Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie, vermeerdering en Prion eiwituitdrukking tijdens neuronale differentiatie van stamcellen van menselijke tandmerg

7.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/59282

⸱

18 maart 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Experimental Medicine and Environmental Pathology, Sabina Universitas - Rieti University Hub, 2Department of Experimental Medicine, Sapienza University of Rome, 3Department of Science Dentistry and Maxillofacial, Sapienza University of Rome

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor menselijke tandheelkundige Pulp stamcellen isolatie en vermeerdering teneinde het prion-eiwit expressie tijdens neuronale differentiatie.

Samenvatting

Bio-ethische kwesties in verband met de manipulatie van embryonale stamcellen hebben belemmerd vooruitgang op het gebied van medisch onderzoek. Om deze reden is het zeer belangrijk voor het verkrijgen van volwassen stamcellen uit verschillende weefsels zoals adipeus, bloed, navelstrengbloed en beenmerg. Onder de mogelijke bronnen is tandmerg bijzonder interessant omdat het is gemakkelijk te verkrijgen met betrekking tot bio-ethische overwegingen. Inderdaad, menselijke tandheelkundige Pulp stamcellen (hDPSCs) zijn een soort van volwassen stamcellen kunnen onderscheiden in neuronale-achtige cellen en kan worden verkregen bij de derde Kies voor gezonde patiënten (13-19 leeftijden). In het bijzonder werd het tandmerg verwijderd met een graafmachine, snijd in kleine plakjes, behandeld met collagenase IV en gekweekt in een maatkolf. Om de neuronale differentiatie, werden hDPSCs gestimuleerd met EGF/bFGF voor 2 weken. Eerder, hebben wij aangetoond dat tijdens de differentiatie wordt de inhoud van cellulaire prion eiwit (PrPC) in hDPSCs verhoogd. De cytofluorimetric-analyse toonde een vroege uiting van PrPC dat na het proces van de neuronale differentiatie is toegenomen. Ablatie van PrPC door siRNA PrP voorkomen neuronale differentiatie geïnduceerd door EGF/bFGF. In deze paper illustreren we dat als we het isolement, de scheiding en de in vitro cultivatie-methoden van hDPSCs met verschillende eenvoudige procedures versterkt, efficiënter cel klonen verkregen en grootschalige uitbreiding van de mesenchymale stamcellen (MSCs werden) werd waargenomen. Ook laten we zien hoe de hDPSCs, verkregen met methoden die zijn beschreven in het protocol, zijn een uitstekend experimenteel model om het proces van de neuronale differentiatie van MSCs en latere cellulaire en moleculaire processen te studeren.

Inleiding

Mesenchymale stamcellen zijn geïsoleerd uit verschillende weefsels, met inbegrip van het beenmerg, navelstrengbloed, menselijke tandmerg, adipeus weefsel en bloed1,2,3,4,5 , 6. zoals gemeld door verschillende auteurs, hDPSCs kunststof hechting, een typische morfologie van de fibroblast-achtige Toon. Deze vertegenwoordigen een zeer heterogene populatie met verschillende klonen en verschillen in proliferatieve en onderscheidende capaciteit7,8. hDPSCs express specifieke markers voor mesenchymale stamcellen (d.w.z. CD44 CD90, CD73, CD105, STRO-1), ze zijn negatief voor sommige hematopoietische gegevensmarkeringen (bijvoorbeeld in CD14 en CD19) en zijn geschikt voor in-vitro differentiatie van de multilineage9, 10,11.

Verschillende auteurs hebben aangetoond dat deze cellen zijn bekwaam om te onderscheiden in neuron-achtige cellen met behulp van verschillende protocollen, waaronder de toevoeging van de NGF, bFGF, EGF in combinatie met de specifieke media en supplementen7,12. Ook veel eiwitten zijn betrokken neuronale differentiatie tijdens, en daaronder verscheidene papers Toon een relevante rol en aanzienlijke expressie van cellulaire prion-eiwit PrP (C), beide in embryonale en volwassen stamcellen13, 14. PrPC vertegenwoordigt een pleiotropic molecuul staat van het uitvoeren van verschillende functies binnen cellen als koper metabolisme, apoptosis, en weerstand tegen oxidatieve stress15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22.

