Colorimetrische analyse van alkalische fosfatase activiteit in S. aureus Biofilm

Samenvatting

In dit manuscript opgericht wij een hoge doorvoersnelheid methode om te kwantificeren van alkalische fosfatase activiteit in S. aureus biofilm cultuur van weefselkweek 96-wells-plaat

Samenvatting

Alkalische fosfatase (ALP) is een gemeenschappelijk enzym uitgedrukt in zowel prokaryote en eukaryote cellen. Het katalyseert de hydrolyse van fosfaat monoesters uit veel moleculen met een pH van fundamentele en speelt een onmisbare rol in het metabolisme van fosfaat. Bij de mens is eukaryote ALP een van de meest gebruikte enzymatische signalen in de diagnose van verschillende ziektes zoals cholestase en rachitis. In S. aureus, ALP wordt gedetecteerd uitsluitend op de celmembraan; het wordt ook uitgedrukt als een secretoire vorm ook. Nog, er is weinig bekend over de functie bij de vorming van biofilms.

Het doel van dit manuscript is om een snelle en betrouwbare test voor het meten van de ALP activiteit in S. aureus biofilm die geen eiwit isolatie vereist. Met behulp van p-nitrofenyl fosfaat (pNPP) als substraat, we gemeten ALP activiteit in S. aureus biofilm gevormd in de weefselkweek 96-wells-platen. Activiteit is gebaseerd op de vorming van de oplosbare reactieproduct gemeten door absorptie van 405 nm. De aard van de hoge doorvoer van de methode van de plaat 96 goed weefselkweek biedt een gevoelige en reproduceerbare methode voor ALP activiteit testen. Hetzelfde experimentele instellen kan ook worden uitgebreid tot andere extracellulaire moleculaire merkers aan biofilm vorming gerelateerde meten.

Inleiding

Alkalische fosfatase (ALP) is overal uitgedrukt in zowel prokaryote en eukaryote cellen¹. Het kan het katalyseren van de hydrolyse van monofosfaat uit verschillende moleculen zoals nucleotiden, eiwitten, alkaloïden, fosfaatesters en afgeleide anhydriden van fosforzuur. Bij de mens is eukaryote ALP aanwezig in vele weefsels, waaronder bot, lever, darm en placenta². Het speelt een belangrijke rol in proteïne fosforylatie, celgroei, apoptosis, stamcel processen evenals normale skelet mineralisatie. Eukaryotische ALP is ook een belangrijke serum-indicator voor de aanwezigheid van ziekten in bot, lever en andere weefsels/organen wanneer verhoogde^3,4.

Prokaryote ALP is geconstateerd in een verscheidenheid van bacteriële cellen, met inbegrip van E. coli⁵, S. aureus^6,7 en sommige gemeenschappelijke pens bacteriën in de bodem-⁸. Bacteriële ALP activiteit is gebruikt als een biosensor in de detectie van bacteriële besmetting¹⁰, pesticiden en zware metalen⁹ . De constitutieve uitdrukking van ALP is gebruikt om te identificeren van de staphylococcen¹¹ en Serratia onderscheiden van Enterobacter¹². Verder wordt voorgesteld dat de constitutieve ALP productie is gecorreleerd met pathogeniteit in staphylokokken¹³. Hoewel ALP is onderzocht in verschillende instellingen,^3,4, is nog weinig gerapporteerd voor de activiteit en de functie in biofilms culturen.

Een biofilm heeft gedocumenteerd te hebben een verschillend functionerende bacteriële leven ten opzichte van haar free-living bacteriële cel tegenhanger¹⁴. In S. aureus, is de vorming van een biofilm geconstateerd in een verscheidenheid van klinische omstandigheden en rekeningen voor de resistentie tegen antibiotica en chronische ontsteking^15,16. Veel moleculen te vinden in een biofilm matrix zoals polysacchariden, eiwitten, nucleïnezuren en lipiden had gemeld, maar het mechanisme van biofilm vorming is niet volledig begrepen¹⁴. Om te begrijpen van de rol van ALP in biofilm vorming, we gekweekt van S. aureus biofilms in 96 goed weefselkweek platen en de activiteit van de ALP met behulp van para-nitrophenylphosphate (pNPP) gemeten.

De pNPP van het molecule is een kant-en-klare substraat voor ALP en is wijd verbeid gebruikt voor het meten van de ALP activiteit^6,17,18. Deze colorimetrische bepaling is gebaseerd op de omzetting van para-nitrofenyl fosfaat (pNPP) te para-nitrofenol, resulterend in een gekleurd product op 405 nm. Vergeleken met andere conventionele ALP assay, zoals agarose gel elektroforese¹⁹, tarwekiemen agglutinin (WGA) neerslag, en WGA-HPLC²⁰, deze test zeer specifiek is, zorgt gevoelig, gemakkelijk te reproduceren, en de meeste bovenal voor hoge doorvoer.

