld, pellet het weefsel door centrifugeren bij 1000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C in een vaste-hoek microcentrifuge.

5. trypsine vertering van donorweefsel

1. Resuspendeer cel pellets in 1 mL voorverwarmde 0.05% trypsine-EDTA en Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 min. in een schudden warmte blok bij 300 omwentelingen per minuut. Ook gebruiken een waterbad met periodieke agitatie van het monster.
2. Pipetteer de spijsvertering oplossing op en neer te breken alle resterende weefsel, pellet zoals in stap 4.4.
3. Resuspendeer de pellet in 1 mL van de trypsine neutraliseren oplossing en centrifuge zoals in stap 4.4.
4. Resuspendeer de cellen in 400 µL van rode fluorescerende kleurstof oplossing labeling en Incubeer bij 37 ° C gedurende 20 min. in een blok van de warmte. Ook gebruiken een waterbad.
5. Zodra de labeling reactie wordt gebeëindigd, de cellen zoals in stap 4.4 pellet en wassen met 1 mL van HBSS (aantal wassen stappen kunnen gevarieerd worden tussen 1 en 3).
6. Resuspendeer de cellen van het gelabelde, Ingehuld bij een concentratie van ~ 50.000 cellen/µL, wat over het algemeen resulteert in een 5−10 µL werken volume afhankelijk van de cel Totaal rendement.
   Opmerking: Cel concentraties beneden ~ 50.000 cellen/µL kunnen resulteren in slechte injectie efficiëntie.

6. in-vivo-injectie

1. Backload de celsuspensie in een siliconen behandelde glazen capillaire pipet volgens de procedure in stap 1.2. Monteer de pipet op de druk microinjector apparaat.
2. Host embryo's uit bevochtigde incubator verwijderen en plaatsen in de houder van een ei onder de fluorescerende stereo microscoop ontleden.
   1. Open het vitelline membraan met behulp van steriele fijne pincet en maak een kleine incisie (~0.5−1.0 mm in lengte) in het hartzakje. Extra manipulatie/dissectie kan afhankelijk van doel regio voor injectie nodig zijn.
3. Plaats de microinjector zodanig dat het uiteinde van de naald microinjection het doelweefsel doordringt.
   1. Druk injecteren van cellen en de fluorescerende label gebruiken om te bepalen dat geïmplanteerde cellen in gewenste weefsel aanwezig zijn. Voor typische injecties, gelden enkele pulsen van minder dan 0,5 s in duur variërend van 100-400 hectopascal in druk.
      Opmerking: Pulslengte absolute druk zal variëren afhankelijk van het aantal cellen te worden geïnjecteerd en kan worden aangepast voor individuele behoeften.
   2. Het microinjector apparaat intrekken en verwijder het ei uit de houder na het injecteren van de druk.
4. Voeg 1 mL warme HBSS ontkleuring op het embryo, verzegelen met behulp van transparante verpakkingstape eieren en broeden in de bevochtigde incubator bij 38 ° C voor 24u post implantatie.

7. isolatie en analyse

1. Isoleren van embryo's die gastheer in RT HBSS met pincet, tenotomy schaar en microspatula vergelijkbaar met stap 4.3, en monteren in 4% PFA overnacht bij 4 ° C met zachte rockende.
2. Embryo's 3 x 5 min in HBSS op RT wassen met zacht rockende, en op te slaan in HBSS bij 4 ° C voor verder stroomafwaarts analyse (microscopie, immunohistochemistry, in-situ hybridisatie, enz.).

Resultaten

Na 24 uur incubatie, het hart en de surround weefsel van host embryo's werden geïsoleerd, gefotografeerd (Figuur 1A), en verwerkt voor immunefluorescentie analyse. In dit voorbeeld donor atriale myocytes werden microinjected in het proepicardium van een soortgelijke geënsceneerde host embryo. Het embryo van de gastheer was vervolgens gekleurd met de markering van de spier (MF20 groen) en 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; blauw). Ingespoten cellen (rood) zijn duidelijk zichtbaar (Figuur 1B). Mogelijke aanpassingen te overwegen als cellen niet zichtbaar zijn omvatten: donorweefsel was meer dan verteerd (cellen zou kunnen hechten), labeling kleurstof oplossing was ook verdund, cellen werden overdreven gewassen of meerdere celdelingen geleid tot verlies van het label.

Om te bevestigen dat de ingespoten cellen in dit voorbeeld myocardiale werden, gesegmenteerd we optisch dit embryo met behulp van een confocal microscoop (Figuur 1C-E). De enige positieve cellen van de MF20 binnen de proepicardium (PE) zijn de fluorescerende rode positieve cellen die werden focally geïmplanteerd.

Figuur 1 : Representatief beelden van embryo's geïsoleerd 24 uur bericht injectie. (A) lage vergroting helderveld beeld van de regio van de romp van een E3.5 (HH etappe 19) kuiken embryo. (B) de cellen van de samengevoegde afbeelding weergegeven: geïnjecteerd is (rood), cardiomyocytes (groen), en DAPI. Cellen werden geïsoleerd van de atria en microinjected in de proepicardium. (C) hoge vergroting confocal imaging weergegeven: label cellen in de kern van de proepicardium. (D) hoge vergroting confocal imaging cardiomyocytes bevestiging CT Red Label cellen zijn. (E) driedimensionale (3D) reconstructie van ingespoten cellen uit panelen D en E. At, atria; OFT, uitstroom tractus; PE, proepicardium; VT, ventrikel; MF20, Myosin 4. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussie

