Driedimensionale bot extracellulaire Matrix Model voor Osteosarcoom

Summary

Hier is het bot extracellulaire matrix (BEM) model voor Osteosarcoom (OS) gevestigde en getoond. Het kan worden gebruikt als een geschikte steiger voor nabootsen van primaire tumor groei in vitro en bieden een ideaal model voor het bestuderen van de histologische en cytogenic heterogeniteit van OS.

Abstract

Osteosarcoom (OS) is de meest voorkomende en een zeer agressieve primaire bot tumor. Het wordt gekenmerkt met anatomische en histologische varianten samen met diagnostische of prognostische moeilijkheden. OS omvat genotypisch en fenotypische heterogene kankercellen. Bot communicatie elementen blijkt rekening voor de heterogeniteit en ziekte progressie van de tumor. Bot extracellulaire matrix (BEM) behoudt de microstructurele matrices en biochemische onderdelen van inheemse extracellulaire matrix. Dit weefsel-specifieke niche biedt een gunstige en lange steiger voor OS cel zaaien en proliferatie. Dit artikel bevat een protocol voor de bereiding van BEM model en de verdere experimentele toepassing. OS cellen kunnen groeien en differentiëren in meerdere fenotypen consistent met de histopathologische complexiteit van OS klinische monsters. Het model maakt het ook mogelijk visualisatie van uiteenlopende morphologies en hun associatie met genetische veranderingen en onderliggende regulerende mechanismen. Als homoloog aan menselijke OS, kan dit model BEM-OS worden ontwikkeld en toegepast op de pathologie en klinisch onderzoek van OS.

Introduction

Osteosarcoom (OS) treedt meestal op in de actief groeiende gebieden, de metaphysis van lange beenderen, tijdens de adolescentie. Meer dan 80% van de sites die getroffen zijn door OS hebben voorkeur voor de metaphysis van proximale tibia, evenals proximale humerus en zowel de distale als de proximale dijbeen, overeenkomt met de locatie van de groei plaat¹. OS bestaat uit meerdere subtypes van de cel met mesenchymale eigenschappen en aanzienlijke verscheidenheid is in histologische kenmerken en rang. Bewijzen ondersteunen mesenchymale stamcellen (MSCs), botcellen gepleegd precursoren en pericytes als de cellen van oorsprong^2,,^3,,^4,5 Deze cellen kunnen accumuleren genetische of epigenetische veranderingen en aanleiding geven tot OS onder invloed van bepaalde microenvironmental signalen van bot. Zowel intrinsieke en extrinsieke mechanismen leiden tot de instabiliteit van het genoom en de heterogeniteit van OS, met meerdere morfologische en klinische fenotypen^6,7. Voor geïndividualiseerde therapieën of screening van nieuwe geneesmiddelen moeten nieuwe modellen worden gegenereerd om tegen heterogeniteit of andere klinische aandoeningen.

OS is een intra werden kwaadaardige solide tumor. De complexiteit en de activiteit van het omringende communicatie elementen verlenen fenotypische en functionele verschillen op OS cellen op verschillende locaties van een tumor. Bot extracellulaire matrix (BEM) voorziet in een structurele en biochemische steiger minerale afzetting en bot remodeling. Het organische gedeelte van extracellulaire matrix (ECM) bestaat voornamelijk uit type I collageen uitgescheiden door osteoblastic lineage cellen, terwijl haar gemineraliseerde gedeelte uit calciumfosfaat in de vorm van hydroxyapatiet^{8 bestaat}. De dynamische rol van ECM netwerken is het reguleren van de cel adhesie, differentiatie, cross-talk en weefsels functie onderhoud⁹.

Gedemineraliseerd BEM en ECM hydrogels zijn met succes gebruikt in de cultuur van de cel en cel proliferatie^10,11kunt verbeteren. Gesynthetiseerde bot-achtige ECM kunt regelen de grootte van het zwembad, lot besluiten en bloedlijn progressie van MSCs^12,13,14. Bovendien bewijzen de resultaten zijn klinische betekenis om osteogenic activiteit door stimulerende cellulaire processen tijdens bot vorming en regeneratie^15,16,17.

In dit artikel stelt onze fractie een gemodificeerde model en gunstige alternatief voor driedimensionale langetermijnkweek. OS cellen geïnjecteerd in de BEM weefsel afkomstige presenteren een ongelijkmatig mesenchymale fenotype gemakkelijk in vergelijking met plastic tweedimensionale culturen. BEM afgeleid van site-specific homologe weefsel Toon haar dramatische voordeel zoals een native niche voor OS in vitro cellen en heeft een groot potentieel in OS theoretisch en klinisch onderzoek. Dit gekarakteriseerd BEM-platform is eenvoudig, maar efficiënt voor in vitro onderzoek en in het modelleren van meerdere kankers kan worden verlengd.