We onderzochten in onze eerdere papier23, de rol van PrPC in het proces van de neuronale differentiatie hDPSCs. In feite, hDPSCs express precociously PrPC en, na de neuronale differentiatie, was het mogelijk om een extra verhoging van observeren. Andere auteurs hypothetische een mogelijke rol van PrPC in processen van de neuronale differentiatie van stamcellen. Inderdaad, PrPC drijft de differentiatie van menselijke embryonale stamcellen in neuronen, oligodendrocyten en de astrocyten24. Het doel van deze studie was om te benadrukken de methodologie voor het verkrijgen van stamcellen van tandmerg, zijn differentiatie-proces en de rol van PrPC tijdens neuronale differentiatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Derde kiezen gebruikt in de studie werden weggesneden uit patiënten (13-19 jaar) met geen voorafgaande geschiedenis van drugs- of alcoholgebruik, alle niet-rokers en passende mondhygiëne. Op de dag van de uitleg, bij het departement wetenschap tandheelkunde en Maxillofacial van "Sapienza" Universiteit van Rome, was geïnformeerde toestemming verkregen van de patiënt of de ouders. Geïnformeerde toestemming werd verkregen op basis van ethische overwegingen en goedkeuring van de ethische commissie.

1. tand en tandmerg extractie

  1. Voorbereiding van geschikte voedingsbodem voor de instandhouding of het vervoer.
    1. Bereiden van Dulbecco bewerkt Eagle's medium lage concentratie van glucose (DMEM-L) met L-glutamine (494.5 mL).
    2. Voeg 5 mL penicilline/streptomycine (1%) en 0,5 mL amfotericine (0,1%).
  2. De derde Kies extract van de patiënt, snel spoelen met PBS, zet in een tube van 15 mL test met het medium en overbrengen naar het laboratorium in minder dan 2 h.
  3. Onder de motorkap van een biohazard, open de tand met een kotter bij coronale snijden doorgang parallel en tangent door het dak van de pulp kamer.
  4. Zachtjes Verwijder het vruchtvlees met een kleine graafmachine en plaats deze in een reageerbuis.
  5. Wassen met PBS driemaal samen en centrifugeer bij 2.500 x g gedurende 10 minuten op RT.

2. de verwerking van het tandmerg en de introductie van de cel van de stam

  1. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in Hank's oplossing plaatst u deze in een petrischaal. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C in 5% CO2.
  2. Typ IV collagenase oplossing voorbereiding.
    1. Bereiden van 0,8 mL van DMEM-L.
    2. Smelten van 1 mg van type IV collagenase in 0,8 mL DMEM-L en vortex gedurende enkele minuten.
    3. Toevoegen van DMEM-L hebben een eindconcentratie tot 1 mL 1 mg/mL.
    4. Filtreer de oplossing met een 0,22 µM filter.
  3. Verwijderen van Henks oplossing door centrifugatie bij 2.500 x g gedurende 10 minuten bij RT en verdelen van de pulp in kleine plakjes ongeveer 1 mm van elkaar met een disposable scalpel.
  4. Plaats van de segmenten van de pulp in een petrischaal en incubeer met 1 mL van type IV collagenase gedurende 15 minuten bij 37 ° C in 5% CO2.
  5. Middellange cultuur voorbereiding (500 mL).
    1. 445 ml DMEM-L met L-glutamine.
    2. Voeg 50 mL van foetale runderserum (FBS) (10%).
    3. Voeg 5 mL penicilline/streptomycine (1%).
  6. Centrifugeer het monster bij 2.500 x g gedurende 10 minuten op RT, verwijder de bovendrijvende substantie, resuspendeer de pellet in het medium (stap 2.5) en cultuur in T25 kolf specifiek voor stamcel bij 37 ° C in 5% CO2.