De mogelijkheid om te definiëren hoe microenvironmental voorwaarden invloed cardiale cel lot specificatie en bloedlijn stabilisatie is van fundamenteel belang voor het creëren van een druksterkte begrip van aangeboren hartziekte alsmede over de ontwikkeling van efficiënte protocollen voor goede werking rijping van de cel van de stam of somatische reprograming gebaseerde cardiomyocytes. Het protocol bovenstaande geeft onderzoekers de mogelijkheid om rechtstreeks assay cardiale cel ontwikkeling onder omstandigheden in vivo veranderde, waardoor voor cel autonome rijping processen worden gescheiden van paracrine/juxtacrine en/of hemodynamische signalen. Wanneer gecombineerd met hoge resolutie beeldvorming, genetische analyse en fysiologische tests, kan deze techniek dienen als een krachtige aanvulling op bestaande transgene modellen.

Vorm van een technische stand punt, het protocol hier gepresenteerd is afhankelijk van efficiënte isolatie, labelen en nauwkeurige implantatie van donor hart cellen in embryonale weefsels van de gastheer. Het gebruik van een systeem van microinjection sterk helpt in de doelgerichtheid van de donor cellen en zorgt voor succesvolle implantatie zonder de noodzaak voor het maken van een grote engraftment site in het weefsel van de gastheer. Sommige operationele vaardigheid is vereist voor het uitvoeren van deze techniek echter zoals verminderde levensvatbaarheid kan tot gevolg hebben als de naald van de injectie niet zorgvuldig in het doelweefsel geplaatst is (waardoor breuk van het hart of de lokale therapieën). Zorg en dacht moeten ook uitgaan naar de isolatie en labeling stappen. Over spijsvertering van de donor weefsel kan leiden tot slechte implantatie efficiëntie en labelen van technieken van voorbijgaande aard kan beperken het venster van de tijd waarover donor cellen kunnen worden getraceerd (als celdeling het etiket verdunnen kan).

Deze techniek is zeer aanpasbaar en kan worden aangepast voor verschillende doeleinden. Bijvoorbeeld, worden donor cellen uit een groot aantal weefsels en fasen kunnen worden geïsoleerd (hoewel de optimalisatie van de enzymatische spijsvertering is vereist) en kan ook in een verscheidenheid van host weefsels in verschillende stadia van ontwikkeling ingespoten. Ook kan de labeling aanpak worden aangepast voor het bijhouden van cellen over verschillende temporele Vensters, met inbegrip van het gebruik van fluorescerend anorganische halfgeleiders nanokristallen voor het labelen van de meer vluchtige en implantatie van kwartel cellen of van cellen uit groen fluorescent proteïne transgene (GFP +) donor embryo's¹¹ voor het labelen van de permeant.

Terwijl we momenteel deze techniek voor aviaire implantatie studies gebruikt, zijn wij van mening dat het kan worden gebruikt voor een groot scala aan chimeer studies in de toekomst. Bijvoorbeeld kunnen genetisch gemanipuleerde hartcellen van transgene organismen worden geïsoleerd en microinjected in het aviaire hart met een vergelijkbaar protocol. Bovendien cellen onderscheiden in cardiomyocytes van stengels van cellen of via somatische reprograming benaderingen kunnen worden microinjected in de embryonale hart om te evalueren van hun integratie in het weefsel en/of de rijping onder in vivo biomechanische voorwaarden.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 mL Insulin Syringe	BD	329654
1.7 mL Microtubes, Clear	Genesee Scientific	24-282
10 ml Syringe	BD	305482
1000ul Reach Barrier Tip Racked, Sterile	Genesee Scientific	24-430
15 mL Centriguge Tubes, Racked	Genesee Scientific	28-101
1588 Genesis Hova-Bator Incubator	GQF	813927021221
18G x 1 1/2 Needle	BD	305196
200ul Barrier Tip Low Binding, Racked, Sterile	Genesee Scientific	24-412
32G x 1/2" Needle	TSK Steriject Air-Tite	TSK3213
Alchohol Wipes 70%	Thermo Fisher Scientific	19015744
Angled Forceps	Fine Scientific Tools	11260-20
Backloading Tips	Eppendorf	930001007
Black India Ink	KOH-I-NOOR	3084-F
CellTracker Green CMF	Thermo Fisher Scientific	C7025	1 mM in DMSO
CellTracker Red CMTPX	Thermo Fisher Scientific	C34552	1 mM in DMSO
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Commercial Grade Packing Tape	Staples	2619001
Curved Tenotomy Scissors	Fine Scientific Tools	14067-11
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11330-032
DMSO, anhydrous	Thermo Fisher Scientific	D12345
DPBS (10X), no calcium, no magnesium	Thermo Fisher Scientific	14025092
Femtojet 4i	Eppendorf	5252000021
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10437-028
Hatching Eggs	Pilgrim's Hatchery	--
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	14025-092
Injectman 4	Eppendorf	5192000027D
Micromanipulator	Leica Microsystems	--
Parafilm	SIGMA	P6543-1EA
Paraformaldehyde 32% in aqueous solution, EM Grade	VWR	100496-496
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-022
Petri Dish	Genesee Scientific	32-107
Pipette Grinder	Narishige	EG-44
Pipette Puller	HEKA	PIP 6
Scotch Transparent Tape	Staples	487909
Sigmacote	SIGMA	SL2-25ML
Stereo Microscope	Leica	--
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000023
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-4
Transfer Pipette	Thermo Fisher Scientific	273
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300-054