Protocol

Verzorging van de dieren en het gebruik worden uitgevoerd volgens de nationale instituten van gezondheid gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren (NIH publicatie NO.80-23, herzien in 1996) na goedkeuring van het dier ethiek Comité van zon Yat-sen-universiteit.

1. been voorbereiding

1. Verkrijgen van 4 tot 6 weken oude BALB/c muizen (zonder geslacht-specifieke eis). Een muis aseptisch euthanaseren door cervicale dislocatie en afgesneden verse kuitbeen, scheenbeen en het dijbeen van een stuk met een steriele chirurgische schaar. Afschilferen van de epitheelweefsel en Verwijder zo veel van het zachte weefsel mogelijk met behulp van schaar en pincet.
2. Spoel de been botten met steriele 10 mM fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tweemaal om bloed in een 6 cm schotel. De botten in 75% ethanol voor 3 min. onderdompelen en spoel tweemaal met PBS. De schone botten kunnen worden opgeslagen in een centrifugebuis steriele 50 mL met steriel PBS-80 ° c voor maanden totdat vereist.
   Opmerking: PBS gebruikt in alle volgende stappen heeft 10 mM PO₄³⁻.

2. bone demineralisatie en decellularization

1. De bevroren botten op kamertemperatuur ontdooien en dan bevriezen weer bij-80 ° C voor 1 h. de botten aan meer dan 2-3 bevriezen-ontdooien cycli voor cel lysis en weefsel analyse onderworpen.
2. Incubeer de botten in een centrifugebuis steriele 50 mL met 0,5 N HCl's nachts bij kamertemperatuur op een rockende platform of orbital shaker met zachte wiegen/schudden om te zorgen voor volledige en zelfs dekking van botten.
   Opmerking: Zorg ervoor dat de botten worden volledig ondergedompeld tijdens beweging in het zuur en neem geen genoegen tijdens het proces. De hoeveelheid zoutzuur moet meer dan tien keer als die van de beenderen.
3. Na ontkalking, decanteren in de HCl-oplossing volledig en spoel onder stromend water gedurende 1 uur. Vervolgens wassen de botten tweemaal voor 15 min per wasbeurt met gedestilleerd water op een rockende platform of orbital shaker.
   Opmerking: Zorg ervoor dat de oplossing of het water tussen de wasbeurten en na de laatste wasbeurt met gedestilleerd water volledig te verwijderen.
4. Pak de lipiden in de gedemineraliseerd botten met een 1:1 mengsel van methanol en chloroform in een tube van 50 mL centrifuge omwikkeld met aluminiumfolie gedurende 1 uur bij kamertemperatuur¹⁰.
5. Vervolgens overdracht de botten in een andere buis van methanol omwikkeld met aluminiumfolie voor 30 min. volledig verwijderen van de methanol en naspoelen met gedestilleerd water tweemaal voor 15 min met voorzichtig schudden. Definitieve waswater decanteren en verder met de volgende stappen onder steriele toestand.
   Opmerking: Tijdens de extractie stap, licht moet vermeden worden om te voorkomen dat chloroform ontleding. Het mengsel kan worden opgeslagen in licht-resistente container of een centrifugebuis omwikkeld met aluminiumfolie. Het uitvoeren van alle behandeling en wassen stappen onder bescheiden rotatie of beweging schommelen.
6. Spoel de botten in een 6 cm schotel met steriel PBS gedurende 3 minuten, en breng de botten in een nieuwe centrifuge-tube van 50 mL. Voeg 40 mL steriele 0,05% trypsine-EDTA (TE) in de buis en incubeer beenderen voor 23 h in een CO₂ incubator bij 37 ° C¹⁸.
7. De oplossing TE negeren en spoel tweemaal met steriel PBS aangevuld met 90 μg/mL ampicilline en 90 μg/mL kanamycine. Na de finale decanteren wassen PBS volledig, met 40 mL steriele PBS te vullen. Was grondig gedurende 24 uur bij kamertemperatuur met zachte wiegen of schudden voor antibiotica weken.
   Opmerking: Alle van de steriele PBS gebruikt in dit en de volgende stappen bevat 90 μg/mL ampicilline en 90 μg/mL kanamycine. 'S nachts wassen onder rotatie of beweging schommelen worden uitgevoerd voor de grondige onderdompeling lange periodes met antibiotica om doeltreffende sterilisatie van porie ruimten.
8. Verwijderen van de PBS en breng de botten in een centrifugebuis van de verse 50 mL gevuld met steriel PBS. De klaargemaakte gedemineraliseerd en decellularized botten heten bot extracellulaire matrix (BEM) en kunnen worden achtergelaten bij 4 ° C voor 2 maanden totdat vereist.