3. de cel van de stam cultuur en vermeerdering

  1. Elke dag Controleer de cultuur en na 3 dagen van de groei, het observeren van verschillende klonen van Adherente cellen binnen de kolf.
  2. Om de 3 dagen wijzigen het kweekmedium.
  3. Tussen 7 en 12 dagen, eenmaal de Adherente cellen bereik samenvloeiing, loskoppelen hen door de behandeling van de cellen met 1 mL trypsine-EDTA gedurende 3 minuten bij 37 ° C of voorzichtig met behulp van een cel schraper.
  4. Voeg 4 ml (verhouding 1:5) van het kweekmedium (stap 2.5) om trypsine actie te stoppen.
  5. Centrifugeren van de celsuspensie voor 6 min bij 259 x g, verwijder het supernatant en plaats van de cellen in een maatkolf van T25 doorgeven.
    Opmerking: Om de 3 dagen de cellen bereiken samenvloeiing.
  6. Het propageren van de cellen tot 21 of 28 dagen (ongeveer 6-8 passages) de aanwezigheid van niet-stam als cellen in de cultuur te voorkomen.
  7. Loskoppelen van de cellen met 1 mL trypsine-EDTA gedurende 3 minuten bij 37 ° C of voorzichtig afschrapen. De celsuspensie voor 6 min bij 259 x gcentrifugeren.
  8. Verwijder het supernatant en testen van de cellen voor cytofluorimetric analyse (stap 6).

4. Pre-steady PrPC Silencing door siRNA

  1. Cultuur van de hDPSCsin 6-Wells-platen (2 x 105 cellen/mL) met 2 mL gestolde voedingsbodem (stap 2.5) gedurende 24 uur.
  2. Overmorgen, bereiden siRNA PrP medium (400 µL).
    1. Voeg aan een steriele reageerbuis, 384 µL DMEM-L.
    2. Voeg 1 µL voor elk type van siRNA PrP naar DMEM-L om een eindconcentratie van 5 nM (4 siRNA PrP werden gebruikt en geverifieerd door de leverancier te waarborgen van een vechtpartij efficiëntie ≥70%).
    3. Voeg 12 µL van transfectionreagent naar DMEM-L.
    4. Vortex het mengsel en incubeer gedurende 10 min op RT dat de vorming van transfectie complexen.
  3. 400 μL van siRNA PrP medium toevoegen aan elk monster en incubeer gedurende 6 uur bij 37 ° C.
  4. Voeg zonder teruggooi siRNA PrP medium, 1.6 mL (verhouding van 1 tot en met 5) kweekmedium (stap 2.5).
  5. Laat de cellen gedurende 72 uur bij 37 ° C.
  6. Verwijder het supernatant en was 3 keer met 2 mL PBS op RT.
  7. Voeg 2 mL neuronale kweekmedium voor 7 en/of 14 dagen (stap 5.1).
  8. De neuronale kweekmedium elke 3 dagen wijzigen.
    Opmerking: Vervang de siRNA PrP oplossing elke keer vervangen de neuronale kweekmedium.
  9. Aan het einde van de tijd, was 3 keer met 2 mL PBS op RT en test voor neuronale oppervlakte antigenen door analyse van de Western Blot.

5. de neuronale inductie proces van hDPSCs

  1. Neuronale kweekmedium voorbereiding (500 mL).
    1. Voorbereiden 444.7 mL van basale media geformuleerd naar neuronale cellen.
    2. Voeg 50 mL van serumvrij supplement gebruikt ter ondersteuning van de levensvatbaarheid op lange termijn van embryonale en volwassen neuronale stamcellen (10%) op het medium.
    3. 200 µL van fundamentele Fibroblast Growth Factor (bFGF) (eindconcentratie 40 ng/mL) en 100 µL van de epidermale groeifactor (EGF) toevoegen aan het medium (eindconcentratie 20 ng/mL).
    4. Voeg 5 mL penicilline/streptomycine (1%) aan het medium.
  2. Cultuur hDPSCs in 6-Wells-platen (2 x 105 cellen/mL) tot 28 dagen van de scheiding van de pulp en hen te stimuleren met 2 mL neuronale kweekmedium.
  3. Om de 3 dagen Verwijder het supernatant, was 3 keer met 2 mL PBS op RT en vervangen van 2 mL van de neuronale voedingsbodem.
  4. Na 7 en/of 14 dagen, loskoppelen de cellen met 1 mL trypsine-EDTA gedurende 3 minuten bij 37 ° C of zachtjes met een schraper.
  5. Voeg 4 mL (verhouding 1:5) van kweekmedium (stap 2.5) om trypsine actie te stoppen.
  6. Testen op de aanwezigheid van neuronale oppervlakte antigenen (stap 6) of het prion-eiwit expressie (stap 7) door stroom cytometry analyse.