Protocol

1. middelgrote voorbereiding

1. 1 L van al soja Bouillon (TSB) bereiden: in 1 L gedestilleerd water, voeg 15 g van alvleesklier digest van caseïne, 5 g van papaic digest van sojameel, 3 g natriumchloride, 2,5 g dextrose, en 2,5 g van dikaliumhexafluorozirkonaat fosfaat. Steriliseren vóór gebruik.
2. Voor al soja Agar (TSA), 15 gram agar toevoegen aan 1 L van TSB, autoclaaf. Vervolgens laten afkoelen tot kamertemperatuur. Vervolgens giet in een verhouding van 20 mL per petrischaal (100 mm x 15 mm).
3. Biofilm kweekmedium: Voeg 10 g glucose tot 1 L van gesteriliseerde met autoclaaf TSB. Steriliseren door filtratie met behulp van een 0,2 µm filter.

2. S. aureus Biofilm vorming in 96 goed weefselkweek plaat

Opmerking: De biofilm van S. aureus is gekweekt als eerder beschreven^6,21.

1. Een individuele kolonie van S. aureus van TSA in TSB 10 mL beënten en 's nachts groeien bij 37 ° C.
2. Verdun de overnachting cultuur in 10 mL TSB/glucose (10 g/L) bij een verhouding van 1:100 (v/v). Vortex voorzichtig te mengen voor een consistente concentratie.
3. Breng 200 mL verdunde cultuur in een totaal van 18 putten (meer voor experimentele groepen, deze een controle van de niet-biofilm te suggereren een relatie met ALP activiteit⁶) van één 96 goed plaat. Drieling gebruiken voor elk punt van de tijd: 0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min en 75 min. Zie stap 3.2.
4. Incubeer de 96 goed plaat bij 37 ° C gedurende 24 uur voor de biofilm vorming^6,21.
5. De bovendrijvende vloeistof decanteren door aspiratie.
6. Wassen elk goed met 1 x fosfaatgebufferde oplossing (PBS, pH 7.4), gedurende 5 min bij 15.000 x g centrifugeren en de bovendrijvende vloeistof decanteren door aspiratie.

3. meting van de ALP activiteit in S. aureus Biofilm

Opmerking: ALP activiteit werd gemeten als beschreven^6,18.

1. Voeg 75 mL gebufferde ALP substraat verkrijgbare pNPP uit aan elk putje van stap 2.6 en beginnen met het opnemen van de tijd. Elk punt van de tijd opnemen in drievoud.
2. Na incubatie gedurende een gevarieerd tijd: 0 min (control), 15 min, 30 min, 45 min, 60 min en 75 min respectievelijk 75 µL van 5 M NaOH om te stoppen met de reactie toevoegen.
3. De plaat gedurende 5 minuten bij 15.000 x gcentrifugeren.
4. Pipetteer 100 µL van de bovendrijvende substantie in een nieuwe 96 goed plaat voor colorimetrische meting.
5. Meet de extinctie van elke goed bij het gebruiken van 405 nm plaat een 96 goed lezer. Gebruik 0 min tijd wijs wells controle voor achtergrondruis van 405 nm.
6. Herhaal het hele experiment in drie afzonderlijke 96 goed platen.

Resultaten

Figuur 1 toont een representatief resultaat van ALP activiteit van biofilm culturen van S. aureus in 96 goed weefselkweek platen. 75 μL van verkrijgbare pNPP oplossing was toegevoegd aan elk goed en bebroede bij kamertemperatuur. Na incubatie gedurende verschillende tijden (0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min en 75 min, respectievelijk) 75 μL van 5 M NaOH toevoegde aan zet de reactie stop. Het product werd vervolgens gemeten in een 96 goed afleesap...

Discussie

In onze assay gebruikten we pNPP als de ALP substraat. Dit is een werkende oplossing ontworpen voor ELISA en niet te worden verdund. Na hydrolyse door ALP, een gele product ontwikkelt en kan worden gemeten op 405 nm. Aan het einde van de enzymatische reactie, we kort de 96 goed plaat gecentrifugeerd en het supernatant overgebracht naar een verse 96 goed plaat voor het meten van de absorptie met behulp van de-afleesapparaat. We vonden dat deze extra centrifugeren stap is van cruciaal belang, aangezien hierdoor de samenhan...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Agar	VWR	9002-18-0
Eppendorf Centrifuge	Thomas Scientific	5810
Gluose	VWR	50-99-7
NaOH pellets	VWR	SS0550-500GR
Para-nitrofenylfosfaat (pNPP)	Sigma	P7998-100ML	Typische concentraties van vloeibare pNPP-substraten, vaak gebruikt in enzymgekoppelde immunosorptietests (ELISA), variëren tussen 10 tot 50 mM. Net als bij de meeste kant-en-klare vloeibare pNPP-substraten, zoals degene die hier wordt gebruikt, wordt de exacte pNPP-concentratie niet bekendgemaakt vanwege de bedrijfsgeheimen.
10x PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4	Sigma	P3288-1VL
Plate Reader	Biotek	ELx808
S. aureus	ATCC	ATCC25923
Tryptic Soy Agar       15 g/L TSB	VWR	9002-18-0
Tryptic Soy Broth:      g/L Pancreatische digestie van Caseïne............ 15.0 Papaïne digestie van sojameel.........5.00 Natriumchloride.............................. 3.00 Destrose........................................  2.50 Dikaliumfosfaat..................2.50	VWR	90006-098
96 wells tissuecultuur platen	BD	6902D09	U gevormde bodem