3. cel zaaien en cultuur

1. Neem de BEM uit koelkast 4 ° C en dompel het in 75% ethanol voor 30 s, dan spoelen met PBS tweemaal. Overdracht van de BEM op een bord schoon 6-well cel cultuur. Voeg toe 2 mL volledige kweekmedium (Dulbecco van gewijzigd Eagle's medium/F12 (DF12) met 5% foetale runderserum, 90 μg/mL ampicilline en 90 μg/mL kanamycine). Incubeer de BEM overnachting in een CO₂ incubator bij 37 ° C.
2. Het verkrijgen van menselijke cellijnen van de OS (MNNG/HOS en MG-63). Schorten ongeveer 1,0 x 10⁵ OS cellen met 100 μl PBS met fenol rood als indicator.
   Opmerking: Om beter te volgen en observeren van meerdere lagen cellen binnen het driedimensionale BEM-model, MNNG/HOS en MG-63 zijn besmet met lentivirale vector uiting van fluorescerende mCherry en groen fluorescente proteïne (GFP).
3. Nadat de BEM volledig in het medium gedrenkt is, injecteren OS cellen BEM uit proximaal of DISTAAL epiphysis wanneer de naald de Wallenberg holte van BEM bereikt. Incubeer de OS-BEM model voor een minimum van 2 h in een bevochtigde 5% CO₂ atmosfeer bij 37 ° C om de cellen geïnjecteerd stevig vasthouden aan BEM.
   Opmerking: Pre warm alle media gebruikt voor celkweek. De incubator gebruikt voor cultuur van de cel heeft een bevochtigde 5% CO₂ atmosfeer bij 37 ° C.
4. Voeg 1 mL volledige voedingsbodem in de plaat volledig jas het oppervlak van de cultuur van de BEM overnachting in een CO₂ incubator bij 37 ° C.
5. Pipetteer zachtjes het OS-BEM-model in een nieuwe put van 6-well plaat met een steriel pincet en bijvoeding 1 mL verse kweekmedium. Cultuur van het model voor 14 dagen in een CO₂ incubator bij 37 ° C en vernieuw het kweekmedium volgens de situatie van de proliferatie van cellen van het OS.
6. Houd controle van middellange kleur en cel status onder de omgekeerde fluorescentie Microscoop tijdens het proces van de cultuur. Wanneer OS cellen naar plaat uitbreiden, zachtjes overbrengen in de OS-BEM-model een andere nieuwe goed met steriel pincet.
   Opmerking: Het kweekmedium is helder rood bij pH 7.4, dat is de optimale pH-waarde voor de cultuur van de cel van de meeste zoogdieren. Als het medium in oranje of zelfs geel verandert, onmiddellijk vernieuwen het medium te handhaven van een gezond milieu voor OS cellen.
7. Breng het OS-BEM-model in een nieuwe put met een pincet en voorzichtig spoelen met PBS te verwijderen het kweekmedium. Vervolgens breng kwantitatief over in een centrifugebuis 15 mL en repareren met 10% gebufferd formaline voor histologisch identificatie.

Results

Na demineralisatie en decellularization lijkt BEM te zijn doorschijnend met sterkere veerkracht en vasthoudendheid in vergelijking met inheemse muis bot. Een kleine residu van de spier en de ruimte van Wallenberg spouw kunnen duidelijk worden waargenomen (Figuur 1A, B). Om te bepalen van de effectieve decellularization van BEM, is BEM ingesloten in paraffine na fixatie, en vervolgens gesneden in 3 – 5 μm secties voor Haematoxyline-eosine-kleuring (H & E). De grondige verwijd...

Discussion

In het algemeen, OS kan worden geclassificeerd als osteoblastic, chondroblastic, en fibroblastic subtypen afhankelijk van haar dominante histologische component. De prognose is niet alleen afhankelijk zijn voor histologische parameters maar ook op haar anatomische plaats. Het kan optreden in de botten (in de intramedullaire of intracortical compartiment), op de oppervlakken van botten, en met extraosseous sites¹⁹. Het ontstaan en de heterogeniteit van OS kunnen worden toegelicht als een vervoeging ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL centrifuge tube	Greiner	188271
50 mL centrifuge tube	Greiner	227270
6 cm cell culture dish	Greiner	628160
6-well plate	Greiner	657160
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9393
C57-BL/6J muis	Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center
CO2 incubator	SHEL LAB	SCO5A
Dibasic sodium phosphate	Guangzhou Chemical Reagent Factory	BE14-GR-500G
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D0547
Fetaal bovien serum	Hyclone	SH30084.03
Hemocytometer	BLAU	717805
Kanamycin	Sigma-Aldrich	PHR1487
MG-63	Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank		Human osteosarcoma cell line
MNNG/HOS	Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank		Human osteosarcoma cell line
Phenol red	Sigma-Aldrich	P4633	Een oplossing van fenolrood wordt gebruikt als pH-indicator: de kleur vertoont een geleidelijke overgang van geel naar rood over het pH-bereik van 6,6 tot 8,0.
Kaliumchloride	Sangon Biotech	A100395
Kaliumfosfaat monobasisch	Sangon Biotech	A501211
Natriumchloride	Sangon Biotech	A501218