6. karakterisering van hDPSCs door Stroom Cytometry

  1. Selecteer mesenchymale stromale (MSC)-specifieke of neuronale oppervlakte antigenen.
  2. Cultuur van de hDPSCs in 6-Wells-platen (2 x 105 cellen/mL) met 2 mL gestolde voedingsbodem (stap 2.5).
  3. Loskoppelen hDPSCs na 28 dagen vanuit tandmerg scheiding of na 14 dagen van neuronale kweekmedium (stap 5.1) met 1 mL trypsine-EDTA gedurende 3 minuten bij 37 ° C of zachtjes schraper.
  4. Voeg 4 ml (verhouding 1:5) van kweekmedium (stap 2.5) om trypsine actie te stoppen en centrifugate op 259 x g voor 6 min op RT. wassen andere 2 keer met 2 mL PBS op RT.
  5. Herstellen van de hDPSCs onbehandeld of behandeld met 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
  6. Permeabilize hDPSCS met 0,1% (v/v) niet-ionogene oppervlakteactieve stof in PBS voor extra 10 min op RT.
  7. Uitvoeren van de afscherming met 5% nonfat melkpoeder in 1 mL PBS voor 1 h op RT.
  8. Was 3 keer met 1 mL PBS en Incubeer de cellen met anti-CD105 (1:100 / 5 x 105 cellen), anti-CD44 (1:100 / 5 x 105 cellen), anti-STRO-1 (1:100 / 5 x 105 cellen), anti-CD90 (1:100 / 5 x 105 cellen), anti-CD73 (1:100 / 5 x 105 cellen), anti β3-tubuline (1:100 / 5 x 105 cellen), anti-NFH (1:100 / 5 x 105 cellen) en anti-GAP43 (1:100 / 5 x 105 cellen) mAb gedurende 1 uur op RT.
  9. Spoel de cellen 3 keer met 1 mL PBS en incubeer met anti-muis PE (1:50 / 5 x 105 cellen) of anti-konijn CY5 (1:50 / 5 x 105 cellen) mAb voor extra 1 h op RT.
  10. Gebruiken van de secundaire antilichamen voor de cellen van de immunopositive (anti-muis PE of anti-konijn CY5 mAb) gating en analyseren van alle monsters met een stroom cytometer en verwerven van minstens 20.000 gebeurtenissen.

7. evaluatie van PrPC expressie in hDPSCs door Stroom Cytometry analyse

  1. Cultuur van de hDPSCsin 6-Wells-platen (2 x 105 cellen/mL) met 2 mL gestolde voedingsbodem (stap 2.5).
  2. Ontkoppelen van hDPSCs op 21 en 28 dagen van tandmerg scheiding en na 7 en/of 14 dagen met neuronale kweekmedium (stap 5.1) met 1 mL trypsine-EDTA en stoppen van de trypsine actie, zoals beschreven in stap 6.4. Herstellen van de specimens met 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
  3. Permeabilize met 0,1% (v/v) niet-ionogene surfactantin PBS voor 10 min op RT. Verwijder het supernatant en vlekken van de cellen met konijn anti-PrP mAb EP1802Y (1:50 / 5 x 105 cellen) mAb gedurende 1 uur op RT. Incubate met anti-konijn CY5 (1:50 / 5 x 105 cellen) mAb voor extra 1 h op RT.
  4. Analyseren van alle monsters met een stroom-cytometer en het verwerven van minstens 20.000 gebeurtenissen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De procedures voor isolatie en afscheiding van de hDPSCs van tandmerg, verkregen uit de derde kies, zijn complexe processen waarin kleine veranderingen een ruïneuze resultaat kan leiden. In dit document gebruiken we het protocol van Arthur et al.. 12 met verschillende verbeteringen. Een representatieve stelsel van procedures is afgebeeld in Figuur 1.

hDPSCs vertegenw...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit werk, we gericht op methodologie voor isolatie en neuronale differentiatie van hDPSCs; we geëvalueerd bovendien de rol van PrPC in dit proces. Er zijn verschillende methoden om te isoleren en hDPSCs in neuron-achtige cellen en kritische stappen onderscheiden tijdens het proces. hDPSCs zijn bekwaam om te onderscheiden in verschillende geslachten zoals chondroblasts, adipocytes, botcellen en neuronen. In onze papier onderzochten we de mechanismen voor Neuronale Differentiatie en de aanwezigheid van PrP

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door de "Fondazione Varrone" en Rieti Universiteit Hub "Sabina Universitas" aan Vincenzo Mattei.

Figuur 5 (A, B) herdrukt met toestemming van de uitgever, Taylor & Francis Ltd uit: rol van Prion-eiwit-EGFR multimolecular complex tijdens neuronale differentiatie van menselijke tandheelkundige pulp-afgeleide cellen van de stam. Martellucci, S., Manganelli V., Santacroce C. Santilli F. Piccoli L., Sorice M., Mattei V. Prion. 2018 Mar 4. Taylor & Francis Ltd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Amphotericin B solutionSigma-AldrichA2942Het wordt gebruikt om celkweekmedia aan te vullen, het is een polyeen antischimmel antibioticum van Streptomyce
Anti-B3tubulinCell Signaling Technology #4466Een van de zes B-tubuline-isovormen, het wordt sterk tot expressie gebracht tijdens de foetale en postnatale ontwikkeling, blijft hoog in het perifere zenuwstelsel
Anti-CD105 BD Biosciences611314Endoglin (CD105), een belangrijk glycoproteïne van menselijk vasculair endotheel, is een type I integraal membraaneiwit met een groot extracellulair gebied, een hydrofobe transmembraanregio en een kort cytoplasmatisch staartje
Anti-CD44MilliporeCBL154-20ulPositieve celmarkeringsantilichamen gericht tegen mesenchymale stamcellen
Anti-CD73 Cell Signaling Technology 13160CD73 is een glycosylfosfatidylinositol-geankerde, membraangebonden glycoproteïne van 70 kDa die de hydrolyse van extracellulaire nucleosidemonofosfaten in bioactieve nucleosiden katalyseert
Anti-CD90MilliporeCBL415-20ulPositieve celmarkeringsantilichamen gericht tegen mesenchymale stamcellen
Anti-GAP43 Cell Signaling Technology #8945Is een zenuwstelselspecifiek, groei-geassocieerd eiwit in groeikonen en gebieden met hoge plasticiteit
Anti-mouse PE Abcamab7003Is een antilichaam dat wordt gebruikt in flowcytometrie of FACS-analyse
Anti-NFH Cell Signaling Technology #2836Is een antilichaam dat endogene niveaus van totaal Neurofilament-H-eiwit detecteert
Anti-PrP mAb EP1802Y Abcamab52604Konijnenmonoklonaal [EP 1802Y] voor PrP-prion-eiwit
Anti-rabbit CY5 Abcamab6564Is een antilichaam dat wordt gebruikt in flowcytometrie of FACS-analyse
Anti-STRO 1MilliporeMAB4315-20ulPositieve celmarkeringsantilichamen gericht tegen mesenchymale stamcellen
B27 Supp XF CTSGibco by life technologiesA14867-01B-27  kan worden gebruikt om de inductie van humane neurale stamcellen (hNSCs) uit pluripotente stamcellen (PSCs), uitbreiding van hNSCs, differentiatie van hNSCs en onderhoud van volwassen gedifferentieerde neuronen in cultuur te ondersteunen
BD Accuri C6 flow cytometer BD BiosciencesAC6531180187Flowcytometer uitgerust met een blauwe laser (488 nm) en een rode laser (640 nm)
BD Accuri C6 Software BD BiosciencesBestuurt het BD Accuri C6 flowcytometersysteem om gegevens te verzamelen, statistieken te genereren en resultaten te analyseren
bFGFPeproThec, DBA100-18Bbasic Fibroblast Growth Factor 
Centrifuge CL30RTermo fisher Scientific11210908het is een apparaat dat wordt gebruikt voor de scheiding van vloeistoffen, gas of vloeistof, op basis van dichtheid
CO2 Incubator 3541Termo fisher Scientific317527-185het zorgt voor optimale en reproduceerbare groeiomstandigheden voor celculturen
Collagenase, type IV Life Technologies17104019Collagenase is een protease die de binding tussen een neutraal aminozuur (X) en glycine in de sequentie Pro-X-Glyc-Pro klieft, die met hoge frequentie in collageen wordt aangetroffen
Disposable scalpel Swann-Morton501Het wordt gebruikt om weefsels te snijden
DMEM-LEurocloneECM0060LDulbecco's Gemodificeerd Eagle's Medium Laag Glucose met L-Glutamine met Natrium Pyruvaat
EGFPeproThec, DBAAF-100-15Epidermale Groeifactor 
Fetal Bovine SerumGibco by life technologies10270-106FBS is een populair media-supplement omdat het een breed scala aan functies in celcultuur biedt. FBS levert voedingsstoffen, groei- en hechtingsfactoren en beschermt cellen tegen oxidatieve schade en apoptose door mechanismen die moeilijk te reproduceren zijn in serumvrije media (SFM) systemen
Filtropur BT50 0.2,500 mL Bottle top filterSarstedt831,823,101het is een apparaat dat wordt gebruikt voor het filteren van oplossingen
Flexitube GeneSolution for PRNPQiagenGS56214 siRNA's voor Entrez-gen 5621. Doelsequentie N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA  N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA  N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA  N.4  CAGTGACTATGAGGACCGTTA
Hank's solution 1xGibco by life technologies240200083De essentiële functie van Hanks' Balanced Salt-oplossing is om de pH en osmotische balans te handhaven. Het biedt ook water en essentiële anorganische ionen aan cellen
HiPerFect Transfection Reagent Qiagen301705HiPerFect Transfectiereagens is een unieke mix van cationische en neutrale lipiden die effectieve siRNA-opname en efficiënte afgifte van siRNA in cellen mogelijk maakt, resulterend in hoge gen-knockdown, zelfs bij gebruik van lage siRNA-concentraties
Neurobasal A Gibco by life technologies10888022Neurobasal-A Medium is een basaal medium dat is ontworpen voor langetermijnonderhoud en rijping van pure post-natale en volwassen hersenneuronen 
ParaformaldehydeSigma-Aldrich30525-89-4Paraformaldehyde is gebruikt voor het fixeren van cellen en weefselsecties tijdens kleuringsprocedures
penicillin/streptomycin EurocloneECB3001D Het wordt gebruikt om celkweekmedia aan te vullen om bacteriële besmetting te beheersen

Referenties

  1. Robey, P. G., Kuznetsov, S. A., Riminucci, M., Bianco, P. Bone marrow stromal cell assays: in vitro and in vivo. Methods in Molecular Biology. 1130, 279-293 (2014).
  2. Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418, 1-49 (2002).
  3. Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24, 1294-1301 (2006).
  4. Zannettino, A. C. W., et al. Multi-potential Human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. Journal of Cellular Physiology. 214, 413-421 (2008).
  5. Mattei, V., et al. Role of lipid rafts in neuronal differentiation of dental pulp-derived stem cells. Experimental Cell Research. 339, 231-240 (2015).
  6. Jansen, J., Hanks, S., Thompson, J. M., Dugan, M. J., Akard, L. P. Transplantation of hematopoietic stem cells from the peripheral blood. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 9 (1), 37-50 (2005).
  7. Young, F. I., et al. Clonal heterogeneity in the neuronal and glial differentiation of dental pulp stem/progenitor cells. Stem Cells International. 2016, 1290561(2016).
  8. Pisciotta, A., et al. Human dental pulp stem cells (hDPSCs): isolation, enrichment and comparative differentiation of two sub-populations. BMC Developmental Biology. 15, 14(2015).
  9. Atari, M., et al. Dental pulp of the third molar: a new source of pluripotent-like stem cells. Journal of Cell Science. 125, 3343-3356 (2012).
  10. Koyama, N., Okubo, Y., Nakao, K., Bessho, K. Evaluation of pluripotency in human dental pulp cells. Journal of oral and maxillofacial surgery: official journal of the American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 67, 501-506 (2009).
  11. Gronthos, S., et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. Journal of Dental Research. 81, 531-535 (2002).
  12. Arthur, A., Rychkov, G., Shi, S., Koblar, S. A., Gronthos, S. Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues. Stem Cells. 7, 1787-1795 (2008).
  13. Lee, Y. J., Baskakov, I. V. The cellular form of the prion protein is involved in controlling cell cycle dynamics, self-renewal, and the fate of human embryonic stem cell differentiation. Journal of Neurochemistry. 124, 310-322 (2013).
  14. Steele, A. D., Emsley, J. G., Ozdinler, P. H., Lindquist, S., Macklis, J. D. Prion protein (PrPc) positively regulates neural precursor proliferation during developmental and adult mammalian neurogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 3416-3421 (2006).
  15. Wulf, M. A., Senatore, A., Aguzzi, A. The biological function of the cellular prion protein: an update. BMC Biology. 15, 34(2017).
  16. Mattei, V., et al. Recruitment of cellular prion protein to mitochondrial raft-like microdomains contributes to apoptosis execution. Molecular Biology of the Cell. 22, 4842-4853 (2011).
  17. Linden, R. The Biological Function of the Prion Protein: A Cell Surface Scaffold of Signaling Modules. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 77(2017).
  18. Garofalo, T., et al. Role of mitochondrial raft-like microdomains in the regulation of cell apoptosis. Apoptosis. , 621-634 (2015).
  19. Watt, N. T., et al. Reactive oxygen species-mediated beta-cleavage of the prion protein in the cellular response to oxidative stress. The Journal of Biological Chemistry. 280, 35914-35921 (2005).
  20. Mattei, V., et al. Morphine Withdrawal Modifies Prion Protein Expression in Rat Hippocampus. PLoS One. 12, 0169571(2017).
  21. Hu, W., et al. Prion proteins: physiological functions and role in neurological disorders. Journal of the Neurological Sciences. 264, 1-8 (2008).
  22. Sorice, M., et al. Trafficking of PrPC to mitochondrial raft-like microdomains during cell apoptosis. Prion. 6, 354-358 (2012).
  23. Martellucci, S., et al. Role of Prion protein-EGFR multimolecular complex during neuronal differentiation of human dental pulp-derived stem cells. Prion. 12 (2), 117-126 (2018).
  24. Lee, Y. J., Baskokov, I. V. The cellular form of the prion protein guides the differentiation of human embryonic stem cell into neuron-, oligodendrocyte- and astrocyte-committed lineages. Prion. 8, 266-275 (2014).
  25. Huang, G. T., Sonoyama, W., Chen, J., Park, S. H. In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments. Cell and Tissue Research. 324, 225-236 (2006).
  26. Suchanek, J., et al. Dental pulp stem cells and their characterization. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacký. 153, Olomouc, Czechoslovakia. 31-35 (2009).
  27. Bressan, E., et al. Donor age-related biological properties of human dental pulp stem cells change in nanostructured scaffolds. PLoS One. 7 (11), 49146(2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Behandeling met collagenase IVflowcytometrie-analyseWestern blot-analyselosmaking met trypsine-EDTAEGF bFGF-stimulatiesiRNA PrP-silencingcelkweekpropagatie
Isolatie, vermeerdering en Prion eiwituitdrukking tijdens neuronale differentiatie van stamcellen van menselijke tandmerg
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.